專利名稱：：一種陰溝腸桿菌和其富硒多糖及富硒多糖的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物學(xué)及生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別設(shè)計(jì)一種通過細(xì)菌耐硒馴化、富硒研究及富硒多糖提取純化過程的研究，制備并應(yīng)用具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)功能的陰溝腸桿菌Z0206細(xì)菌活性富硒多糖的方法。
背景技術(shù)：
：硒作為一種重要的微量元素，越來越受到科學(xué)界的重視。研究表明，硒具有提高機(jī)體免疫力、抗氧化、解毒、抑制腫瘤、預(yù)防心血管疾病發(fā)生等功能。無機(jī)硒化合物毒性遠(yuǎn)高于有機(jī)硒化合物，且生物利用率低。只有將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，才具有食用和保健價(jià)值。硒的生物有機(jī)化主要是通過動(dòng)物、植物、微生物轉(zhuǎn)化無機(jī)硒生產(chǎn)有機(jī)硒。通過生物進(jìn)行硒的有機(jī)化不僅可以為人類提供富含有機(jī)硒的食品及保健品，而且又可以為畜牧業(yè)生產(chǎn)提供富含有機(jī)硒的添加劑，是一個(gè)極具有廣闊前景的方法。部分可以進(jìn)行硒有機(jī)化的微生物分泌的多糖具有免疫增強(qiáng)活性，表現(xiàn)出對宿主免疫的介導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用，通過刺激免疫細(xì)胞的成熟、分化和增殖，改善宿主機(jī)體平衡，達(dá)到恢復(fù)和提高宿主細(xì)胞對淋巴因子、激素及其他生理因子的反應(yīng)性。以此為基礎(chǔ)，這些多糖表現(xiàn)出與免疫力相關(guān)的多種活性功能，如抗腫瘤、降血糖、抗衰老、促進(jìn)肝臟和骨髓細(xì)胞的蛋白質(zhì)和核酸的合成、抗炎及抗輻射作用等。近年來，我們通過多次篩選、純化，從肉靈芝(陜西)上分離得到了一株胞外多糖高產(chǎn)細(xì)菌菌株陰溝腸桿菌Z0206。所謂肉靈芝，在民間被稱之為"太歲",據(jù)《本草綱目》記載，肉靈芝為本草上品，它是在我國發(fā)現(xiàn)的一種天然珍稀物種，即被我國科學(xué)界早已認(rèn)定的一種原生質(zhì)生命體，確切定名應(yīng)為"特大型粘菌復(fù)合體"。初步研究表明，菌株陰溝腸桿菌Z0206對硒有較高的耐受能力，在無機(jī)硒培養(yǎng)基上生長可以將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，與其分泌的多糖結(jié)合，以分泌的形式到達(dá)胞外，具有產(chǎn)量極高的特點(diǎn)，并且這種細(xì)菌活性富硒多糖還具有一定的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性。這種細(xì)菌活性富硒多糖在生物保健品及添加劑生產(chǎn)和開發(fā)上有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。通過細(xì)菌的富硒培養(yǎng)，生產(chǎn)細(xì)菌活性富硒多糖作為天然保健生物制劑，符合保健品開發(fā)及綠色飼料添加劑的發(fā)展要求，具有重要的社會現(xiàn)實(shí)意義和生態(tài)意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一種陰溝腸桿菌Z0206，己于2007年12月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號CGMCCNO:2279。分類命名陰溝腸桿菌Enterobactercloacae。一種陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法，依次包括以下歩驟(1)陰溝腸桿菌Z0206耐硒能力馴化挑取陰溝腸桿菌Z0206菌種，先后涂布于含硒量為10、20、30、40、50pg/mL的PDA加富培養(yǎng)基平板上，進(jìn)行硒濃度梯度馴化。每個(gè)梯度于2832"培養(yǎng)2436h。最后從含硒量50pg/mL的PDA加富培養(yǎng)基平板上挑取生長良好的菌落于平板上劃線分離，純化后斜面保存。(2)陰溝腸桿菌Z0206富硒研究通過測定細(xì)菌的生長曲線，確定最佳加硒時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間。從斜面上挑取耐硒馴化后的菌種，接種于含硒量分別為10、15、20、25、30、35pg/mL的PDA加富培養(yǎng)基上，2832。C培養(yǎng)24-48h，觀察菌體顏色變化確定最佳硒濃度。為避免過多的無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為單質(zhì)硒，提高有機(jī)硒轉(zhuǎn)化效率，選取培養(yǎng)基上菌體顏色略紅、生長良好的硒濃度作為最佳硒濃度。從斜面上挑取耐硒馴化后的菌種，PDA培養(yǎng)基平板活化培養(yǎng)2436h后，接種于裝有PDA培養(yǎng)基的三角瓶中。2832t:振蕩培養(yǎng)，每隔lh無菌取出lmL培養(yǎng)液，用分光光度計(jì)檢測580nm處的吸光度值。繪制細(xì)菌的生長曲線。