專利名稱：：大腸桿菌及其基因工程菌在制備抗肝癌實(shí)體瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及大腸桿菌及其基因工程菌的用途，具體是大腸桿菌及其基因工程菌在制備抗肝癌實(shí)體瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤的發(fā)生率高，其中，主要以實(shí)體瘤為主。肝癌作為高發(fā)性惡性腫瘤，因其惡性程度高、預(yù)后差，被稱為"癌中之王"[']，居惡性腫瘤病死率的第二位[2]。目前，臨床肝癌等實(shí)體瘤的治療效果不理想，其主要原因是源頭創(chuàng)新藥物和治療手段少，治療針對性差，還存在著復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高等問題。因此，研究開發(fā)針對肝癌等實(shí)體瘤治療的新技術(shù)、新方法具有十分重要的意義。目前，細(xì)菌作為腫瘤靶向性載體和細(xì)胞因子用于腫瘤治療已有報(bào)道，研究較多的細(xì)菌有梭狀芽孢桿菌屬、雙歧桿菌屬、沙門菌屬等厭氧菌屬。其抗腫瘤的機(jī)制有(1)細(xì)菌所含的脂多糖(LPS)能刺激白細(xì)胞增殖分化，誘發(fā)TNF-a等細(xì)胞因子的釋放，從而大大加強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力。(2)細(xì)菌大量聚集于腫瘤部位，引起局部炎癥反應(yīng)，濃集大量特異性與非特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞。(3)細(xì)菌毒性產(chǎn)物破壞腫瘤微環(huán)境。(4)細(xì)菌分泌的蛋白水解酶等破壞了腫瘤細(xì)胞[7]。(5)感染誘導(dǎo)了與腫瘤抗原有關(guān)的交叉免疫以及機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。(6)大腸桿菌在有氧和無氧環(huán)境中均可生存，能在腫瘤組織中優(yōu)先復(fù)制增殖，與腫瘤組織競爭微環(huán)境中的營養(yǎng)素和生長因子。但是，厭氧芽孢桿菌具有在腫瘤壞死部位聚集的特性[8]，但腫瘤太小則無法吸引細(xì)菌聚集[9]。研究表明，厭氧芽孢桿菌聯(lián)合化學(xué)治療比單用細(xì)菌或化療有更好的抗腫瘤效果[1()]，但由于厭氧芽孢桿菌的毒性，實(shí)驗(yàn)動物的存活率很低[11]。1967年開始實(shí)施的人類臨床實(shí)驗(yàn)，因病人注射厭氧芽孢桿菌后l周內(nèi)出現(xiàn)發(fā)燒和菌血癥而不得不使用抗生素治療，且大多數(shù)病人的腫瘤沒有消退的跡象，從而導(dǎo)致臨床效果的缺乏而失敗。與厭氧芽孢桿菌相似，雙歧桿菌能聚集在直徑1.5cm或更大的腫瘤內(nèi)，在直徑小于1.5cm的腫瘤中卻很難聚集，且雙歧桿菌沒有抗腫瘤的作用['2]。有研究者將pBLES100載體轉(zhuǎn)化雙歧桿菌，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌也具有親腫瘤性，而正常組織均沒有細(xì)菌生長。攜帶血管內(nèi)皮抑制素基因的雙歧桿菌也能聚集在腫瘤內(nèi)，亦有抑制腫瘤生長[13]、延長荷瘤小鼠壽命[14]的作用。目前最大的問題是雙歧桿菌作為載體，其質(zhì)粒相對較少，且提取困難，其24個分型中僅有5型發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒存在，在發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒中，大小都在8kb以上，也不適合于作載體的構(gòu)建[15'16]，成為其應(yīng)用于基因治療的瓶頸。與上述2種細(xì)菌相比，沙門氏菌具有許多優(yōu)點(diǎn)沙門氏菌是兼性厭氧細(xì)菌，不僅可以在腫瘤壞死區(qū)域生長，還可以在活的腫瘤組織中生長；它很容易攜帶外源性基因；其親腫瘤性不依賴于腫瘤的大小[17]，并通過多種機(jī)制[18]抑制多種腫瘤的生長。然而，沙門氏菌的毒性較3大。