專利名稱：一種產(chǎn)減毒類脂a的大腸桿菌基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)減毒類脂A的大腸桿菌基因工程菌，特別是一種無需誘導直接生產(chǎn)減毒類脂A的大腸桿菌。
背景技術(shù)：
類脂A可以被宿主細胞表面的Toll樣受體4 (Toll Like Receptor 4，TLR-4)識別，繼而引發(fā)細胞內(nèi)一系列的生理生化反應(yīng)，產(chǎn)生TNF-α、IL-6、IL_8等多種炎性細胞因子。細胞因子的種類和數(shù)量主要取決于類脂A的結(jié)構(gòu)，因此，某些特殊結(jié)構(gòu)的類脂A可作為疫苗佐劑，非特異性的增強機體對抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)，提高疫苗效率。鋁佐劑是目前全球公認的廣泛應(yīng)用于人體的疫苗佐劑，安全可靠，可顯著增強體液免疫反應(yīng)，但是對細胞免疫 的效果不夠理想。因此，人們致力于開發(fā)更加高效安全的疫苗佐劑。MP! ”是由Corixa公司商業(yè)化生產(chǎn)的已應(yīng)用于臨床試驗的脂質(zhì)體佐劑，人類臨床試驗的不良反應(yīng)頻率與鋁佐劑一樣低，其炎癥毒性是LPS的O. 1%。其他醫(yī)藥公司近年來也爭相開發(fā)減毒的類脂A分子疫苗佐齊U，Avand”公司生產(chǎn)了一種減毒的脂質(zhì)體佐劑產(chǎn)品LipidA-Purified (699200P)，是5條脂肪酸鏈(3 ’位無次級脂肪酸鏈)的單磷酸類脂A結(jié)構(gòu)，其生產(chǎn)方法是從沙門氏菌Salmonel IaMinnesota R595中提取脂多糖，再進行一系列水解、層析、純化等過程。該生產(chǎn)方法的缺點在于第一、沙門氏菌是致病菌，操作起來比較困難；第二、該方法涉及到化學處理，步驟繁多，影響產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新型的產(chǎn)減毒類脂A的基因工程菌，其生產(chǎn)過程中不涉及致病菌，并且無需誘導劑，可用于減毒類脂A的大規(guī)模生產(chǎn)。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的基因工程菌為E. coli W3110 Λ IacI Δ IpxMIacZ: :FnlpxE，其基因組中l(wèi)acl、IpxM發(fā)生缺失突變失活，IacZ基因內(nèi)部敲入表達FnlpxE基因。類脂A自細胞內(nèi)膜內(nèi)側(cè)開始合成，合成途徑比較保守，但在轉(zhuǎn)運到外膜外側(cè)的過程中可以發(fā)生多種修飾，以適應(yīng)外界環(huán)境。目前，與類脂A結(jié)構(gòu)修飾有關(guān)的基因及類脂A合成相關(guān)基因已有報道。利用這些基因，根據(jù)類脂A分子的合成及修飾機理，通過基因工程技術(shù)將大腸桿菌中類脂A的結(jié)構(gòu)改造成為5條脂肪酸鏈單磷酸類脂A結(jié)構(gòu)。具體方法是在野生型大腸桿菌染色體IacZ位點處敲入表達IpxE基因。IpxE來源于弗朗西斯菌，其編碼的蛋白質(zhì)可以水解類脂A分子I位上的磷酸；同時敲除染色體上的IpxM基因，其編碼的蛋白質(zhì)可以在類脂A分子3’位添加十四碳羥基脂肪酸鏈。為使外源基因在大腸桿菌中組成型表達，敲除染色體上的IacI基因，IacI基因編碼Iac操縱子中的調(diào)節(jié)蛋白，敲除該基因可以解除調(diào)節(jié)蛋白的阻遏作用。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種利用所述基因工程菌生產(chǎn)減毒類脂A的方法。其中發(fā)酵方法為常規(guī)發(fā)酵方法，減毒類脂A的提取方法為將過夜培養(yǎng)的菌液按初始OD6tltl=O. 02轉(zhuǎn)接到200mL LB液體培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)至OD6tltl=I時8000rpm離心IOmin收集菌體，ddH20洗漆菌體一次后用Bligh-Dyer —相體系(氯仿/甲醇/水，1:2:0. 8, v/v/v)懸浮菌體，磁力攪拌lh,2000rpm離心20min分相,使用一相體系洗漆細胞碎片2_3次；加入27mL12. 5mM的醋酸鈉(PH4. 