通過生長曲線確定加硒時(shí)間及培養(yǎng)時(shí)間。(3)將耐硒馴化后的陰溝腸桿菌Z0206菌種，接種至PDA加富液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，28"C32'C往復(fù)振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間18h20h，得到發(fā)酵罐發(fā)酵種子液，發(fā)酵罐內(nèi)加入70%發(fā)酵培養(yǎng)基，12rC蒸汽滅菌20min，接種種子液，培養(yǎng)13h時(shí)加入無菌亞硒酸鈉溶液，使培養(yǎng)基最終含硒量為25嗎/mL，發(fā)酵時(shí)間48h72h，得到含有陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖的發(fā)酵液；(4)發(fā)酵液于60。C70。C濃縮至原體積的1/10,再80。C90。C水浴lh1.5h，5000rpm離心10min15min，收集上清液，加入35倍體積預(yù)冷的95%乙醇，4。C靜置12h后，5000rpm離心10min15min,沉淀再依次用無水乙醇、丙酮和無水乙醚洗滌，離心，沉淀真空干燥，即得到富硒粗多糖粉末；(5)蛋白酶處理將步驟(4)得到的富硒粗多糖溶解于20倍體積的熱的蒸餾水中，用Na2C03調(diào)pH至7.09.0，加入0.25%1%胰蛋白酶(w/v)，55°C水解12h后，用草酸調(diào)pH至5.05.7，然后加入0.25。/。iy。木瓜蛋白酶(w/v)，65。C70。C水解2h3h后，于100。C水浴加熱56min，以終止酶反應(yīng)；(6)三氯乙酸法脫蛋白取步驟(5)后得到的蛋白酶處理液，用草酸調(diào)pH值至7.0，加入2°/。4°/。三氯乙酸(w/v)，室溫下磁力攪拌lh后，11000rpm離心1015min，取上清；(7)Sevag法脫蛋白向步驟(6)取得的上清液中加入1/3體積的Sevag試劑，充分振蕩，混合2030min，充分靜置分層，4000rpm離心5min，重復(fù)操作數(shù)次至兩相界面不再出現(xiàn)蛋白沉淀；然后用35倍體積預(yù)冷的95%乙醇醇析，所得的沉淀再依次用無水乙醇、丙酮和無水乙醚洗滌兩次，真空干燥，得到脫蛋白富硒多糖；(8)脫色將經(jīng)步驟(7)脫蛋白后的富硒多糖配成0.5%溶液，用氨水調(diào)pH至8.0，在50°(3下滴加20%的11202，至溶液為淡黃色，保溫2h，然后用稀鹽酸中和至7.0;自來水透析23d，蒸餾水透析23d后，加入35倍體積預(yù)冷的95%乙醇沉淀，fC靜置12h后，5000rpm離心10min15min，沉淀真空干燥，得富硒多糖精品。所述步驟(1)、(2)或(3)中，PDA加富培養(yǎng)基的配方為馬鈴薯20%，蛋白胨0.20.5%,酵母浸膏0.3%，葡萄糖2%，瓊脂粉1.6%，121。C滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蔗糖2.5%，酵母浸膏0.5%，蛋白胨0.5%，K2HPO40.2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%。所述步驟(3)中，搖瓶發(fā)酵條件為接種量35環(huán)，往復(fù)振蕩沖程410cm，振蕩頻率200250rpm。所述步驟(3)中，發(fā)酵罐發(fā)酵條件為接種量3%，pH為7.0，溫度3(TC，通氣量為0.250.75vvm，機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速200300rpm，每12h向發(fā)酵罐補(bǔ)充1%3%的葡萄糖。所述步驟(6)中的Sevag試劑的配方為，氯仿和正丁醇的體積比為4:1。一種陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖在制備增強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能和免疫調(diào)節(jié)功能的保健品或添加劑中的應(yīng)用。一種陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖在制備抗腫瘤藥物和抗病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)采用苯酚-硫酸法、凱氏定氮法、熒光分光光度法測定陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖中多糖、蛋白質(zhì)和硒含量。測定結(jié)果顯示富硒粗多糖中多糖、蛋白質(zhì)以及硒含量分別為69.40%、25.68%及65.70mg/kg;富硒多糖精品中多糖、蛋白質(zhì)以及硒含量分別為99.97%、0.03。/。及35.56mg/kg。結(jié)果表明，上述提取富硒多糖的生產(chǎn)過程簡單，產(chǎn)品產(chǎn)量和純度較高，富硒程度較高。(2)通過本方法制備的陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖可顯著提高免疫低下小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力以及細(xì)胞因子水平，對免疫低下小鼠的免疫功能具有顯著的調(diào)節(jié)作用。