沙門氏菌釋放的脂多糖會誘導(dǎo)機(jī)體TNF-a、IL-1、IFN-Y等細(xì)胞因子的表達(dá)，誘導(dǎo)敗血癥休克的發(fā)生[19'2()]。可見其臨床應(yīng)用前景不容樂觀。細(xì)胞因子(cytokine)具有殺傷腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞的特性，因而成為腫瘤治療的另一熱點(diǎn)。細(xì)胞因子作為惡性腫瘤生長的直接調(diào)節(jié)劑，己在腫瘤的體外實(shí)驗(yàn)[28]、動物實(shí)驗(yàn)[29—31]治療取得了顯著效果而被引入臨床治療[31—35]。其作用機(jī)制包括(1)直接干擾細(xì)胞生長，殺傷腫瘤細(xì)胞；(2)通過激活機(jī)體免疫系統(tǒng)(如NK細(xì)胞、腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞等)殺傷腫瘤細(xì)胞；(3)通過抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，控制腫瘤的發(fā)展；(4)破壞腫瘤組織血液供應(yīng)；(5)增加放療及化療敏感性、降低其毒性、逆轉(zhuǎn)或抑制腫瘤細(xì)胞多藥耐藥等，維持機(jī)體正常功能。目前被認(rèn)為有應(yīng)用前景或己經(jīng)在臨床試用的抗癌細(xì)胞因子主要有腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、干擾素-a(IFN-a)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)等。TNF-a主要由激活的巨噬細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生，主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、破壞腫瘤組織血管、介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)作用、放化療的增敏作用等，產(chǎn)生抗腫瘤作用，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子之一[36]。IFN-a由白系白細(xì)胞產(chǎn)生，在臨床上對各類腫瘤都有顯著作用。主要通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖和分化(阻止細(xì)胞由G0—Gl)，促進(jìn)部分惡性細(xì)胞表型的逆轉(zhuǎn)發(fā)揮抗腫瘤作用。IL-2是由激活的T淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的一種免疫調(diào)節(jié)劑。目前，使用高劑量的IL-2治療腫瘤，已經(jīng)在多種動物模型上取得成功，并且能使患者體內(nèi)一些轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、腎細(xì)胞肉瘤、非霍奇金淋巴瘤均明顯消退[37]，有效地恢復(fù)機(jī)體的免疫功能，減少放療、化療的副作用。IL-2抗腫瘤效果明確，主要通過增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的免疫反應(yīng)性實(shí)現(xiàn)(1)刺激T細(xì)胞進(jìn)人細(xì)胞分裂周期，增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷活性和分泌IFN-Y,TNF,CSF等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)并增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc)活性，從而產(chǎn)生明顯的抗腫瘤效果。(2)促進(jìn)NK細(xì)胞的生長增殖，從而發(fā)揮其殺傷腫瘤細(xì)胞作用[381。此外，IL-2還能促進(jìn)NK細(xì)胞分泌IFN-Y、IL-2、TNF[39]，增加其表達(dá)IL-2R等。