專(zhuān)利名稱(chēng)：一株陰溝腸桿菌及其在制備2，3-丁二醇中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株陰溝腸桿菌溶解亞種及其應(yīng)用，尤其涉及一株高產(chǎn)2，3_ 丁二醇的陰溝腸桿菌溶解亞種及其在制備2，3_ 丁二醇中的應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2，3-丁二醇0，3-butanediol)是一種潛在的非常有價(jià)值的平臺(tái)化合物，廣泛用于醫(yī)藥、化工、食品、燃料以及航空航天等多個(gè)領(lǐng)域(CeliAska, E.，Grajek, W.，2009. Biotechnol. Adv. 27，715-725.)。左旋形式的2，3-丁二醇由于其具有較低的凝固點(diǎn)可以作為抗凍劑。2，3_丁二醇可以作為前體物質(zhì)用于生產(chǎn)在化工領(lǐng)域具有極其廣泛用途的甲乙酮和1，3- 丁二烯。2，3- 丁二醇的燃燒值為27200kJ/kg，同乙醇相當(dāng)Q9055kJ/kg)，是一種潛在價(jià)值很高的燃料添加劑。2，3- 丁二醇還可用來(lái)制備聚合物、油墨、香水、熏蒸劑、增濕劑、 軟化劑、增塑劑、炸藥以及藥物的手性載體等等。2，3-丁二醇如此廣泛的用途導(dǎo)致其在國(guó)際市場(chǎng)上的需求不斷上漲，作為液體燃料添加劑的研究也引起了世界的廣泛關(guān)注。2，3- 丁二醇的生產(chǎn)主要是微生物發(fā)酵法，與化學(xué)合成法相比，該方法環(huán)境友好，工藝簡(jiǎn)單，技術(shù)上較為成熟，符合綠色化工的要求。細(xì)菌是對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇有工業(yè)價(jià)值的微生物。用于發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的細(xì)菌菌屬主要有克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、 沙雷氏菌屬Gerratia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和氣單胞菌屬(Aeromonas)等。關(guān)于腸桿菌屬(Enterobacter)生產(chǎn)2，3-丁二醇的報(bào)道較少，其2，3-丁二醇的產(chǎn)量均較低(中國(guó)專(zhuān)利 CN101709281A, CN101709280A ；Saha, B. C.，Bothast, R. J.，1999. Appl. Microbiol. Biotechnol. 52，321-326，趙世敏等，2008 年.食品與發(fā)酵工業(yè).34 (3)，25-28)。經(jīng)檢索，目前未見(jiàn)有使用陰溝腸桿菌溶解亞種發(fā)酵生產(chǎn)2，3_丁二醇的專(zhuān)利報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一株高產(chǎn)2，3_ 丁二醇的陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)，及其所述菌在制備2，3_ 丁
二醇中的應(yīng)用。本發(fā)明所述產(chǎn)2，3_ 丁二醇的陰溝腸桿菌溶解亞種，其特征在于該菌株名為陰溝腸桿菌溶角軍亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDM，菌株已于 2010 年 10 月 19日保藏在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCC No. 4230。上述陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)菌株SDM是從山東濟(jì)南郊區(qū)的農(nóng)田土壤中篩選得到。經(jīng)德國(guó)Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(簡(jiǎn)稱(chēng) DSMZ)鑒定，其生物學(xué)特征是革蘭氏陰性，兼性厭氧，具有運(yùn)動(dòng)性的棒桿菌，長(zhǎng)1. 2 2. 5 μ m，寬0. 7 0. 8 μ m。 VP反應(yīng)，ONPG反應(yīng)，過(guò)氧化氫酶，尿酶，精氨酸雙水解酶，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶呈陽(yáng)性。甲基紅反應(yīng)，氧化酶反應(yīng)，明膠水解反應(yīng)和吲哚產(chǎn)生反應(yīng)呈陰性。其菌落顏色為黃白色，圓形、凸起、有光澤、表面光滑、直徑2 3mm。它可利用葡萄糖、果糖、甘露糖、麥芽糖、D-木糖、蔗糖、海藻糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、檸檬酸鹽和丙二酸鹽，37°C發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。能在 KCN上生長(zhǎng)。其16S rDNA序列如SEQ ID No. 1所示，序列長(zhǎng)度為1504bp，所述序列與多株陰溝腸桿菌溶解亞種的16S rDNA序列比對(duì)相似性達(dá)到99. 9%。本發(fā)明所述由陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDMCGMCC No. 4230發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇的方法，其涉及的步驟是(1)菌種選擇。選陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDM CGMCC No. 4230。( 斜面培養(yǎng)活化將陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDM CGMCC No. 4230菌種接種于斜面培養(yǎng)基，30 40°C條件下，靜置培養(yǎng)10 14小時(shí)，備用；(3)搖瓶發(fā)酵種子培養(yǎng)將步驟( 培養(yǎng)的斜面菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接 1 2環(huán)于40 60mL液體種子培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為150 200rpm的搖床上，30 40°C培養(yǎng)10 16小時(shí)，得到種子培養(yǎng)液；(4)發(fā)酵罐發(fā)酵種子培養(yǎng)一級(jí)種子培養(yǎng)將步驟( 培養(yǎng)的斜面菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于 80 120mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為150 200rpm的搖床上，30 40°C培養(yǎng)10 16小時(shí)，得到一級(jí)種子培養(yǎng)液；擴(kuò)大培養(yǎng)將上述培養(yǎng)的一級(jí)種子，在無(wú)菌條件下以5 10% (體積比)的接種量接種于0. 8 1. 