(3)通過本方法制備的陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖可以顯著提高抗氧化酶活性，增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)的功能，對H202引起的RAW264.7細(xì)胞的氧化損傷具有明顯的保護(hù)作用，是一種有效的抗氧化劑。圖l，為本發(fā)明實(shí)施例中陰溝腸桿菌Z0206生長曲線。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明實(shí)施例1、陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法(1)陰溝腸桿菌Z0206耐硒能力馴化PDA加富培養(yǎng)基配方如下馬鈴薯20%，蛋白胨0.3%，酵母浸膏0.3%，葡萄糖2%，瓊脂粉1.6%。挑取陰溝腸桿菌Z0206菌種，先后涂布于含硒量為10、20、30、40、50pg/mL的PDA加富培養(yǎng)基平板上，進(jìn)行硒濃度梯度馴化。每個(gè)梯度于32t培養(yǎng)36h。最后從含硒量50pg/mL的PDA加富培養(yǎng)基平板上挑取生長良好的菌落于平板上劃線分離，純化后斜面保存。(2)陰溝腸桿菌Z0206富硒研究從斜面上挑取已經(jīng)馴化好的耐硒菌種，接種于含硒量分別為10、15、20、25、30、35pg/mL的PDA加富培養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)36h,觀察菌體顏色變化確定最佳硒濃度。結(jié)果顯示，隨著固體培養(yǎng)基中硒濃度的增加，菌體逐漸變紅。30、35ng/ml時(shí)紅色較深，25|ig/ml時(shí)略呈紅色并且菌生長較好。為避免過多的無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為單質(zhì)硒，提高有機(jī)硒轉(zhuǎn)化效率，確定25pg/ml為最佳硒濃度。通過測定耐硒菌株的生長曲線，確定最佳加硒時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間。從斜面上挑取馴化好的耐硒菌株，PDA培養(yǎng)基平板活化培養(yǎng)12h后，接種于裝有100mLPDA培養(yǎng)基的三角瓶中。放置于搖床中3(TC振蕩培養(yǎng)，每隔lh在無菌室從中取出lmL培養(yǎng)液，用分光光度計(jì)測定580nm下的吸光值。確定耐硒菌的生長曲線(圖1)。參考圖l:陰溝腸桿菌Z0206在4h-15h處于對數(shù)期，15h-24h處于穩(wěn)定期。對數(shù)期菌體代謝旺盛，轉(zhuǎn)化率高，且加硒時(shí)間越早對菌體代謝活動(dòng)抑制越強(qiáng)，從轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)周期考慮，選擇第13小時(shí)為最佳加硒時(shí)間，最佳培養(yǎng)時(shí)間為48h。G)陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖發(fā)酵液的制備向250ml三角瓶中加入70mlPDA加富液體培養(yǎng)基，12rC滅菌20min，向培養(yǎng)基中接種5環(huán)菌種后放置于搖床中3(TC振蕩培養(yǎng)，往復(fù)振蕩的沖程4-10cm，振蕩頻率200rpm，培養(yǎng)18h后得到發(fā)酵罐種子液。發(fā)酵罐內(nèi)加入70%發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蔗糖2.5%，酵母浸膏0.5%，蛋白胨0.5%,K2HPO40.2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%)，12rC蒸汽滅菌20min，接種種子液，接種量3%，發(fā)酵條件為pH7.0、溫度3(TC、通氣量為0.5vvm、機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)13h時(shí)加入無菌亞硒酸鈉溶液，使培養(yǎng)基最終含硒量為25ng/mL，每12h向發(fā)酵罐補(bǔ)充1%葡萄糖,發(fā)酵時(shí)間48h，得到含有陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖的發(fā)酵液。(4)陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖的分離提取a.富硒粗多糖的提取發(fā)酵液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，于6(TC將其濃縮為原體積的1/10,9(TC水浴lh，5000rpm離心15min，收集上清液，用磁力攪拌器邊攪拌邊向上清液中緩緩加入3倍體積的95%乙醇，放入4t:冰箱沉淀過夜，然后5000rpm離心15min，沉淀再依次用預(yù)冷的無水乙醇、丙酮和無水乙醚洗滌，離心，最后將沉淀置于真空干燥器中干燥，得到富硒粗多糖粉末。b.蛋白酶處理取富硒粗多糖10g溶于200mL蒸餾水中(稍加熱促溶)，用Na2CCb調(diào)PH值至8.0，加胰蛋白酶0.5g，55'C水解2h后，用草酸調(diào)PH值至5.5，加木瓜蛋白酶0.5g，7(TC水解3h后，加熱至10(TC，5min終止酶反應(yīng)。c.三氯乙酸法脫蛋白取200mL的蛋白酶處理液，用草酸調(diào)PH值至7.0，加入8g三氯乙酸，用磁力攪拌器攪拌lh，11000rpm離心10min，取上清。