專利名稱：一株溫控共表達外源基因的重組大腸桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株基因重組大腸桿菌及其應用，尤其涉及一株溫控共表達外源基因的
重組大腸桿菌及其在制備N-乙酰神經(jīng)氨酸中的應用。
背景技術：
唾液酸(Sialic acid)是神經(jīng)氨酸及其衍生物的總稱，是一類含有羧棊的九碳氨 基糖類物質，其生物功能與重要的生理和病理現(xiàn)象密切相關，具有廣泛的應用前景 [Traveling, 1998: Schauer, 2000。而N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetyl-D-neuraminic acid, Neu5Ac)是分布最廣的一類唾液酸，其本身及其類似物有重要的藥用前景。其中 N-乙酰神經(jīng)氨酸的結構類似物，扎納米韋(Zanamivir)已于1995年被批準用于商業(yè)化 的抗流感病毒藥物Dreitlein et al. , 2001。
唾液酸生產(chǎn)方法包括提取、化學合成、發(fā)酵法和酶催化法。從禽蛋中的蛋黃膜和臍 帶中或牛乳乳清和酪蛋白提取唾液酸，由于含量較低，成分多樣，分離和提純過程比較 復雜，收率較低，因此難以實施工業(yè)化；化學合成唾液酸至少要經(jīng)過十幾步反應，形成 大量的中間產(chǎn)物，這給唾液酸的后分離過程造成很大困難李連生等2002；某些大腸 桿菌菌株在生長過程中能自身合成唾液酸的同聚合體——多聚唾液酸，經(jīng)酸或酶水解后 即可得到唾液酸單體MamoruK., 1993，但產(chǎn)量較低；酶催化由于其高效性和選擇性， 更適用于工業(yè)化合成精細化合物。 .
以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸為底物，N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(EC 4.1.3.3)的逆 反應被應用于酶催化合成N-乙酰神經(jīng)氨酸，但此過程中酶純化過程相對復雜，N-乙酰 甘露糖胺價格較貴。堿法異構化和N-乙酰葡萄糖胺異構酶方法實現(xiàn)了相對便宜的N-乙 酰葡萄糖胺到N-乙酰甘露糖胺的轉化，進一步降低了生產(chǎn)成本Maru, 1998。但堿法 異構化的處理過程復雜，環(huán)境污染和底物分解等方面的問題Blayer， 1999；而使用 N-乙酰葡萄糖胺異構酶催化，需要ATP輔因子的參與，使得反應成本過高，也限制了酶 催化的工業(yè)化發(fā)展。
由于完整休止細胞具有高能磷酸化合物的合成能力，使全細胞催化成為該領域研究 的熱點。首次報道的使用全細胞進行N-乙酰神經(jīng)氨酸合成，是利用異源表達來源于集 胞藻(5y"ec/ oc7"issp. ) PCC6803的sZrl975基因(該基因表達的酶具有GlcNAc異 構酶功能)和來源于￡sc/ eric/u'3 co/i K-l的N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因的重組大腸 桿菌細胞為催化劑，利用谷氨酸棒桿菌合成輔因子和底物磷酸烯醇式丙酮醆，在葡萄糖 和N-乙酰葡萄糖胺存在的條件下，使用三種完整細胞轉化生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸，但轉 化率僅達到5%Tabata， 2002。
2007年Lee等利用來源于大腸桿菌(^sc力ehc力h coh') K12的唾液酸醛縮酶和來 源于^7s力朋/ s sp. CH1的N-乙酰葡萄糖胺異構酶分別利用商品化的pET載體系統(tǒng)在大 腸桿菌中分別進行表達，以兩種混合細胞為催化劑，以N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸為底 物，催化合成N-乙酰神經(jīng)氨酸。由于該催化過程中使用的異構酶與前面報道的酶學性 質相比，ATP需求量低，酶活性高，才使得最高產(chǎn)率達到10. 2 g/l*h，接近之前報道 的酶催化效率Lee et al， 2007。