2升液體種子培養(yǎng)基的5升三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為150 200rpm的搖床上，30 40°C培養(yǎng)10 16小時(shí)，得到二級(jí)種子培養(yǎng)液；(5)發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶發(fā)酵以5 10% (體積比)的接種量，將種子液接種于裝有80 120mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶瓶中，置于轉(zhuǎn)速為150 200rpm的搖床上，30 40°C培養(yǎng)16 30小時(shí)，當(dāng)發(fā)酵液中2，3- 丁二醇濃度不再上升時(shí)，發(fā)酵停止。50升發(fā)酵罐發(fā)酵以體積比5 10%的接種量，將二級(jí)種子液接種于50升發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐裝液量為30升，然后以初始碳源濃度為60 120g/L、溫度30 40°C、攪拌轉(zhuǎn)速 200 600rpm、通氣量0. 5 1. 5vvm進(jìn)行通風(fēng)攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為20 60小時(shí)；發(fā)酵液初始PH值調(diào)至5. 5 7. 0，發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)流加3 6M的KOH和2 5M的H3PO4來(lái)調(diào)節(jié)PH值，使之控制在pH5. 5 6. 5 ；發(fā)酵過(guò)程中，每隔3 5小時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液中的殘?zhí)橇亢?，3- 丁二醇濃度，并依據(jù)殘?zhí)菨舛攘骷犹荚?，?dāng)2，3- 丁二醇濃度不再上升時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。上述斜面培養(yǎng)基組成為葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化鈉2g/L， 氯化鉀2g/L，硫酸鎂1. 5g/L，瓊脂粉18g/L，pH值調(diào)至5. 5 7. 0，蒸餾水配制，115°C滅菌 20分鐘；上述種子培養(yǎng)基組成為碳源30 40g/L，磷酸二氫鉀3 10g/L，氯化銨3 12g/L，氯化鈉1 4g/L，硫酸鎂0. 05 0. lg/L，硫酸亞鐵0. 05 0. lg/L，pH值調(diào)至5. 5 7. 0，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；
上述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為碳源60 120g/L，玉米漿干粉5 20g/L，磷酸二氫鉀 3 10g/L，氯化銨5 25g/L，乙酸鉀1 4g/L，氯化鈉1 4g/L，氯化鈣0. 05 0. Ig/ L，硫酸鎂0. 1 0. 5g/L，硫酸鋅0. 2 0. 6g/L，硫酸亞鐵0. 2 0. 6g/L，pH值調(diào)至5. 5 7. 0，自來(lái)水配制，115°C滅菌20分鐘；上述50升發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)中流加方式優(yōu)選脈沖流加，其方法是當(dāng)糖濃度降到 10 30g/L時(shí)，脈沖流加底物，使糖濃度達(dá)到50 70g/L。上述種子培養(yǎng)基中的碳源至少含有葡萄糖或木糖。上述發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源至少含有葡萄糖、木糖、蔗糖糖蜜、木糖母液、淀粉類(lèi)原料水解液、木質(zhì)纖維素原料水解液中的一種；該碳源單獨(dú)滅菌，無(wú)需調(diào)節(jié)PH。其中，所述淀粉類(lèi)原料水解液以如下方法制得取淀粉類(lèi)原料，以2 8U/g淀粉類(lèi)原料干重的酶用量加入α -淀粉酶，95°C處理0.證，得到淀粉類(lèi)原料液化液，然后調(diào)pH至4. 2，加入糖化酶，糖化酶的添加量為100 1000U/g淀粉類(lèi)原料干重，置于60°C水浴搖床中處理至葡萄糖徹底水解，得含糖濃度以質(zhì)量體積比計(jì)為15% 40%的淀粉類(lèi)原料水解液；所述木質(zhì)纖維素原料水解液以如下方法制得取粉碎的木質(zhì)纖維素原料，以質(zhì)量體積比計(jì)，按木質(zhì)纖維素原料 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為硫酸=1 10 1 3的量加入硫酸，120°C處理1小時(shí)，常規(guī)離心，上清液即為含糖濃度以質(zhì)量體積比計(jì)為15% 35%的木質(zhì)纖維素原料水解液。上述淀粉類(lèi)原料優(yōu)選淀粉或木薯粉；木質(zhì)纖維素原料優(yōu)選木頭、玉米芯或秸稈。上述淀粉類(lèi)原料水解液中糖濃度以質(zhì)量體積比計(jì)優(yōu)選為25% 35%;上述木質(zhì)纖維素原料水解液中糖濃度以質(zhì)量體積比計(jì)優(yōu)選為25% 30%。上述的應(yīng)用中，步驟⑵、(3)、⑷、(5)所述培養(yǎng)溫度優(yōu)選37 士 0. 2°C ；上述的應(yīng)用中，步驟(2)所述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選12小時(shí)；上述的應(yīng)用中，步驟(3)所述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選12 14小時(shí)；上述的應(yīng)用中，步驟(4)所述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選12 14小時(shí)；上述的應(yīng)用中，步驟( 所述50升發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基初始糖濃度優(yōu)選60 80g/ L0上述的應(yīng)用中，步驟(5)所述50升發(fā)酵罐發(fā)酵液pH優(yōu)選6.0 士 0.2。本發(fā)明的顯著特點(diǎn)是從農(nóng)田土層中篩選得到一株具有發(fā)酵潛力的產(chǎn)2，3_ 丁二醇的菌株，經(jīng)鑒定為陰溝腸桿菌溶解亞種，命名為陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)SDMCGMCC No. 4230。本發(fā)明的用于發(fā)酵制備2，3- 丁二醇的菌株陰溝腸桿菌溶解亞種(EntercAacter cloacae subsp. dissolvens) SDM CGMCC No. 4230，具有轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)物濃度高，底物譜廣等特點(diǎn)，可以穩(wěn)定地進(jìn)行2，3- 丁二醇的發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵2，3- 丁二醇的產(chǎn)量能夠達(dá)到125 162g/L，2，3- 丁二醇生產(chǎn)率最大為4. lg/(L · h)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到理論轉(zhuǎn)化率的 90 95%，極具工業(yè)化應(yīng)用潛力。