5)溶液，超聲震蕩10min，100° C水浴30min裂解糖鏈。冷至室溫后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成Bligh-Dyer 二相體系(氯仿/甲醇/水,2:2:1. 8, v/v/v),2000rpm離心IOmin,取下相移入旋蒸瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；最后加入氯仿/甲醇溶液(4:1,v/v)將類脂A洗出。類脂A的檢測、分析薄層層析(TLC)檢測將樣品點于Gel 60TLC板上，展層劑為氯仿/甲醇/水/氨水(40:25:4:2，v/v/v/v)。層析結(jié)束后吹干板上殘留的展層劑，用溶于乙醇的10%硫酸進行碳化，置于加熱板上顯色。
ESI/MS分析類脂樣品溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，在WATERS SYNAPTQ-TOF MassSpectrometer質(zhì)譜儀上進行質(zhì)譜檢測。采用ESI離子源，陰離子檢測模式，檢測范圍小于m/z2500。


圖1野生型大腸桿菌與基因工程菌類脂A TLC分析1:W3110類脂A樣品；2:突變株HW003類脂A樣品圖2基因工程菌類脂AESI/MS分析A:W3110類脂A樣品；B:突變株HW003類脂A樣品圖3野生型大腸桿菌與基因工程菌脂多糖刺激小鼠巨噬細胞RAW264. 7產(chǎn)生IL_6的分析
具體實施例方式實施例1突變株E. coli W3110 Δ IacI的構(gòu)建UlacI基因敲除片段的獲得采用化學全合成或PCR分步擴增的方法獲得IacI基因敲除片段，其兩端為IacI基因上下游同源臂、中間為kan片段。IacI基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。將IacI基因敲除片段克隆到pBlueScript II SK(+)，獲得重組質(zhì)粒 pBlueScript II SK(+)-1acI (U)-pkan-lacl (D)。其中，kan 基因兩側(cè)帶有 IoxP位點。2、敲除感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化接種帶有Red 重組輔助質(zhì)粒 pKD46 (Datsenko K A, Wanner B L. One-Stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A, 2000，97 (12) :6640-6645)的大腸桿菌 W3110 (ATCC39936)于含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，30° C，200rpm過夜培養(yǎng)。按2%接種量轉(zhuǎn)接IOOmL LB液體培養(yǎng)基，30° C，200rpm培養(yǎng)至OD6tltl=O. 2時加入L-阿拉伯糖(終濃度為30mmol/L)誘導重組酶的表達，繼續(xù)培養(yǎng)至OD6tltl=O. 5，將培養(yǎng)液冰浴半小時后轉(zhuǎn)入預(yù)冷的50mL離心管中，4° C，8000rpm離心IOmin收集菌體，沉淀用預(yù)冷的10%甘油洗滌3次，最后用ImL 10%甘油懸浮,每管80 μ L分裝至預(yù)冷的無菌EP管中。
將500_1000ng IacI敲除片段加入感受態(tài)細胞中，混勻，冰浴15min，1. 5kv電擊5ms, 30° C孵育2h，涂布30 μ g/mL卡那霉素的LB固體平板，30° C培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子于含30 μ g/mL卡那霉素及100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，PCR驗證結(jié)果。3、溫敏型表達載體pCRE的構(gòu)建根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中 pSH47(Guldener U, Heck S，F(xiàn)ielder T,BeinhauerJ, Hegemann JH. A new effcient gene disruption cassette for repeated use inbudding yeast. Nucleic Acids Res, 1996，24:2519-2524)載體序列，米用化學全合成或PCR方法獲得ere基因克隆到pKD46質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，涂布100 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體平板，30° C過夜培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒酶切驗證，得到Cre重組酶溫敏型表達載體，并命名為pCRE。