d.Sevag法脫蛋白取上述上清液中，加入1/3體積的Sevag試劑(氯仿和正丁醇的體積比為4:1)，充分振蕩，混合25min，充分靜置分層，4000rpm離心5min，重復(fù)數(shù)次直至兩相界面無變性蛋白出現(xiàn)為止。然后用3倍體積預(yù)冷的95%乙醇醇析，所得的沉淀再依次用無水乙醇、丙酮和無水乙醚洗滌兩次，真空干燥，得到脫蛋白富硒多糖。e.脫色將脫蛋白后的富硒多糖配成0.5%溶液，用氨水調(diào)PH值至8.0，在5(TC下滴加20%的11202，至溶液為淡黃色，保溫2h，然后用稀鹽酸中和至7.0。自來水透析48h，蒸餾水透析48h后，加入3倍體積預(yù)冷的95%乙醇，4'C靜置12h后，5000rpm離心10min，沉淀真空干燥，得富硒多糖精品。實(shí)施例2、應(yīng)用苯酚-硫酸法檢測陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖中多糖含量方法如下準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，吸取0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、l.Oml、1.2ml、1.4ml、1.6ml、1.8ml分別加水補(bǔ)至2.0ml，然后加入6.0%苯酚l.Oml和濃硫酸5.0ml，靜置10min，搖勻，30min水浴，20min后于490nm測定光密度，以2.0ml水按同樣操作為空白，橫坐標(biāo)x為多糖含量，縱坐標(biāo)y為光密度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取樣品液1.0ml(相當(dāng)于40嗎左右的富硒多糖)，按上述步驟操作，測定光密度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含實(shí)施例3、應(yīng)用凱氏定氮法測定陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖中蛋白質(zhì)含量。采用國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的凱氏定氮法(GB/T5009.5-1985)測定陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖中蛋白質(zhì)含量。實(shí)施例4、應(yīng)用熒光分光光度法測定陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖中硒含量。采用國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的熒光分光光度法(GB12399-90)測定陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖中硒含量。實(shí)施例2、實(shí)施例3和實(shí)例4:采用苯酚-硫酸法、凱氏定氮法、熒光分光光度法測定陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖中多糖、蛋白質(zhì)和硒含量。測定結(jié)果顯示富硒粗多糖中多糖、蛋白質(zhì)以及硒含量分別為69.40%、25.68%及65.70mg/kg;富硒多糖精品中多糖、蛋白質(zhì)以及硒含量分別為99.97%、0.03%及35.56mg/kg。結(jié)果表明，上述提取富硒多糖的生產(chǎn)過程簡單，產(chǎn)品產(chǎn)量和純度較高，富硒程度較高。實(shí)施例4、陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖抗氧化活性試驗(yàn)將復(fù)蘇的RAW264.7細(xì)胞(可購于上海細(xì)胞生物所)接種于含10%胎牛血清、100u/mL青霉素和100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(可購自Hyclone公司)中，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)，將細(xì)胞濃度調(diào)整成lXl()S個(gè)/mL濃度后，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100uL，置37'C、5%C02的恒溫箱中孵育24h后(待細(xì)胞貼壁后)，進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)，分為陰性對照(加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)、陽性對照(含終濃度為200,ol/L的H202)和不同劑量的給藥組，給藥組分別加入100nL/孔不同濃度的富硒多糖溶液，使其終濃度分別為400、200、100pg/mL，各設(shè)4個(gè)重復(fù)孔，置于37。C、5%C02的恒溫箱中孵育24h后，加入終濃度為200^Ol/L的11202繼續(xù)培養(yǎng)12h后，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。1、向上述培養(yǎng)板內(nèi)加入MTT溶液(5mg/ml)10pL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗1次，加入100pLDMSO(可購自美國SantaCruz公司)，置于37"C、5。/。