3中國發(fā)明專利(ZL2004100242223)報道了利用施氏假單胞菌SDM完整細胞與表達 有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的重組大腸桿菌￡ coh' BL21 (DE3) /pET15b-nanA為催化劑， 以乳酸鈉和化學異構得到的N-乙酰甘露糖胺為底物，合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的生產(chǎn)工藝， 但是該方法需要用堿法異構化及兩種細胞的參與。
綜上所述，全細胞催化合成N-乙酰神經(jīng)氨酸是工業(yè)化合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的發(fā)展 方向。但是目前全細胞催化合成N-乙酰神經(jīng)氨酸存在缺陷(1)由于細胞膜這層天然屏 障對底物的阻礙作用，與酶催化相比，底物轉化率相對比較低，Chen， 2007。(2)完 整細胞雖然處于休止狀態(tài)，但仍有某些酶促反應，從而造成了催化過程中副產(chǎn)物的產(chǎn)生Ishigeetal， 2005。(3)常用誘導劑IPTG的毒性和較貴的價格，不適用于醫(yī)藥化 合物的規(guī)?；a(chǎn)Hannig and Makrides， 1998。經(jīng)檢索，使用溫度誘導共表達N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶和N-乙酰葡萄糖胺異構酶的全細胞催化生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的方 法及相關催化過程尚未見報道。
參考文獻
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發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有催化合成N-乙酰神經(jīng)氨酸方法中，重組型催化劑不宜規(guī)?；苽?， 并且制備過程中會引入有毒物質的缺陷，以及全細胞轉化率低，成本高，后處理麻煩， 難以大規(guī)模生產(chǎn)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一株重組大腸桿菌，即一株溫控共 表達外源基因的重組大腸桿菌及其在制備N-乙酰神經(jīng)氨酸中的應用。本發(fā)明所述的菌 株含有以安全無毒、操作方便的溫度誘導的強啟動子，通過溫度控制即可同時表達兩步 催化所用的兩個酶N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶和N-乙酰葡萄糖胺異構酶，從而方便地得 到細胞作為催化劑。使用該催化劑能夠實現(xiàn)在不額外加入ATP的條件下，使用相對較便 宜的底物N-乙酰葡萄糖胺推動反應進行，高效合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的同時保證了較簡單的后處理過程。
本發(fā)明公開了一種基因重組大腸桿菌及其應用(如圖l所示)。所述菌株包括構建 的基因突變菌株和攜帶有兩種酶基因(基因A和基因B)的溫控型載體；其中所述基 因突變株為敲除了 N-乙酰葡萄糖胺磷酸轉運系統(tǒng)的菌株，該菌株具有弱化的伴隨磷酸 化過程的N-乙酰葡萄糖胺攝入胞內(nèi)能力；所述基因A為具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活 性的基因；所述基因B為具有N-乙酰葡萄糖胺異構酶活性的基因。