具體實(shí)施例方式一般性說(shuō)明取淀粉類(lèi)原料，以2 8U/g淀粉類(lèi)原料干重的酶用量加入α-淀粉酶，95°C處理0. 5h，得到淀粉類(lèi)原料液化液，然后調(diào)pH至4. 2，加入糖化酶，糖化酶的添加量為100 1000U/g淀粉類(lèi)原料干重，置于60°C水浴搖床中處理至葡萄糖徹底水解，得含糖濃度以質(zhì)量體積比計(jì)為15% 40%的淀粉類(lèi)原料水解液。上述淀粉類(lèi)原料優(yōu)選淀粉或木薯粉。同步糖化發(fā)酵底物的準(zhǔn)備將α -淀粉酶液化好的淀粉類(lèi)原料液化液115°C滅菌 20分鐘，用于下一步的同步糖化發(fā)酵。木質(zhì)纖維素原料水解液的制備取粉碎的直徑在0. 45 0. 9mm的木質(zhì)纖維素原料，以質(zhì)量體積比計(jì)，按木質(zhì)纖維素原料質(zhì)量分?jǐn)?shù)為硫酸=1 10 1 3的量加入硫酸，120°C處理1小時(shí)，常規(guī)離心，上清液即為含糖濃度以質(zhì)量體積比計(jì)為15% 35%的木質(zhì)纖維素原料水解液。上述木質(zhì)纖維素原料優(yōu)選木頭、玉米芯或秸稈。上述淀粉類(lèi)原料水解液中糖濃度以質(zhì)量體積比計(jì)優(yōu)選為25% 35%;上述木質(zhì)纖維素原料水解液中糖濃度以質(zhì)量體積比計(jì)優(yōu)選為25% 30%。木質(zhì)纖維素原料水解液成分以及總糖分析方法參考(Wang AL, et al. Appl Microbiol Biotechnol，2010，87 :965-970)。葡萄糖購(gòu)自濟(jì)南市歷城區(qū)昌英達(dá)化工經(jīng)營(yíng)部，木糖購(gòu)自濟(jì)南圣泉唐和唐生物科技有限公司，玉米芯、木糖母液購(gòu)自山東龍力生物科技股份有限公司，蔗糖糖蜜購(gòu)自廣西華商國(guó)糖貿(mào)易有限公司，木薯粉購(gòu)自上海祥亨貿(mào)易有限公司。葡萄糖的測(cè)定方法為發(fā)酵液稀釋后離心，采用生物傳感分析儀SBA_40C(山東省科學(xué)院生物研究所)測(cè)定。測(cè)定原理為利用固定化葡萄糖脫氫酶膜專(zhuān)一性測(cè)定葡萄糖含量。木糖檢測(cè)方法為=Agilent 1100高效液相色譜儀，G1311A四元泵，示差折光分析檢測(cè)器，進(jìn)樣量10 μ L。Agilent HPLC 2D色譜工作站。色譜柱為ZORBAX碳水化合物分析柱6 X 150mm)，柱溫30 50°C，流動(dòng)相為乙腈水=80 20 (ν/ν)，流速1. 2mL/min。以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。2，3- 丁二醇的測(cè)定方法VARIAN CP-3380氣相色譜儀檢測(cè)。乙酸丁酯為萃取劑， 體積比1 1萃取，取上層有機(jī)相檢測(cè)。具體測(cè)定的條件是火焰離子監(jiān)測(cè)器(FID)溫度為 280°C，進(jìn)樣器溫度為220°C，而毛細(xì)管柱溫是從50°C升溫到180°C，升溫速度20°C /min，載氣為氮?dú)?。利?，3-丁二醇標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)361461)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出發(fā)酵液中2，3-丁二醇的含量。實(shí)施例 1 陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDM CGMCC No. 4230的分離篩選及鑒定該實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下液體篩選培養(yǎng)基葡萄糖50g/L，乙酸鈉5g/L，氯化鉀0. 5g/L，硫酸鎂0. 15g/L，七水硫酸亞鐵0. 05g/l，七水硫酸錳0. 03g/l, pH為7。固體篩選養(yǎng)基液體篩選培養(yǎng)基，瓊脂粉18g/l，pH為7。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖100g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，乙酸鈉5g/L，pH為7。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，pH為 7。
該實(shí)施例的具體操作過(guò)程如下1、分離篩選從農(nóng)田取得土壤，取Ig加入裝有50mL滅菌的液體篩選培養(yǎng)基的300mL三角瓶中， 在37°C條件下，置于搖床上以120rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)48小時(shí)。取Iml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到相同的液體篩選培養(yǎng)基中相同條件下培養(yǎng)46小時(shí)。將培養(yǎng)液以10_3、10_4兩個(gè)稀釋度涂布在固體篩選養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，37°C培養(yǎng)20小時(shí)，待長(zhǎng)出單菌落后，挑選菌落面積大的菌落，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于搖床上以ISOrpm的轉(zhuǎn)速，37°C培養(yǎng)20小時(shí)，通過(guò)VP反應(yīng)進(jìn)行初篩，根據(jù)反應(yīng)時(shí)間和顏色變化篩選出陽(yáng)性菌株。然后測(cè)定初篩的陽(yáng)性菌株的2，3-丁二醇的產(chǎn)量，獲得產(chǎn)量最高的菌株。2、菌株的鑒定將上述篩選得到的菌株在德國(guó) Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(簡(jiǎn)稱(chēng)DSMZ)進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果表明該菌為革蘭氏陰性，兼性厭氧， 具有運(yùn)動(dòng)性的棒桿菌，長(zhǎng)1. 2 2. 5 μ 1，寬0. 7 0. 8 μ 1。VP反應(yīng)，ONPG反應(yīng)，過(guò)氧化氫酶，尿酶，精氨酸雙水解酶，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶呈陽(yáng)性。甲基紅反應(yīng)，氧化酶反應(yīng)，明膠水解反應(yīng)和吲哚產(chǎn)生反應(yīng)呈陰性。其菌落顏色為黃白色，圓形、凸起、有光澤、表面光滑、直徑 2 3mm。它可利用葡萄糖、果糖、甘露糖、麥芽糖、D-木糖、蔗糖、海藻糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、檸檬酸鹽和丙二酸鹽，37°C發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。能在KCN上生長(zhǎng)。其16S rDNA序列如SEQ ID No. 1所示，序列長(zhǎng)度為1504bp，所述序列與多株陰溝腸桿菌溶解亞種的16S rDNA序列比對(duì)相似性達(dá)到99.9%。