(3)促進(jìn)LAK、TIL細(xì)胞的體外存活、擴(kuò)增及活化淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞。LAK只識別腫瘤抗原，因而具有殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)，而對宿主正常細(xì)胞沒有影響。(4)促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和表達(dá)，增強(qiáng)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的吞噬能力。(5)誘導(dǎo)NO合成。應(yīng)用細(xì)胞因子治療腫瘤具有療效緩慢而持久、無簡單的劑量-反應(yīng)關(guān)系、延長患者壽命、副作用小而短暫、細(xì)胞因子的聯(lián)合治療優(yōu)于單一治療、局部應(yīng)用優(yōu)于全身應(yīng)用等特點(diǎn)[4()'41]。然而，市售的細(xì)胞因子帶有雜質(zhì)，反復(fù)多次給腫瘤患者或動物模型注射大劑量細(xì)胞因子常引起諸多毒副作用，成為其臨床應(yīng)用的最大障礙。若采取有效的方法將細(xì)胞因子應(yīng)用于腫瘤局部，必將能避免或大大減少其不良反應(yīng)的發(fā)生，加快其臨床應(yīng)用進(jìn)程。研究表明，細(xì)菌作為DNA或基因表達(dá)載體，能與表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)[42]，細(xì)胞因子的聯(lián)合應(yīng)用優(yōu)于單用[41]。為突破細(xì)菌抗腫瘤應(yīng)用的瓶頸，克服細(xì)胞因子抗腫瘤治療的諸多毒副作用，充分發(fā)揮細(xì)菌本身和細(xì)胞因子的雙重抗腫瘤作用及兩者的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。另外，腫瘤組織內(nèi)部特殊的病理生理特點(diǎn)和厭氧菌本身的生物學(xué)特性為利用厭氧菌進(jìn)行腫瘤治療研究提供了有力的科學(xué)依據(jù)(1)厭氧菌對腫瘤組織的靶向性較好；(2)厭氧菌在瘤內(nèi)較難被免疫系統(tǒng)識別清除[3];(3)厭氧菌在瘤內(nèi)比正常組織具備更好的繁殖條件和能力[4];(4)一些厭氧菌本身就具有溶瘤作用[5'6];(5)厭氧菌具備較好地表達(dá)外源基因的能力；(6)厭氧菌比病毒等載體的安全性較高；(7)厭氧菌所致的繼發(fā)感染可通過使用抗生素得到較好的控制；(8)作為基因轉(zhuǎn)移載體，厭氧菌的細(xì)胞組織轉(zhuǎn)移范圍比病毒載體更為廣泛。厭氧菌作為腫瘤靶向性載體用于治療腫瘤已曰益受到青睞。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供大腸桿菌及其基因工程菌的新用途，即在制備抗肝癌實(shí)體瘤藥中的應(yīng)用。大腸桿菌或其基因菌工程的用途，它是將大腸桿菌或其基因工程菌或是大腸桿菌和其基因工程菌混合制成針劑，定向接種在肝癌實(shí)體瘤的瘤組織內(nèi)，以治療肝癌。其注射劑量每個實(shí)體瘤為0.05ml0.lml。本發(fā)明將大腸桿菌或其基因工程菌用于制備抗肝癌實(shí)體瘤藥的方法是采用RT-PCR分別擴(kuò)增人或動物的IL-2、IFN-a、TNF-a等細(xì)胞因子或免疫因子的cDNA，克隆到pMD18-T載體中，經(jīng)限制性酶切分析、測序證實(shí)擴(kuò)增基因序列的IH確性。再將上述基因片段分別克隆到表達(dá)載體pGEX-4T-l中，并轉(zhuǎn)化到非致病性大腸桿菌中，分別建立人或動物IL-2、IFN-a、TNF-a等細(xì)胞因子或免疫因子的基因大腸桿菌，并將上述大腸桿菌及其基因工程菌制成1.0xl03~1.0xlO'Q/ml的懸液，將不同數(shù)量的上述細(xì)菌或基因工程菌分別或按一定比例混合后，制成針劑抗肝癌實(shí)體瘤的藥物，定向接種肝癌實(shí)體瘤的瘤組織內(nèi)。經(jīng)在SD大鼠動物肝癌模型上試驗(yàn)應(yīng)用，結(jié)果表明注射l-3w后，解剖可見癌腫消失或減少，說明大腸桿菌及其基因工程菌制劑是一種理想的抗肝癌實(shí)體瘤藥物。