上述基因重組大腸桿菌構建過程包括溫控型重組載體構建和菌株改造兩部分。重 組載體以pBV220 (病毒學報，第6巻，第2期，111-116頁)為出發(fā)載體，在P^啟動 子下游順序插入了 N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(Neu5Ac aldolase)基因和加有SD序列的 N-乙酰葡萄糖胺異構酶(GlcNAc2-印imerase)基因，得到溫控型雙順反子載體。插入 基因來源于已報道相關功能基因或數(shù)據(jù)庫注釋具有相應功能的基因，其中所述的N-乙 酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因優(yōu)選來源于豬、鼠或大腸桿菌的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因， 所述的N-乙酰葡萄糖胺異構酶基因優(yōu)選來源于藍細菌的N-乙酰葡萄糖胺異構酶基因。 上述載體的宿主為N-乙酰葡萄糖胺特異性的磷酸轉運系統(tǒng)(GlcNAc-specificPTS)基 因朋^E缺失的大腸桿菌K12ATCC 25404。通過兩次同源重組，得到具有穩(wěn)定遺傳特性 的該突變株大腸桿菌(^sc力en'c/w'3coh') DT26,而且不會引入額外的抗性基因。將上 述構建載體轉化進入上述構建的N-乙酰葡萄糖胺磷酸轉運系統(tǒng)缺失的大腸桿菌，即得 溫控共表達外源基因的重組大腸桿菌，其中所述構建的代表菌株為大腸桿菌
(^sc力aric力/a c。力')DT26 (pBVNsS)。
本發(fā)明所述溫控共表達外源基因的重組大腸桿菌，其特征在于該菌株命名為大腸 桿菌(^sc力en'c力/a co7" DT26 (pBVNsS);所述菌株已于2009年1月12日保藏于"中 國典型培養(yǎng)物保藏中心"(武漢大學，中國武漢)，保藏號為CCTCC NO: M 209018。
上述溫控共表達外源基因的重組大腸桿菌菌株的基因型為Zi朋^: :FRT;其含有溫 控共表達載體即構建質粒pBVNsS。
上述質粒pBVNsS是以載體pBV220為出發(fā)載體，在PA啟動子下游順序插入了 N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(Neu5Ac aldolase)基因朋M和加有SD序列的N-乙酰葡萄糖胺 異構酶(GlcNAc 2-印imerase)基因Wrl975，具有雙順反子片段/ aM-SD-sZrl975。
上述大腸桿菌(^sc/ eiu'c力j'a co乃')DT26 (pBVNsS), CCTCC NO: M 209018構建過 程包括溫控型重組載體構建pBVNsS和抅建菌株大腸桿菌(&c力eri'c/^'acoh') DT26兩 部分。重組載體構建以pBV220為出發(fā)載體，在PA啟動子下游順序插入了N-乙酰神經(jīng) 氨酸醛縮酶(Neu5Ac aldolase)基因和加有SD序列的N-乙酰葡萄糖胺異構酶
(GlcNAc 2-印imerase)基因slrl975，得到溫控型雙順反子載體(如圖2所示);其 中所述N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因y^M優(yōu)選來源于大腸桿菌K12 ATCC 25404的N-乙 酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因，所述N-乙酰葡萄糖胺異構酶基因Wrl975優(yōu)選來源于集胞藻
(5)77ec力oc;^y" sp. ) PCC6803的N-乙酰葡萄糖胺異構酶基因。上述載體的大腸桿菌 宿主為N-乙酰葡萄糖胺特異性的磷酸轉運系統(tǒng)(GlcNAc-specific PTS)基因"a^E缺 失的大腸桿菌K12。通過進行一次"a^E側翼同源重組和一次FRT同源重組得到具有穩(wěn) 定遺傳特性的該突變株大腸桿菌(fsc力en'c/u'acWi) DT26,而且不會引入額外的抗性 基因(如圖3所示)。其中，第一次同源重組前制備帶有重組酶的電轉化感受態(tài)菌體的 誘導過程為大腸桿菌K12在37'C培養(yǎng)誘導1 3小時，加入L-阿拉伯糖濃度為0. 2 10 g/L，誘導2 7小時，收集菌體制作電轉感受態(tài)。將構建載體轉化進入上述構建的 N-乙酰葡萄糖胺磷酸轉運系統(tǒng)缺失的大腸桿菌，即得到本發(fā)明所述的菌株——溫控共表 達外源基因的重組大腸桿菌。該菌株培養(yǎng)溫度為16 45'C,可在含有氨節(jié)青霉素的LB 或LB無機鹽培養(yǎng)基中生長。 '