4、突變株抗性標記的去除將PCR驗證陽性的菌株接種含30 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，42° C過夜培養(yǎng)，將培養(yǎng)液劃線30 μ g/mL卡那霉素的LB固體平板，37 ° C培養(yǎng)，挑取單菌落驗證其對氨芐青霉素的敏感性，將含有卡那霉素抗性并對氨芐青霉素敏感的菌株命名為W3110Iac1: :kan并保藏。以此為出發(fā)菌株做感受態(tài)，轉(zhuǎn)入帶有重組酶Cre的溫敏型表達載體PCRE,將陽性菌株于含100 μ g/mL氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),加入L-阿拉伯糖(終濃度為30mmol/L)誘導Cre重組酶的表達，介導IoxP位點特異性重組，PCR驗證挑選轉(zhuǎn)化子。將PCR驗證正確的菌株42° C熱激后劃線LB平板，挑取單菌落驗證其對氨芐青霉素及卡那霉素的敏感性，選取對兩種抗生素均敏感的菌株命名為W3110 Δ IacI并保藏。實施例2 突變菌株 E. coli W3110 Δ IacI IacZ: :FnlpxE 的構(gòu)建1、敲入片段FnlpxE-Fkan的獲得根據(jù)pWSK29-FnlpxE_Fkan (Jiuzhou Chen et al. 2010)序列，人工合成或 PCR 擴增帶有l(wèi)acZ-α天然同源臂的敲入片段FnlpxE-Fkan,其核苷酸序列如SEQ ΙΝΝ0. 2所示。其中，kan基因兩側(cè)帶有FRT位點。2、敲入感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化以帶有pKD46質(zhì)粒的W3110 Δ IacI菌株作為出發(fā)菌株，制備感受態(tài)，方法同前。將500-1000ngFnlpxE_Fkan敲入片段電轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞中，通過kan抗性篩選獲得染色體IacZ 基因內(nèi)部敲入表達 FnlpxE-Fkan 的突變株 W3110 Δ IacIlacZ: :FnlpxE_Fkan。3、突變株抗性標記的去除通過轉(zhuǎn)入pCP20 質(zhì)粒(Cherepanov P P, Wackernagel ff. Gene disruptionin Escherichia col1:TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzedexcision of the antibiotic-resistance determinant. Gene, 1995, 158(1):9-14),42° C熱激表達FLP酶，介導FRT位點的特異性重組即可去除kan抗性標記，篩選方法同前，得到的突變株命名為E. coli W3110 Δ IacIlacZ: :FnlpxE并保藏。 實施例3突變株HW003的構(gòu)建1、IpxM基因敲除片段的獲得采用化學全合成或PCR分步擴增的方法獲得IpxM基因敲除片段，其兩端為IpxM基因上下游同源臂、中間為kan片段。IpxM基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。將IpxM基因敲除片段通過HindIII和SacI克隆到pBlueScript II SK(+)多克隆位點，獲得重組質(zhì)粒 pBlueScript II SK (+) -1pxM (U) -pkan-lpxM (D) 其中，kan 基因兩側(cè)帶有 IoxpLE/IoxpRE 位點。2、敲除感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化以帶有pKD46質(zhì)粒的E. coli W3110A IacI IacZ: =FnlpxE菌株作為出發(fā)菌株，制備感受態(tài)，方法同前。