綜合分析，菌株鑒定為陰溝腸桿菌溶解亞種 (Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)，|名為陰溝角軍亞禾中(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)SDM0上述菌株陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae ssp. dissolvens) SDM 已于2010年10月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng) CGMCC)，保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院微生物研究所，郵政編碼100101， 其保藏編號(hào)為CGMCC No. 4230。實(shí)施例2、利用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDMCGMCC No. 4230以葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇應(yīng)用方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)SDM CGMCC No. 4230 ；(2)斜面培養(yǎng)將菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，37°C條件下，靜置培養(yǎng)12小時(shí)；(3)種子培養(yǎng)—級(jí)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于IOOmL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床上，37°C培養(yǎng)12小時(shí)，得到一級(jí)種子培養(yǎng)液；擴(kuò)大培養(yǎng)將上述培養(yǎng)的一級(jí)種子，在無(wú)菌條件下以10% (體積比)的接種量接種于1升液體種子培養(yǎng)基的5升三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床上，37°C培養(yǎng)12小時(shí)， 得到二級(jí)種子培養(yǎng)液；(4)發(fā)酵培養(yǎng)德國(guó)貝朗(BI0STAT B, B. Braun) 50升發(fā)酵罐中加入30升發(fā)酵初始培養(yǎng)基。在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入3升二級(jí)種子培養(yǎng)液，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速400rpm，37°C條件下發(fā)酵50小時(shí)。每隔3小時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液中的殘?zhí)橇亢?，3_ 丁二醇濃度。發(fā)酵過(guò)程中脈沖補(bǔ)加葡萄糖，使發(fā)酵液中的葡萄糖濃度維持在20 40g/L。(5)測(cè)定分析取上述發(fā)酵液，8，OOOrpm離心5分鐘，取上清液稀釋合適倍數(shù)檢測(cè)發(fā)酵液中2，3-丁二醇濃度、葡萄糖濃度，計(jì)算糖轉(zhuǎn)化率、2，3-丁二醇生產(chǎn)率。發(fā)酵結(jié)束，測(cè)得葡萄糖的濃度為2. 7士0. 5g/L(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，2，3_ 丁二醇濃度161. 3士0. 7g/L(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到理論轉(zhuǎn)化率的92. 1 士0. 8% (平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，2，3_ 丁二醇生產(chǎn)率為3. 23士0. Olg/(L · h)(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)。 上述斜面培養(yǎng)基組成為葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鉀2g/L，硫酸鎂1. 5g/L，瓊脂粉18g/L，pH值調(diào)至6. 0，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖40g/L，磷酸二氫鉀8g/L，氯化銨5g/L，氯化鈉Ig/ L，硫酸鎂0. 05g/L，硫酸亞鐵0. 05g/L, pH值調(diào)至6. 0，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖65g/L，玉米漿干粉6g/L，磷酸二氫鉀4g/L，氯化銨20g/L，乙酸鉀4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鈣0. 08g/L，硫酸鎂0. 4g/L，硫酸鋅0. 3g/L，硫酸亞鐵0. 3g/L，pH值調(diào)至6. 0,自來(lái)水配制，115°C滅菌20分鐘；葡萄糖單獨(dú)滅菌。實(shí)施例3、利用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDMCGMCC No. 4230以木糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇應(yīng)用方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)SDM CGMCC No. 4230 ；(2)斜面培養(yǎng)將菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，35°C條件下，靜置培養(yǎng)12小時(shí)；(3)種子培養(yǎng)—級(jí)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于IOOmL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床上，35°C培養(yǎng)12小時(shí)，得到一級(jí)種子培養(yǎng)液；擴(kuò)大培養(yǎng)將上述培養(yǎng)的一級(jí)種子，在無(wú)菌條件下以10% (體積比)的接種量接種于1升液體種子培養(yǎng)基的5升三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床上，35°C培養(yǎng)12小時(shí)， 得到二級(jí)種子培養(yǎng)液；(4)發(fā)酵培養(yǎng)德國(guó)貝朗(BI0STAT B,B. Braun) 50升發(fā)酵罐中加入30升發(fā)酵培養(yǎng)基。在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入3升二級(jí)種子培養(yǎng)液，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，35°C條件下發(fā)酵 24小時(shí)。每隔3小時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液中的殘?zhí)橇亢?，3_ 丁二醇濃度。(5)測(cè)定分析取上述發(fā)酵液，8，OOOrpm離心5分鐘，取上清液稀釋合適倍數(shù)檢測(cè)發(fā)酵液中2，3- 丁二醇濃度、木糖濃度，計(jì)算糖轉(zhuǎn)化率、2，3- 丁二醇生產(chǎn)率。發(fā)酵結(jié)束，測(cè)得木糖的濃度為2. 5士0. 2g/L(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，2，3_ 丁二醇濃度 53.6士0.98/1(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到理論轉(zhuǎn)化率的91.2 士 1.5% (平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，2，3_ 丁二醇生產(chǎn)率為2. 23士0. 04g/(L · h)(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)。上述斜面培養(yǎng)基組成為葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鉀2g/L，硫酸鎂1. 5g/L，瓊脂粉18g/L，pH值調(diào)至7. 0，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述種子培養(yǎng)基組成為木糖40g/L，磷酸二氫鉀6g/L，氯化銨5g/L，氯化鈉3g/L，