其中，制備帶有重組酶的電轉化感受態(tài)時，誘導前菌株培養(yǎng)時間優(yōu)選1.5 2小時， 加入L-阿拉伯糖濃度優(yōu)選1 5 g/L,誘導時間優(yōu)選4. 5 5. 5小時。
其中，上述的LB培養(yǎng)基配方為每升中加入5g酵母粉，10 g蛋白胨，10gNaCl， 調(diào)節(jié)pH值為7.5, 12rC濕熱滅菌20分鐘。LB加無機鹽培養(yǎng)基配方為每升中加入5 g 酵母粉，10 g蛋白胨，0.5 g NaCl， 12.8 g Na風，3 g KH2P04， 1 g NH4C1， 0.24 g MgS。4和0, Oil g CaCl2，調(diào)節(jié)pH至7.0， 115。C濕熱滅菌20分鐘。
進一步的，本發(fā)明所述溫控共表達外源基因的重組大腸桿菌的培養(yǎng)溫度優(yōu)選30 42。C。
本發(fā)明所述大腸桿菌(￡^c/ en'c/w'3 DT26 (pBVNsS) CCTCC No. M 209018
具有如下生物學特性好氧或兼性好氧，有周生鞭毛，不形成孢子，革蘭氏陰性。在營 養(yǎng)瓊脂上的菌落呈光滑、低凹、潮濕和灰白，表面有光澤、邊緣較整齊。化能有機營養(yǎng)， 具有呼吸和發(fā)酵代謝。發(fā)酵D-葡萄糖、其他糖類化合物和多元醇，產(chǎn)氣。能利用乙酸 為唯一碳源，不能利用檸檬酸鹽。
本發(fā)明所述溫控共表達外源基因的重組大腸桿菌即大腸桿菌(fsc/zeric力j'a co力') DT26 (pBVNsS) CCTCC No. M 209018作為催化劑在全細胞催化制備N-乙酰神經(jīng)氨酸
中的應用。
其中所述溫控共表達外源基因的重組大腸桿菌用于制備全細胞催化劑的條件為
誘導前培養(yǎng)溫度20 35"，誘導前培養(yǎng)時間0.5 5小時；誘導溫度37 45'C,誘導時 間4 30小時，搖床轉速150 250轉/分鐘，發(fā)酵罐氧溶解度15 45%;使用上述全細 胞催化劑制備N-乙酰神經(jīng)氨酸的反應體系及反應條件是反應體系中全細胞催化劑N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶酶活性為20 40 U，相應的N-乙酰葡萄糖胺異構酶酶活性為4 8 U， N-乙酰葡萄糖胺濃度為200 1000mM,丙酮酸濃度為200~1500 mM,磷酸緩沖液濃 度40 80mM， Mg"濃度10 30 mM，反應體系中添加0. l 10 g/L Triton X-'l00、 0. l 10 g/L SDS、 0.1 10 g/L CTAB或0. 1 10 g/L CHAPs表面活性劑，反應pH值為7 7.8，反應溫度為25 37°C，反應時間為12 72小時，反應過程使用往復式搖床或控 制發(fā)酵罐轉速使氧溶解度為30 70%。
進一步的，本發(fā)明所述大腸桿菌(foc/ eWc/ j'acoh') DT26 (pBVNsS) CCTCC No. M 209018作為催化劑在制備N-乙酰神經(jīng)氨酸中的應用的具體方法和步驟是
(1) 在無菌條件下將大腸桿菌(^sc力en'c力ia co i) DT26 (pBVNsS) CCTCC No. M 209018接種到含有0.5 1.5 g/L氨芐青霉素的LB中，置20 35。C下，振蕩培 養(yǎng)8 30小時，得到種子細胞。
(2) 用(1)中的種子細胞，無菌條件下以體積比0.5M 2X的接種量接種于LB或LB 無機鹽培養(yǎng)基，于20 35。C培養(yǎng)0.5 5小時。