將500-1000ng IpxM敲除片段電轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞中，通過kan抗性篩選獲得突變菌株 E. coli W3110 Δ IacI IacZ: :FnlpxE IpxM: :Pkan。3、突變株抗性標記的去除轉(zhuǎn)入溫敏型表達載體pCRE，加入L-阿拉伯糖(終濃度為30mmol/L)誘導Cre重組酶的表達，介導IoxP位點特異性重組，可去除kan抗性標記，篩選方法同前，得到的突變株命名為HW003并保藏。 實施例4突變菌株HW003的類脂A結(jié)構(gòu)分析1、突變菌株HW003的類脂A提取及薄層層析(TLC)分析類脂A的提取采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法。將過夜培養(yǎng)的菌液按初始OD600=O. 02轉(zhuǎn)接到200mL LB液體培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)至0D_=1時8000rpm離心IOmin收集菌體，ddH20洗漆菌體一次后用Bligh-Dyer —相體系(氯仿/甲醇/水，1:2:0. 8, v/v/v)懸浮菌體，磁力攪拌lh, 2000rpm離心20min分相,使用一相體系洗漆細胞碎片2_3次。加入27mL 12. 5mM的醋酸鈉(PH4. 5)溶液，超聲震蕩lOmin，100° C水浴30min裂解糖鏈。冷至室溫后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成Bligh-Dyer 二相體系(氯仿/甲醇/水,2:2:1. 8,v/v/v), 2000rpm離心IOmin,取下相移入旋蒸瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。加入氯仿/甲醇溶液(4:1,v/v)將類脂A洗出。接著進行薄層層析(TLC)檢測，將樣品點于Gel 60TLC板上，展層劑為氯仿/甲醇/水/氨水(40:25:4:2，v/v/v/v)。層析結(jié)束后吹干板上殘留的展層劑，用溶于乙醇的10%硫酸進行碳化，置于加熱板上顯色(圖1)。TLC結(jié)果顯示野生型大腸桿菌類脂A (泳道I)結(jié)構(gòu)比較單一，為雙磷酸形式，突變株HW003的類脂A (泳道2)結(jié)構(gòu)也非常單一，為5條脂肪酸鏈單磷酸形式，說明突變菌株可以產(chǎn)生單一結(jié)構(gòu)的減毒類脂A。2、類脂A結(jié)構(gòu)的ESI/MS分析類脂樣品溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，在WATERS SYNAPT Q-TOF MassSpectrometer質(zhì)譜儀上進行質(zhì)譜檢測。采用ESI離子源，陰離子檢測模式，檢測范圍小于m/z 2500(圖2)。野生型大腸桿菌類脂A結(jié)構(gòu)為雙磷酸形式，m/z值為1797.2，提取過程中會造成少量I位磷酸基團丟失；減毒類脂A結(jié)構(gòu)是3’位無次級脂肪酸鏈的單磷酸類脂A，m/z值為1507. 1,MS結(jié)果顯示突變株HW003可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)非常單一的類脂A。實施例5突變菌株HW003脂多糖(LPS)毒性分析1、突變菌株HW003LPS的提取及純化LPS的提取采用熱酚法。將過夜培養(yǎng)的菌液按初始OD6tltl=O. 02轉(zhuǎn)接到800mL LB液體培養(yǎng)基中，37° C培養(yǎng)12小時后8000rpm離心IOmin收集菌體，ddH20洗滌菌體一次后稱量菌體濕重，每3g濕菌體溶于IOmL ddH20中，68°C預(yù)熱。加入等體積預(yù)熱的90%苯酚，68°C劇烈振蕩I小時。低溫冷卻后，4°C, 4000rpm離心20分鐘,上清液用ddH20透析三天以去除苯酚，真空冷凍干燥得到LPS粗品。粗品用適量ddH20重懸后，加入RNase A(終濃度50 μ g/ml ^PDNase I (終濃度100 μ g/ml)37°C處理2小時，再加入蛋白酶K (終濃度100 μ g/ml)37°C處理過夜。酶處理后的樣品中加入5mL水飽和苯酚，混勻，4000rpm離心30分鐘，上清液用ddH20透析一天，真空冷凍干燥得到LPS。將LPS復(fù)溶到氯仿/甲醇溶液(2:1，v/v),渦旋振蕩30秒，12000rpm離心10分鐘，移除上清，沉淀復(fù)溶在水中，真空冷凍干燥得到LPS純品。