9硫酸鎂0. lg/L，硫酸亞鐵0. lg/L，pH值調(diào)至7. 0，蒸餾水配制，115°C條件下滅菌20分鐘；上述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為木糖120g/L，玉米漿干粉15g/L，磷酸二氫鉀7g/L，氯化銨15g/L，乙酸鉀4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鈣0. 075g/L,硫酸鎂0. 2g/L，硫酸鋅0. 4g/L，硫酸亞鐵0. 2g/L，pH值調(diào)至7. 0,自來(lái)水配制，115°C滅菌20分鐘；木糖單獨(dú)滅菌。實(shí)施 列4、禾Ij用陰溝腸桿菌溶角軍亞禾中(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDMCGMCC No. 4230以蔗糖糖蜜為碳源發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇應(yīng)用方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)SDM CGMCC No. 4230 ；(2)斜面培養(yǎng)將菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，40°C條件下，靜置培養(yǎng)10小時(shí)；(3)種子培養(yǎng)一級(jí)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于IOOmL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床上，40°C培養(yǎng)12小時(shí)，得到一級(jí)種子培養(yǎng)液；擴(kuò)大培養(yǎng)將上述培養(yǎng)的一級(jí)種子，在無(wú)菌條件下以10% (體積比)的接種量接種于1升液體種子培養(yǎng)基的5升三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床上，40°C培養(yǎng)13小時(shí)， 得到二級(jí)種子培養(yǎng)液；(4)發(fā)酵培養(yǎng)德國(guó)貝朗(BI0STAT B, B. Braun) 50升發(fā)酵罐中加入30升發(fā)酵初始培養(yǎng)基。在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入3升二級(jí)種子培養(yǎng)液，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速600rpm，40°C條件下發(fā)酵40小時(shí)。其中，發(fā)酵到5小時(shí)，開(kāi)始脈沖流加總糖濃度以質(zhì)量體積比計(jì)為55%的蔗糖糖蜜。每隔4小時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液中的殘?zhí)橇亢?，3_ 丁二醇濃度。當(dāng)發(fā)酵液中總糖濃度降到20g/L左右時(shí)，脈沖流加蔗糖糖蜜使總糖濃度到50g/L左右。(5)測(cè)定分析取上述發(fā)酵液，8，OOOrpm離心5分鐘，取上清液稀釋合適倍數(shù)檢測(cè)發(fā)酵液中2，3- 丁二醇濃度、總糖濃度，計(jì)算2，3- 丁二醇生產(chǎn)率。發(fā)酵結(jié)束，測(cè)得總糖的濃度為3. 1 士0. 6g/L(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，2，3_ 丁二醇濃度 112. 4士2. 2g/L(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，2，3_ 丁二醇生產(chǎn)率為2.81士0. 06g/(L · h)(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)。上述斜面培養(yǎng)基組成為葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鉀2g/L，硫酸鎂1. 5g/L，瓊脂粉18g/L，pH值調(diào)至6. 5，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖35g/L，磷酸二氫鉀6g/L，氯化銨8g/L，氯化鈉3g/ L，硫酸鎂0. 06g/L，硫酸亞鐵0. 08g/L, pH值調(diào)至6. 5，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為總糖濃度以質(zhì)量體積比計(jì)為55%的蔗糖糖蜜100g/L，玉米漿干粉8g/L，磷酸二氫鉀12g/L，氯化銨12g/L，乙酸鉀4g/L，氯化鈉3g/L，氯化鈣0. 05g/ L，硫酸鎂0. 3g/L，硫酸鋅0. 4g/L，硫酸亞鐵0. 4g/L，自來(lái)水配制，該發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為 6. 5，115°C滅菌20分鐘；蔗糖糖蜜單獨(dú)滅菌。實(shí)施例5、利用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDMCGMCC No. 4230以木糖母液為碳源發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇應(yīng)用方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDM CGMCC No. 4230 ；(2)斜面培養(yǎng)將菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，30°C條件下，靜置培養(yǎng)14小時(shí)；(3)種子培養(yǎng)一級(jí)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于IOOmL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床上，37°C培養(yǎng)12小時(shí)，得到一級(jí)種子培養(yǎng)液；擴(kuò)大培養(yǎng)將上述培養(yǎng)的一級(jí)種子，在無(wú)菌條件下以10% (體積比)的接種量接種于1升液體種子培養(yǎng)基的5升三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床上，37°C培養(yǎng)13小時(shí)， 得到二級(jí)種子培養(yǎng)液；(4)發(fā)酵培養(yǎng)德國(guó)貝朗(BI0STAT B, B. Braun) 50升發(fā)酵罐中加入30升發(fā)酵初始培養(yǎng)基。