(3) 升溫至37 45°C，以搖床轉速150 250轉/分鐘，發(fā)酵罐氧溶解度15 45%的條
件進行誘導4 30小時。 '(4) 將上述培養(yǎng)物以8000轉/分鐘離心5分鐘，并用PBS緩沖液清洗兩遍，即得到所 述溫控共表達外源基因的重組大腸桿菌的全細胞催化劑，于4'C保藏備用。
(5) 將上述全細胞催化劑溶解于破碎緩沖液中，調(diào)節(jié)ODe2。至30，超聲波破碎菌體后 進行N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶和N-乙酰葡萄糖胺異構酶酶活測定。
(6) 使用上述全細胞催化劑制備N-乙酰神經(jīng)氨酸的反應體系及反應條件是反應體 系中全細胞催化劑N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶酶活性為20~40 U，相應的N-乙酰葡 萄糖胺異構酶酶活性為4 8U， N-乙酰葡萄糖胺濃度為200 1000raM，丙酮酸濃 度為200 1500 mM，磷酸緩沖液濃度40 80 mM， Mg"濃度10 30 mM，反應體 系中添加0.1 10 g/L Triton X-100、 0.1 10 g/L SDS、 0.1 10 g/L CTAB 或0.1 10 g/L CHAPs表面活性劑，反應pH值為7 7. 8，反應溫度為25 37°C， 反應時間為12 72小時，反應過程使用往復式搖床或控制發(fā)酵罐轉速使氧溶解 度為30 70%。
(7) 反應產(chǎn)物提取使用離子交換樹脂從反應液中提取，經(jīng)過濃縮至100 200 g/L 后，用2 10倍體積冰乙酸于4'C沉淀得到產(chǎn)品結晶即為N-乙酰神經(jīng)氨酸。
其中，步驟(1)中所述的種子細胞培養(yǎng)和制備催化劑細胞的優(yōu)選溫度是27 32'C; 氨芐青霉素的濃度優(yōu)選為0.8 1.3 g/L，種子細胞培養(yǎng)時間優(yōu)選是15 25小時。
其中，步驟(2)中所述的制備催化劑細胞中，優(yōu)選種子細胞接種量為0.8% 1.2%， 培養(yǎng)溫度27 32°C，培養(yǎng)時間優(yōu)選1. 5~2. 5小時。
其中，步驟(3)中所述的誘導過程中，誘導溫度優(yōu)選為42 45。C,誘導時間優(yōu)選 為4. 5 5. 5小時。
其中，步驟(1)和(2)中使用的LB培養(yǎng)基配方為每升中加入5g酵母粉，10 g蛋白胨，10 g NaCl，調(diào)節(jié)pH值為7.5， 12rC濕熱滅菌20分鐘。 .
其中，步驟(2)中使用的LB無機鹽培養(yǎng)基配方為每升中加入5g酵母粉，10 g 蛋白胨，0. 5 g NaCl, 12.8 g Na2HP04, 3 g KH2P04， 1 g NH4C1， 0.24 g MgS(X和0.011 g CaCl"調(diào)節(jié)pH至7.0， 115。C濕熱滅菌20分鐘。
其中，步驟(5)中所用破碎緩沖液為60 mM磷酸緩沖液(pH 7.4)和100g/L甘油。
其中，步驟(5)中所述N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶酶活測量反應體系為20mM磷酸 鉀緩沖液(pH 7.4) 350 ii 1， 100 ul N-乙酰神經(jīng)氨酸(5 mg/ml), 50 ul酶液。酶 活測量反應條件為37。C反應10 min，加0. 5 ml 2， 4 二硝基苯肼(DNP)， 20 min后加 5 ml NaOH (0.4 M)顯色。于520 nm比色。丙酮酸標準曲線配制10 raM的丙酮酸鈉 溶液25ml，分別稀釋為O. 1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 l.OmM六種不同濃度。將測酶活 反應體系中的50 ul酶液換成50 "1不同濃度的丙酮酸鈉溶液。反應條件與測酶活 條件相同。比色法測定丙酮酸標準曲線如圖4所示。酶活定義為每分鐘分解N-乙酰神 經(jīng)氨酸生成l Pmol丙酮酸所需酶量為一個酶活單位。