C02的恒溫箱中孵育10min，紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞的570nm吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(正常對照組A值-空白對照組A值)xiooo/0。2、采用試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px和MDA的含量。表1所示為陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖對H202誘導(dǎo)氧化損傷RAW264.7細(xì)胞生長的影響；表2所示為陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖對11202誘導(dǎo)氧化損傷RAW264.7細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響；表lOD570nm細(xì)胞相對存活率(100%)陰性對照1.080a100.00a陽性對照(200^iMH2O2)0.533b49.35b100ng/mL0.572b52.96b富硒多糖200(xg/mL0.561b51.94b400(xg/mL0.654d60.56dS.E.M.0.00572.510注同列上標(biāo)字母不同表示差異顯著(/K0.05)。與對照組相比，RAW264.7細(xì)胞加入終濃度為200pM的&02培養(yǎng)12小時(shí)，細(xì)胞的存活率降低50.65%(/<0.05);與200pM的&02作用組相比，用100pg/mL、200pg/mL和400pg/mL富硒多糖預(yù)處理24小時(shí)，再加入終濃度為200joM的H202，繼續(xù)培養(yǎng)10小時(shí)，細(xì)胞存活率分別提高了7.32%(p<0.05)、5.25%(p<0.05)和22.72%(;<0.05)。表2SOD(U/mgprot)GSH-Px(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)陰性對照51.51a24.32a1.68a陽性對照(200nMH2O2)28.22b10.24b4.11b100—mL29.57b11.53b4.16b富硒多糖200pg/mL33.87b13.32b3.26d400|_ig/mL36.39d15.11d2.95dS.E.M.0.4120.1790.061注同列上標(biāo)字母不同表示差異顯著(p<0.05)。與對照組相比，1^202單獨(dú)作用(200pM，12小時(shí))組RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的SOD和GSH-Px活性分別降低了45.21%(;<0.05)和57.89%(p<0.05)，MDA含量提高了144.64°/。(p<0.05);與200[xM的H2O2作用組相比，用400)ig/mL富硒多糖預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)的SOD和GSH-Px活性分別提高了28.95%(/K0.05)和47.56%(p<0.05),MDA含量降低了28.22%(p<0.05)。實(shí)施例5、陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖免疫調(diào)節(jié)作用試驗(yàn)取ICR小鼠(可購自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)40只(雌雄各半)，隨機(jī)分為對照組(i)、環(huán)磷酰胺組(n)、環(huán)磷酰胺+富硒多糖組(III)和富硒多糖組(IV)，I、II組每天灌胃生理鹽水0.4mL，III、IV組每天灌胃富硒多糖0.4mL(400mg/kg體重)，II、III組在第12d腹腔注射環(huán)磷酰胺(50mg/kg體重)誘導(dǎo)免疫低下，試驗(yàn)期14d，在試驗(yàn)的第10天，所有的試驗(yàn)鼠腹腔注射0.2mL10%的SRBC進(jìn)行免疫。于最后一次給藥后12小時(shí)，頸椎脫臼處死小鼠，取樣進(jìn)行以下指標(biāo)分析。1、采集血樣制備血清，采用ELISA方法試劑盒測定血清中細(xì)胞因子IL-2禾口TNF-a含量。2、采集脾臟，采用MTT法進(jìn)行脾臟淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，測定T/B淋巴細(xì)胞增殖效果試驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，用75%酒精浸泡5min，取脾臟(無菌操作)，置于Hank'S液中于200目網(wǎng)中研磨，無菌制備成單細(xì)胞懸液，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2xl06/ml，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔分別加入不同處理的小鼠脾細(xì)胞懸液90^iL，50ng/mL的ConA液10pL或100pg/mL的LPS液10pL，對照孔加入90pL的脾細(xì)胞懸液和10pLRPMI-1640培養(yǎng)液，置5%C02，37。