在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入3升二級(jí)種子培養(yǎng)液，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速400rpm，37°C條件下發(fā)酵44小時(shí)。其中，發(fā)酵到5小時(shí)，開(kāi)始脈沖流加總糖濃度以質(zhì)量體積比計(jì)為68%的木糖母液。每隔4小時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液中的殘?zhí)橇亢?，3_ 丁二醇濃度。當(dāng)發(fā)酵液中總糖濃度降到20g/L左右時(shí)，脈沖流加木糖母液使總糖濃度到50g/L左右。(5)測(cè)定分析取上述發(fā)酵液，8，OOOrpm離心5分鐘，取上清液稀釋合適倍數(shù)檢測(cè)發(fā)酵液中2，3- 丁二醇濃度、總糖濃度，計(jì)算2，3- 丁二醇生產(chǎn)率。發(fā)酵結(jié)束，測(cè)得總糖的濃度為4. 7士0. 8g/L (平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，2，3_ 丁二醇濃度 67.9士1.78/1(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，2，3-丁二醇生產(chǎn)率為1. M士0. 04g/(L *h)(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)。上述斜面培養(yǎng)基組成為葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鉀2g/L，硫酸鎂1. 5g/L，瓊脂粉18g/L，pH值調(diào)至6. 5，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述種子培養(yǎng)基組成為木糖35g/L，磷酸二氫鉀6g/L，氯化銨8g/L，氯化鈉3g/L， 硫酸鎂0. 06g/L，硫酸亞鐵0. 08g/L, pH值調(diào)至6. 5，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為總糖濃度以質(zhì)量體積比計(jì)為68%的木糖母液90g/L，玉米漿干粉10g/L，磷酸二氫鉀10g/L，氯化銨5g/L，乙酸鉀4g/L，氯化鈉3g/L，氯化鈣0. 05g/ L，硫酸鎂0. 3g/L，硫酸鋅0. 4g/L，硫酸亞鐵0. 4g/L，自來(lái)水配制，該發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為 6. 5，115°C滅菌20分鐘；木糖母液?jiǎn)为?dú)滅菌。實(shí)施例6、利用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDMCGMCC No. 4230以木薯粉水解液為碳源發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇應(yīng)用方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)SDM CGMCC No. 4230 ；(2)斜面培養(yǎng)將菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，40°C條件下，靜置培養(yǎng)12小時(shí)；(3)種子培養(yǎng):—級(jí)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于IOOmL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床上，40°C培養(yǎng)12小時(shí)，得到一級(jí)種子培養(yǎng)液；擴(kuò)大培養(yǎng)將上述培養(yǎng)的一級(jí)種子，在無(wú)菌條件下以10% (體積比)的接種量接種于1升液體種子培養(yǎng)基的5升三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床上，40°C培養(yǎng)13小時(shí)，得到二級(jí)種子培養(yǎng)液；(4)發(fā)酵培養(yǎng)德國(guó)貝朗(BI0STAT B,B. Braun) 50升發(fā)酵罐中加入30升發(fā)酵初始培養(yǎng)基。在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入3升二級(jí)種子培養(yǎng)液，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速400rpm，40°C條件下發(fā)酵51小時(shí)。每隔3小時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液中的殘?zhí)橇亢?，3_ 丁二醇濃度。根據(jù)殘?zhí)菨舛葋?lái)脈沖流加總糖濃度為320g/L的木薯粉水解液，維持糖濃度在40 80g/L。(5)測(cè)定分析取上述發(fā)酵液，8，OOOrpm離心5分鐘，取上清液稀釋合適倍數(shù)檢測(cè)發(fā)酵液中2，3- 丁二醇濃度、糖濃度，計(jì)算糖轉(zhuǎn)化率、2，3- 丁二醇生產(chǎn)率。發(fā)酵結(jié)束，測(cè)得葡萄糖的濃度為4. 0士0. 4g/L (平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，2，3_ 丁二醇濃度58.3士 1.5g/L(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到理論轉(zhuǎn)化率的70. 6士 1.6% (平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，2，3_ 丁二醇生產(chǎn)率為1. 14士0. 03g/(L · h)(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)。上述斜面培養(yǎng)基組成為葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鉀2g/L，硫酸鎂1. 5g/L，瓊脂粉18g/L，pH值調(diào)至7. 0，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖40g/L，磷酸二氫鉀6g/L，氯化銨5g/L，氯化鈉3g/ L，硫酸鎂0. lg/L，硫酸亞鐵0. lg/L，pH值調(diào)至7.0，蒸餾水配制，115°C條件下滅菌20分鐘；上述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為總糖濃度為320g/L的木薯粉水解液100g/L，玉米漿干粉 15g/L,磷酸二氫鉀3g/L，氯化銨5g/L，乙酸鉀4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鈣0. 075g/L,硫酸鎂 0. 2g/L，硫酸鋅0. 4g/L，硫酸亞鐵0. 2g/L，pH值調(diào)至7. 0，自來(lái)水配制，115°C滅菌20分鐘。