其中，步驟(5)中N-乙酰葡萄糖胺異構酶酶活測量反應體系及條件為0.1 M Tris-HC1 (pH 7.5)， 10 raM MgCl" 50 mM ManNAc， 5 mM ATP和20 ul酶液。3(TC反 應30分鐘后，沸水浴5分鐘終止反應，12，000轉/分鐘離心，取上清用高效液相色譜 (HPLC)分析N-乙酰葡萄糖胺濃度，N-乙酰葡萄糖胺標準曲線如圖5所示。酶活定義 每分鐘轉化N-乙酰甘露糖胺生成l umol N-乙酰葡萄糖胺所需酶量定義為一個酶活單位(U)。
其中，步驟(6)所述反應體系中，丙酮酸濃度優(yōu)選為600 800 mM， N-乙酰葡萄 糖胺濃度優(yōu)選為800 1000 mM，磷酸鹽濃度優(yōu)選為60 80 mM, Mg"濃度優(yōu)選為15 30 mM，反應pH值優(yōu)選為7.2 7.4，反應溫度優(yōu)選為30 35°C,發(fā)酵罐氧溶解度優(yōu)選控制 在40% 70%，表面活性劑優(yōu)選濃度為0. 2 0. 6 g/L的CTAB。
其中，步驟(6)和(7)中涉及的采用HPLC分析的方法及條件為樣品沸水浴IO 分鐘后，12，000轉/每分鐘，離心20分鐘，取離心液上清，用流動相稀釋至合適倍數(shù)， 用0. 22 u m濾膜過濾，濾過液進行HPLC檢測。釆用BioRad Aminex HPX-87H (300X 7. 8 mm)色譜柱對樣品進行分析方法及條件為柱溫為55。C，以10 mM硫酸水溶液為流動 相，流速為0. 4 ml/min，在Agilent 1100高效液相色譜儀上運行，進樣量5 lU,檢 測器為示差折光檢測器(RID)。
用HPLC分析得到的丙酮酸、N-乙酰神經(jīng)氨酸、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰甘露糖胺 的標準曲線如圖5所示。HPLC分析轉化液圖譜如圖6所示。
應用本發(fā)明所述溫控共表達外源基因的重組大腸桿菌即大腸桿菌(^&c力e/v'"^ co7/) DT26 (pBVNsS) CCTCC No. M 209018在規(guī)?；呋a(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氮酸過程 中具有催化劑制備安全方便，催化過程操作簡單，價格便宜，效率較高，易于提取等特 點，具體為
(1) 本發(fā)明首次構建了可同時表達N-乙酰神經(jīng)氦酸醛縮酶和N-乙酰葡萄糖胺2-異 構酶的重組質粒pBVNsS。使用該質粒僅通過溫度控制就實現(xiàn)在一個菌體細胞內(nèi) 進行兩種酶的高表達。與同類常用IPTG等化學藥物誘導表達的催化劑相比，誘 導不需要外加其它物質，更安全，操作更方便。并且僅培養(yǎng)誘導一次就可以得 到兩步催化中的酶，
(2) 首次使用pKD46系統(tǒng)對大腸桿菌的N-乙酰葡萄糖胺磷酸轉運系統(tǒng)的基因/7a^E 進行敲除，得到菌株大腸桿菌(^ c力eric/ " co乃')DT26，并應用于以過量N-乙酰葡萄糖胺為底物的催化。從菌株基因水平上對全細胞催化劑進行改造，使 該菌株具有更穩(wěn)定的催化特性。
(3) 首次構建了含有共表達N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶和N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶載 體的"a5E基因敲除的大腸桿菌菌株，并直接使用誘導后的該菌株作為全細胞催 化劑。酶以全細胞的形式行使功能，有細胞膜保護，催化過程中比純酶更穩(wěn)定， 適用于重復使用。而且全細胞可以通過簡單的離心方法和過濾方法進行分離， 易于后處理。
(4) 生產(chǎn)全細胞催化劑菌株的培養(yǎng)基簡單、成本低，均為常規(guī)有機碳氮源和無機鹽。