C細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，于培養(yǎng)第68h，取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT(0.4%)10pL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后每孔加入100pLDMSO，用平板搖床搖勻，紫色結(jié)晶完全溶解后用酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-RAD)于570nm處測OD值。表3為陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖對ICR小鼠血清中IL-2和TNF-a水平的影響；表4為陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖對ICR小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注同列上標(biāo)字母不同表示差異顯著(/K0.05)。與對照組相比，小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后，血清中IL-2和TNF-d水平分別降低41.04%(p<0.05)和47.41%(p〈0.05);與環(huán)磷酰胺作用組相比，小鼠經(jīng)400mg/kg富硒多糖預(yù)防性灌胃再腹腔注射環(huán)磷酰胺，血清中IL-2和TNF-a水平分別提高15.24。/o(/0.05)和50.57。/oQ0.05);與對照相比，單獨(dú)灌胃400mg/kg的富硒多糖組血清中IL-2和TNF-a水平分別提高1.97%(/>0.05)和20.49%(p<0.05)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注同列上標(biāo)字母不同表示差異顯著&<0.05)。與對照組相比，小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后，ConA誘導(dǎo)的脾臟T淋巴細(xì)胞增殖率和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖率分別降低32.16%(/K0.05)和43.37%(p〈0.05);與環(huán)磷酰胺單獨(dú)作用組相比，小鼠經(jīng)400mg/kg富硒多糖預(yù)防性灌胃再腹腔注射環(huán)磷酰胺，ConA誘導(dǎo)的脾臟T淋巴細(xì)胞增殖率和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖率分別提高7.12%(/<0.05)和20.45%(/O.05);與對照組相比，單獨(dú)灌胃400mg/kg的富硒多糖組ConA誘導(dǎo)的脾臟T淋巴細(xì)胞增殖率和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖率分別提高6.13%和3.79%，但差異都不顯著。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求1、一種陰溝腸桿菌，其特征在于該陰溝腸桿菌為陰溝腸桿菌Z0206CGMCCNO2279。2、一種陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法，其特征依次包括以下步驟-(1)陰溝腸桿菌Z0206耐硒能力馴化挑取陰溝腸桿菌Z0206菌種，先后涂布于含硒量為10、20、30、40、50pg/mL的PDA加富培養(yǎng)基平板上，進(jìn)行硒濃度梯度馴化；每個(gè)梯度于2832。C培養(yǎng)2436h;最后從含硒量50嗎/mL的PDA加富培養(yǎng)基平板上挑取生長良好的菌落于平板上劃線分離，純化后斜面保存；(2)陰溝腸桿菌Z0206富硒研究通過測定細(xì)菌的生長曲線，確定最佳加硒時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間；從斜面上挑取耐硒馴化后的菌種，接種于含硒量分別為10、15、20、25、30、35pg/mL的PDA加富培養(yǎng)基上，2832°。培養(yǎng)2448h，觀察菌體顏色變化確定最佳硒濃度；為避免過多的無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為單質(zhì)硒，提高有機(jī)硒轉(zhuǎn)化效率，選取培養(yǎng)基上菌體顏色略紅、生長良好的硒濃度作為最佳硒濃度；從斜面上挑取耐硒馴化后的菌種，PDA培養(yǎng)基平板活化培養(yǎng)2436h后，接種于裝有PDA培養(yǎng)基的三角瓶中；2832。C振蕩培養(yǎng)，每隔lh無菌取出lmL培養(yǎng)液，用分光光度計(jì)檢測580nm處的吸光度值；繪制細(xì)菌的生長曲線；通過生長曲線確定加硒時(shí)間及培養(yǎng)時(shí)間；(3)將耐硒馴化后的陰溝腸桿菌Z0206菌種，接種至PDA加富液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，28。C32t:往復(fù)振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間18h20h，得到發(fā)酵罐發(fā)酵種子液，發(fā)酵罐內(nèi)加入70%發(fā)酵培養(yǎng)基，121。