2、LPS刺激小鼠巨噬細胞白血病細胞RAW264. 7后產(chǎn)生白介素-6 (IL_6)的分析RAW264. 7接種于96孔板，每孔105個細胞，37°C，5%C02培養(yǎng)12小時后，細胞貼壁，換新鮮培養(yǎng)液，加入不同濃度LPS (終濃度分別為10、100、1000ng/ml)，刺激24小時后取上清液，使用ELISA試劑盒(eBioscience，88-7064)檢測IL-6含量(圖3)。野生型大腸桿菌W3110和突變菌株HW003利用最小顯著差法進行了差異分析，**P〈0. 01。由于突變菌株類脂A結(jié)構(gòu)的改變，包括I位磷酸基團和3’位次級脂肪酸鏈的缺失，使得RAW264. 7細胞產(chǎn)生的IL-6顯著下降，削弱了炎癥反應(yīng)，因此，突變菌株HW003產(chǎn)生的類脂A結(jié)構(gòu)具有減毒的效果，可應(yīng)用于后續(xù)疫苗佐劑的開發(fā)。
本發(fā)明構(gòu)建的菌株避免了使用致病菌生產(chǎn)類脂A，同時保持了類脂結(jié)構(gòu)的單一，更有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)減毒類脂A的大腸桿菌基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌lacl、IpxM 發(fā)生缺失突變失活，IacZ基因內(nèi)部敲入表達FnlpxE基因，所述減毒類脂A為5條脂肪酸鏈的單磷酸類脂A結(jié)構(gòu)。
2.權(quán)利要求1所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟O將人工構(gòu)建的IacI敲除片段轉(zhuǎn)化E. coli W3110,獲得突變株E. coli W31 IOlac1: :Pkan，通過位點特異性重組去除卡那霉素抗性基因；2)FnlpxE-Fkan片段電轉(zhuǎn)入步驟I)制備的E.coli W3110 Δ IacI感受態(tài)細胞中，獲得 E. coliff3110 Δ lacl IacZ: :FnlpxE_Fkan,再次通過位點的特異性重組去除其中的卡那霉素抗性基因。3)將人工構(gòu)建的IpxM敲除片段電轉(zhuǎn)入步驟2)制備的E.coli W3110 Δ IacIlacZ: :FnlpxE感受態(tài)細胞中,獲得突變株E. coli W3110 Δ IacIlacZ: :FnlpxE lpxM: :Pkan，再次通過位點的特異性重組去除其中的卡那霉素抗性基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述IacI敲除片段的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述IpxM敲除片段的核苷酸序列如SEQID NO. 3所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述FnlpxE-Fkan片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
6.權(quán)利要求2-5任一所述的方法，其特征在于步驟I)步驟3)所述的位點特異性重組為Cre酶介導的IoxP位點特異性重組。
7.權(quán)利要求2-5任一所述的方法，其特征在于步驟2)所述的位點特異性重組為FLP酶介導的FRT位點特異性重組。
8.權(quán)利要求1所述基因工程菌應(yīng)用于減毒類脂A的生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)減毒類脂A的大腸桿菌基因工程菌，其lacI、lpxM發(fā)生缺失突變失活，lacZ基因內(nèi)部敲入表達FnlpxE基因，所述減毒類脂A為5條脂肪酸鏈的單磷酸類脂A結(jié)構(gòu)。本發(fā)明構(gòu)建的菌株在保持類脂降低了生產(chǎn)成本，其生產(chǎn)過程中不涉及致病菌，并且無需誘導劑，可用于減毒類脂A的大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12P9/00GK102994436SQ20121042143
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月29日
發(fā)明者王小元, 韓雅寧, 陳久洲, 李燁 申請人:江南大學