(5) 本發(fā)明的生物催化劑能以丙酮酸和N-乙酰葡萄糖胺為底物。與酶催化相比，可 以在沒有額外添加ATP的條件下合成N-乙酰神經(jīng)氨酸，節(jié)約了催化成本。
(6) 本發(fā)明首次使用表面活性劑用于提高全細胞生物催化劑的細胞膜通透性，與其 它全細胞催化合成N-乙酰神經(jīng)氨酸過程相比提高了產(chǎn)物的合成速度和終濃度。
(7) 本發(fā)明首次把過量的N-乙酰葡萄糖胺推動反應的方法用于以全細胞為催化劑的 N-乙酰神經(jīng)氨酸合成，得到較高濃度的N-乙酰神經(jīng)氨酸和較低的殘留丙酮酸濃 度，易于后續(xù)離子交換分離。


圖1構建重組大腸桿菌的催化過程示意圖
a為N-乙酰葡萄糖胺異構酶；b為N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶；C為N-乙酰葡萄糖胺磷
酸轉運系統(tǒng)。
圖2重組共表達載體構建過程
A為pBV220載體，具體構建方法參見文獻張智清等1990年于病毒學報發(fā)表的《含 PA啟動子的原核高效表達載體的組建及其應用》(第6巻，第2期，111-116頁)；B為 用重組PCR方法構建的中間插有SD序列的兩個基因；C為構建好的溫控共表達載體 (pBVNsS)。
圖3基因敲除菌株構建過程
A: PCR得到的nagE基因連接到pMD18-T載體；B: Axr57HI酶切pMD18-T_4639得 到帶有nagE基因兩頭序列的pMD18-T，片段；C: Smal酶切pL0I2065得到FRT-tet-FRT 片段；D:連接pMD18-T，和FRT-tet-FRT片段，得到載體；E:以pMD18-T-4047為模板 PCR得到FnagEl-FRT-tet-FRT-FnagE2; F: FnagEl-FRT-tet-FRT-FnagE2電轉進入表達 重組酶的大腸桿菌K12得到重組子;G:重組子表達Flp重組酶消除抗性基因tet;FnagE: nagE基因的部分片段
圖4比色法測定丙酮酸標準曲線
圖5 HPLC分析丙酮酸、N-乙酰神經(jīng)氨酸、N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰甘露糖胺標準 品圖譜及標準曲線。
a: N-乙酰神經(jīng)氨酸標準曲線；b:丙酮酸標準曲線；C: N-乙酰甘露糖胺標準曲線； d: N-乙酰葡萄糖胺標準曲線。
圖6 HPLC分析轉化體系圖譜。
具體實施例方式
實施例1:重組基因工程菌株大腸桿菌(￡sc/ arr'c/ j'acoh') DT26 (pBVNsS) CCTCC NO: M 209018構建
1、 N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因(/73M)克隆
采用常規(guī)的方法制備菌株大腸桿菌K12 ATCC 25404的基因組DNA，該過程可參考 科學出版社出版的《精編分子生物學指南》中細菌基因組的小量制備的方法；使用合成 的引物從大腸桿菌K12的基因組DNA中PCR擴增得到N-乙酰神經(jīng)氨酸酶基因"3/7A片 段用￡coRI和尸stl雙酶切后回收，連接至相同酶處理過并回收的質粒pBV220 (見病毒 學報，第6巻，第2期，111-116頁)。
其中，上述大腸桿菌K12 ATCC 25404作為朋/^基因的來源菌，根據(jù)已測序的該菌 的基因組序列，設計引物上游引物5， -AGGAATTCATGGCAACGAATTTAC-3'，攜帶一個 化oRI位點；下游引物5' -TCCTGCAGTCACCCGCGCTCTT-3，，攜帶一個位點。
2、 N-乙酰葡萄糖胺異構酶基因(s7rl975)克隆