C蒸汽滅菌20min，接種種子液，培養(yǎng)13h時(shí)加入無菌亞硒酸鈉溶液，使培養(yǎng)基最終含硒量為25pg/mL，發(fā)酵時(shí)間48h72h，得到含有陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖的發(fā)酵液；(4)發(fā)酵液于6(TC70。C濃縮至原體積的1/10，再8(TC90。C水浴lh1.5h，5000rpm離心10min15min，收集上清液，加入35倍體積預(yù)冷的95%乙醇，4。C靜置12h后，5000rpm離心10min15min，沉淀再依次用無水乙醇、丙酮和無水乙醚洗滌，離心，沉淀真空干燥，即得到富硒粗多糖粉末；(5)蛋白酶處理將步驟(4)得到的富硒粗多糖溶解于20倍體積的熱的蒸餾水中，用Na2C03調(diào)pH至7.09.0，加入0.25%1%胰蛋白酶(w/v)，55。C水解l2h后，用草酸調(diào)pH至5.05.7，然后加入0.25%1%木瓜蛋白酶(w/v)，65t:7(TC水解2h3h后，于IO(TC水浴加熱56min,以終止酶反應(yīng)；(6)三氯乙酸法脫蛋白取步驟(5)后得到的蛋白酶處理液，用草酸調(diào)pH值至7.0，加入2%4%三氯乙酸(w/v)，室溫下磁力攪拌lh后，11000rpm離心1015min，取上清；(7)Sevag法脫蛋白向步驟(6)取得的上清液中加入1/3體積的Sevag試劑，充分振蕩，混合2030min，充分靜置分層，4000rpm離心5min，重復(fù)操作數(shù)次至兩相界面不再出現(xiàn)蛋白沉淀；然后用35倍體積預(yù)冷的95%乙醇醇析，所得的沉淀再依次用無水乙醇、丙酮和無水乙醚洗滌兩次，真空干燥，得到脫蛋白富硒多糖；(8)脫色將經(jīng)步驟(7)脫蛋白后的富硒多糖配成0.5%溶液，用氨水調(diào)pH至8.0，在5(TC下滴加20。/。的H202，至溶液為淡黃色，保溫2h，然后用稀鹽酸中和至7.0;自來水透析23d，蒸餾水透析23d后，加入35倍體積預(yù)冷的95%乙醇沉淀，4tl靜置12h后，5000rpm離心10min15min，沉淀真空干燥，得富硒多糖精品。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法，其特征在于所述步驟(1)、(2)或(3)中，PDA加富培養(yǎng)基的配方為馬鈴薯20%，蛋白胨0.20.5%，酵母浸膏0.3%，葡萄糖2%，瓊脂粉1.6%。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蔗糖2.5%，酵母浸膏0.5%，蛋白胨0.5%，K2HPO40.2%,KH2PO40.1%，MgSO40.05%。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中，搖瓶發(fā)酵條件為接種量35環(huán)，往復(fù)振蕩沖程410cm，振蕩頻率200250rpm。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中，發(fā)酵罐發(fā)酵條件為接種量3%，pH7.0，溫度30°C，通氣量為0.250.75wm，機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速200300rpm，每12h向發(fā)酵罐補(bǔ)充1%3%的葡萄糖。6、根據(jù)權(quán)利要求2所述的陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法，其特征在于所述步驟(6)中的Sevag試劑的配方為，氯仿和正丁醇的體積比為4:1。7、一種如權(quán)利要求2所述陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖在制備增強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能和免疫調(diào)節(jié)功能的保健品或添加劑中的應(yīng)用。8、一種如權(quán)利要求2所述陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖在制備抗腫瘤藥物和抗病毒藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種陰溝腸桿菌Z0206，已于2007年12月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNO2279；還公開了一種陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法和富硒多糖的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提取富硒多糖的生產(chǎn)過程簡單，產(chǎn)品產(chǎn)量和純度較高，富硒程度較高；通過本方法制備的富硒多糖可顯著提高免疫低下小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力以及細(xì)胞因子水平，對免疫低下小鼠的免疫功能具有顯著的調(diào)節(jié)作用；本方法制備的富硒多糖可以顯著提高抗氧化酶活性，增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)的功能，對H₂O₂引起的RAW264.7細(xì)胞的氧化損傷具有明顯的保護(hù)作用，是一種有效的抗氧化劑。文檔編號C12N1/20GK101475916SQ20081012131公開日2009年7月8日申請日期2008年10月6日優(yōu)先權(quán)日2008年10月6日發(fā)明者姚國佳,徐春蘭,汪以真,靳明亮申請人:浙江大學(xué)