實(shí)施例 7 利用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDMCGMCC No. 4230以淀粉水解液為碳源同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇應(yīng)用方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)SDM CGMCC No. 4230 ；(2)斜面培養(yǎng)將菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，40°C條件下，靜置培養(yǎng)12小時(shí)；(3)種子培養(yǎng)一級(jí)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于IOOmL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床上，40°C培養(yǎng)12小時(shí)，得到一級(jí)種子培養(yǎng)液；擴(kuò)大培養(yǎng)將上述培養(yǎng)的一級(jí)種子，在無(wú)菌條件下以10% (體積比)的接種量接種于1升液體種子培養(yǎng)基的5升三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床上，40°C培養(yǎng)13小時(shí)， 得到二級(jí)種子培養(yǎng)液；(4)淀粉處理及同步糖化分批發(fā)酵培養(yǎng)基的制備將350g淀粉加水調(diào)制成淀粉漿定容至1L，調(diào)節(jié)pH至6. 0，按加酶量為3U/g淀粉干重加入α -淀粉酶，在95°C條件下蒸煮4小時(shí)，得到淀粉液化液，115°C滅菌20分鐘，冷卻后作為碳源，用于制備進(jìn)行同步糖化分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基；(5)50升發(fā)酵罐同步糖化分批發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇無(wú)菌條件培養(yǎng)好的陰溝腸桿菌溶角軍亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDM CGMCC No. 4230種子液按體積比為5%的接種量接入滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基， 同時(shí)補(bǔ)加過(guò)濾除菌的糖化酶，糖化酶添加量為200U/g淀粉干重；發(fā)酵罐總裝液量為30L，以發(fā)酵溫度為37°C，攪拌轉(zhuǎn)速為350rpm，通氣量為1. Ovvm進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵初始pH值為6. 5，發(fā)酵過(guò)程中PH值控制在PH 6.0;發(fā)酵時(shí)間為40小時(shí)。每隔5小時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液中的殘?zhí)橇亢?，3-丁二醇濃度。發(fā)酵過(guò)程中加入滅菌的淀粉液化液和過(guò)濾除菌的糖化酶，糖化酶添加量為200U/g淀粉干重，保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在15 40g/L。(6)測(cè)定分析取上述發(fā)酵液，8，OOOrpm離心5分鐘，取上清液稀釋合適倍數(shù)檢測(cè)發(fā)酵液中2，3- 丁二醇濃度、糖濃度，計(jì)算糖轉(zhuǎn)化率、2，3- 丁二醇生產(chǎn)率。發(fā)酵結(jié)束，測(cè)得總糖的濃度為3. 6士0. 4g/L(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，2，3_ 丁二醇濃度 82. 5士 1.7g/L(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)，2，3-丁二醇生產(chǎn)率為2. 06士0. 04g/(L *h)(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)。上述斜面培養(yǎng)基組成為葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鉀2g/L，硫酸鎂1. 5g/L，瓊脂粉18g/L，pH值調(diào)至6. 5，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，氯化銨8g/L，氯化鈉4g/ L，硫酸鎂0. lg/L，硫酸亞鐵0. 05g/L, pH值調(diào)至6. 5，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；上述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為淀粉液化液，其用量為500mL/L，玉米漿干粉7g/L，磷酸二氫鉀6g/L，氯化銨15g/L，乙酸鉀4g/L，氯化鈉3g/L，氯化鈣0. lg/L,硫酸鎂0. 4g/L，硫酸鋅0. 2g/L，硫酸亞鐵0. 2g/L，自來(lái)水配制，該發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6. 5，115°C滅菌20分鐘；淀粉液化液?jiǎn)为?dú)滅菌。
1權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)2，3-丁二醇的陰溝腸桿菌溶解亞種，其特征在于該菌株名為陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDM，菌株已于 2010 年 10 月 19 日保藏在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，保藏號(hào)為CGMCC No. 4230。
2.權(quán)利要求1所述陰溝腸桿菌溶解亞種在制備2，3-丁二醇中的應(yīng)用，其特征在于由陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDM CGMCC No. 4230 發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇；其中涉及的方法是斜面 舌化培養(yǎng)>lf陰溝腸桿菌溶角軍亞禾中(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDMCGMCC No. 4230菌種接種于斜面培養(yǎng)基，30 40°C條件下，靜置培養(yǎng)10 14小時(shí)，備用；搖瓶發(fā)酵種子培養(yǎng)將上述培養(yǎng)的斜面菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于 40 60mL液體種子培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為100 200rpm的搖床上，30 40°C培養(yǎng)10 16小時(shí)，得到種子培養(yǎng)液； 發(fā)酵罐發(fā)酵種子培養(yǎng)一級(jí)種子培養(yǎng)將上述培養(yǎng)的斜面菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于80 120mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為100 200rpm的搖床上，30 40°C 培養(yǎng)10 16小時(shí)，得到一級(jí)種子培養(yǎng)液；擴(kuò)大培養(yǎng)將上述培養(yǎng)的一級(jí)種子，在無(wú)菌條件下以體積比5 10%的接種量接種于 0. 