所述的大腸桿菌與基因工程菌的混合，其混合比例為大腸桿菌基因工程菌=1:1本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于應(yīng)用大腸桿菌及其基因工程菌制備抗肝癌實(shí)體瘤藥物以治療肝癌實(shí)體瘤，有利于充分發(fā)揮細(xì)菌和細(xì)胞因子的雙重抗腫瘤作用及其協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。上述細(xì)菌及其基因工程菌的局部應(yīng)用，有利于減少或避免細(xì)菌與細(xì)胞因子全身應(yīng)用的不良反應(yīng)。該方法具有簡單而易行等特點(diǎn)，是一種較理想的抗肝癌等實(shí)體瘤治療的藥物，可在臨床上應(yīng)用。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。1.1、大腸桿菌或基因工程菌抗實(shí)體瘤藥物的制備進(jìn)行大腸桿菌培養(yǎng)，采用RT-PCR分別擴(kuò)增人或動物的IL-2、IFN-a、TNF-a等細(xì)胞因子或免疫因子的cDNA，再將上述基因片段分別克隆到表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，分別建立人或動物IL-2、IFN-a、TNF-a等細(xì)胞因子或免疫因子的基因工程菌。將上述細(xì)菌、工程菌制成1.0xl0Ll.0xl(^/ml的懸液。將不同數(shù)量的上述細(xì)菌或基因工程菌分別和/或按一定比例混合后，定向接種于肝癌等實(shí)體瘤模型動物的瘤組織內(nèi)，每只動物實(shí)體瘤內(nèi)注射0.05ml~0.1'ml;1.2、動物肝癌模型建立和分組試驗(yàn)將Walker256細(xì)胞接種于SD大鼠皮下，待實(shí)體瘤形成后，無菌操作將Walker256實(shí)體瘤取出，切成約1.5mmxl.5mm大小的瘤塊備用。取受試SD大鼠40只(80100g，雌雄各半)，用戊巴比妥鈉麻醉后，消毒大鼠胸腹部，無菌打開腹腔，暴露肝左葉，用手術(shù)大片做一切口，將上述瘤塊植入肝內(nèi)，止血，關(guān)閉腹腔；同時，將大鼠分為生理鹽水組、大腸桿菌(權(quán)4)高、中、低劑量組(分別接種細(xì)菌數(shù)為I.OXIO8、1.0XI()6和1.0X103個)。于SD大鼠肝癌模型制作后的第6天，麻醉模型大鼠，行無菌操作，打丌腹腔，將大腸桿菌藥物定向接種于肝癌組織內(nèi)，關(guān)閉腹腔；1.3、結(jié)果細(xì)菌接種后的第12天，處死動物，取出瘤組織，稱重。結(jié)果表明，大腸桿菌具有劑量依賴性的抗肝癌作用(見表l):表l大腸;汗菌44104對SD大鼠Walker256肝癌的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>P<0.05"P〈0.01，與生理鹽水組比。權(quán)利要求1、大腸桿菌及其基因工程菌在制備抗肝癌實(shí)體瘤藥物中的應(yīng)用。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，是將大腸桿菌或其基因工程菌或其混合物制成針劑。全文摘要本發(fā)明公開了大腸桿菌及其基因工程菌的新用途，即在制備抗肝癌實(shí)體瘤藥物中的應(yīng)用，它是將大腸桿菌或其基因工程菌或大腸桿菌及其基因工程菌的混合物制成針劑，定向接種在肝癌實(shí)體瘤的瘤組織內(nèi)，以治療肝癌實(shí)體瘤。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是有利于充分發(fā)揮細(xì)菌和細(xì)胞因子的雙重抗腫瘤作用及其協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。同時，有利于減少或避免細(xì)菌與細(xì)胞因子全身應(yīng)用的不良反應(yīng)，且該方法簡單、易行，是一種較理想的抗肝癌實(shí)體瘤的藥物。文檔編號A61K35/66GK101444538SQ20081007389公開日2009年6月3日申請日期2008年11月8日優(yōu)先權(quán)日2008年11月8日發(fā)明者周巧林,慶徐,徐亞娟,戴支凱,李利亞,梁榮感申請人:桂林醫(yī)學(xué)院