8 1. 2升液體種子培養(yǎng)基的5升三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為100 200rpm的搖床上，30 40°C培養(yǎng)10 16小時(shí)，得到二級(jí)種子培養(yǎng)液； 發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶發(fā)酵以體積比5 10%的接種量，將種子液接種于裝有80 120mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶瓶中，置于轉(zhuǎn)速為100 200rpm的搖床上，30 40°C培養(yǎng)16 30小時(shí)， 當(dāng)發(fā)酵液中2，3-丁二醇濃度不再上升時(shí)，發(fā)酵停止；50升發(fā)酵罐發(fā)酵以體積比5 10%的接種量，將二級(jí)種子液接種于50升發(fā)酵罐中， 發(fā)酵罐裝液量為30升，然后以初始碳源濃度為60 120g/L、溫度30 40°C、攪拌轉(zhuǎn)速 200 600rpm、通氣量0. 5 1. 5vvm進(jìn)行通風(fēng)攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為20 60小時(shí)；發(fā)酵液初始PH值調(diào)至5. 5 7. 0，發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)流加3 6M的KOH和2 5M的H3PO4來(lái)調(diào)節(jié)PH值，使之控制在pH 5. 5 6. 5 ；發(fā)酵過(guò)程中，每隔3 5小時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液中的糖殘量和2，3- 丁二醇濃度，并依據(jù)底物的濃度流加底物，當(dāng)發(fā)酵液中2，3- 丁二醇濃度不再上升時(shí)，發(fā)酵結(jié)束；其中上述培養(yǎng)中涉及的培養(yǎng)基及配方是斜面培養(yǎng)基組成為葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化鈉2g/L，氯化鉀2g/ L，硫酸鎂1. 5g/L，瓊脂粉18g/L，pH值調(diào)至5. 5 7. 0，蒸餾水配制，115°C滅菌20分鐘；種子培養(yǎng)基組成為碳源30 40g/L，磷酸二氫鉀3 10g/L，氯化銨3 12g/L，氯化鈉1 4g/L，硫酸鎂0. 05 0. lg/L，硫酸亞鐵0. 05 0. lg/L，pH值調(diào)至5. 5 7. 0，蒸餾水配制，115 °C滅菌20分鐘；發(fā)酵培養(yǎng)基組成為碳源60 120g/L，玉米漿干粉5 20g/L，磷酸二氫鉀3 IOg/ L,氯化銨5 25g/L，乙酸鉀1 4g/L，氯化鈉1 4g/L，氯化鈣0. 05 0. lg/L,硫酸鎂 0. 1 0. 5g/L，硫酸鋅0. 2 0. 6g/L，硫酸亞鐵0. 2 0. 6g/L，pH值調(diào)至5. 5 7. 0，自來(lái)水配制，115 °C滅菌20分鐘。
3.如權(quán)利要求2所述陰溝腸桿菌溶解亞種在制備2，3-丁二醇中的應(yīng)用，其特征在于 所述50升發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)中流加方式為脈沖流加。
4.如權(quán)利要求3所述陰溝腸桿菌溶解亞種在制備2，3-丁二醇中的應(yīng)用，其特征在于 所述脈沖流加的方式是當(dāng)糖濃度降到10 30g/L時(shí)，脈沖流加底物，使糖濃度達(dá)到50 70g/L。
5.如權(quán)利要求2所述陰溝腸桿菌溶解亞種在制備2，3-丁二醇中的應(yīng)用，其特征在于 所述種子培養(yǎng)基中的碳源至少含有葡萄糖或木糖。
6.如權(quán)利要求2所述陰溝腸桿菌溶解亞種在制備2，3-丁二醇中的應(yīng)用，其特征在于 所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源至少含有葡萄糖、木糖、蔗糖糖蜜、木糖母液、淀粉類(lèi)原料水解液、 木質(zhì)纖維素原料水解液中的一種；該碳源單獨(dú)滅菌，無(wú)需調(diào)節(jié)PH ；其中，所述淀粉類(lèi)原料水解液以如下方法制得取淀粉類(lèi)原料，以2 8U/g淀粉類(lèi)原料干重的酶用量加入α -淀粉酶，95°C處理0.證，得到淀粉類(lèi)原料液化液，然后調(diào)pH至4. 2，加入糖化酶，糖化酶的添加量為100 1000U/g淀粉類(lèi)原料干重，置于60°C水浴搖床中處理至葡萄糖徹底水解，得含糖濃度以質(zhì)量體積比計(jì)為15% 40%的淀粉類(lèi)原料水解液；所述木質(zhì)纖維素原料水解液以如下方法制得取粉碎的木質(zhì)纖維素原料，以質(zhì)量體積比計(jì)，按木質(zhì)纖維素原料質(zhì)量分?jǐn)?shù)為硫酸=1 10 1 3的量加入硫酸，120°C處理1小時(shí)，常規(guī)離心，上清液即為含糖濃度以質(zhì)量體積比計(jì)為15% 35%的木質(zhì)纖維素原料水解液。
7.如權(quán)利要求6所述陰溝腸桿菌溶解亞種在制備2，3-丁二醇中的應(yīng)用，其特征在于 所述淀粉類(lèi)原料選淀粉或木薯粉；所述木質(zhì)纖維素原料選木頭、玉米芯或秸稈。
8.如權(quán)利要求6所述陰溝腸桿菌溶解亞種在制備2，3-丁二醇中的應(yīng)用，其特征在于 所述淀粉類(lèi)原料水解液中糖濃度以質(zhì)量體積比計(jì)為25% 35%;所述木質(zhì)纖維素原料水解液中糖濃度以質(zhì)量體積比計(jì)為25% 30%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM)及其在制備2，3-丁二醇中的應(yīng)用。該陰溝腸桿菌溶解亞種保藏號(hào)為CGMCC No.4230。本發(fā)明的菌株能夠利用五碳糖、六碳糖、糖蜜、淀粉類(lèi)原料水解液、木質(zhì)纖維素原料水解液，具有轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)物濃度高，底物譜廣等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所述操作方法簡(jiǎn)單，成本較低，效率高，發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵2，3-丁二醇產(chǎn)量可達(dá)到125～162g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到理論轉(zhuǎn)化率的90～95％，2，3-丁二醇最大生產(chǎn)率為4.1g/(L·h)，極具工業(yè)化推廣應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102226159SQ20111011944
公開(kāi)日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月29日
發(fā)明者李理想, 王愛(ài)龍, 許平, 馬翠卿 申請(qǐng)人:山東大學(xué)