用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)集胞藻(5)77ec力oc;^^ sp. ) PCC6803; 5,000轉/分鐘，離心 10分鐘，每1克濕菌體懸浮于20 ml緩沖液A (含1 M NaCl和30 P 1 10% Sarkosyl (十二烷基肌氨酸鈉)實驗中用SDS替代)4'C放置2小時以上；離心收集(8000轉每 分鐘，離心10分鐘)。用緩沖液A (含1 mM NaCl)洗滌，重懸于25 ml緩沖液A (含 25%蔗糖)，室溫放置l小時(混勻)；加溶菌酶至10-20 mg/ml 37°C保溫15分鐘；加
975 ml 10 raM Tris HC1 (含50 mM EDTA， pH 8. 5)，即稀釋4倍，繼續(xù)保溫1小時；加 SDS至W，加蛋白酶K至100 lig/ml，.于37。C處理2小時；(TC放置過夜后，6， 000 g 離心20分鐘；上清加入NaCl至lM再加入2倍體積冷乙醇，離心12， 000轉/分鐘，10 分鐘，去上清，溶于l ml TE緩沖液；加RNase A;酚/氯仿/異戊醇抽提蛋白一次，再 用氯仿/異戊醇抽提一次；加2倍體積無水乙醇，0'C放置2小時以上，沉淀DNA,離心 去上清，沉淀溶于TE緩沖液。使用合成的引物從集胞藻(5y/ ec力oc/w'ssp. ) PCC6803 的基因組DNA中PCR擴增得到N-乙酰葡萄糖胺異構酶基因(sZrl975);' 其中，BG11培養(yǎng)基配方如表1所示
表l BG11培養(yǎng)基成分
成份 貯液濃度(g/100ml) 1L培養(yǎng)基加量(ml)
NaN031510
K2HP04.3H200.410
MgS04-7H200.7510
CaCl2'2H20.0.3610
檸檬酸0.0610
檸檬酸鐵銨0.0610
EDTA 二鈉0.0110
Na2C030.210
A5*-1 -
蒸餾水-919
*A5溶液組成H3B03 61.0 mg/L， MnS04 H20 1 69. 0 mg/L， ZnS04 7H20 2 87.0 mg/L, GuS04 5H20 2. 5 mg/L， (NH4)6Mo7024 4H20 12. 5 mg/L
其中，緩沖液A成份為，50 mM Tris HC1和50raM EDTA， pH 8. 5。
以集胞藻(加ec力。cj^s sp. ) PCC6803的DNA為模板，以引物sir-f和sir-r進 行PCR得到sZrl975基因。連接至PMD18-T載體，得到pMD18-T-^Zrl975。
其中，根據(jù)已測序的集胞藻(^Sy"ec力ocj^ '"sp. ) PCC6803的基因組序列及報道的 該基因的序列，設計克隆s7rl975基因所用引物如下
上游引物slr-f: 5， ATAGAATTCATGATTGCCCATCGCCGTC 3，，攜帶一個^boRI位點； 下游引物slr-r: 5， ATTGGATCCTTAACTAACCGGAAGTTGGA 3，,攜帶一個y 湖HI位點。 3、重組PCR方法構建pBVNsS共表達載體
第一輪PCR條件及過程如下。分別以質粒pBV220-/7朋A和pMD18-T-sZr1^75為模板， 分別以引物A、 B和引物C、 D進行PCR。經(jīng)過94'C變性2分鐘后開始循環(huán)，94'C變性， 50-6(TC退火，72i:延伸l分鐘或2分鐘(因片段長度而變)，30個循環(huán)后，72'C再延伸 IO分鐘。再進行第二輪PCR:以第一次PCR得到的兩條帶為模板，以重組PCR引物A和 D為引物進行連接PCR。先進性5次延伸循環(huán)，以利于重組片段的形成。然后加入引物 94。C變性2分鐘后開始循環(huán)，94。C變性，50-6(TC退火，72。C延伸5分鐘，30個循環(huán)后， 72t:再延伸10分鐘。重組PCR得到的2. 1 kb片段切膠回收后連接到T載體，然后轉化 進入大腸桿菌DH5a 。挑取轉化子，酶切驗證，得到質粒pMD-18T-/ 朋A-slrl975。用fcoRI 和雙酶切得到的2. 1 kb片段和fcoRI和5"a71處理過的pBV220連接，轉化大腸桿菌DH5a。酶切驗證，誘導后進行蛋白電泳和酶活性驗證。 其中，重組PCR構建所用引物為，
引物A: 5， -GGCGAATTCATGGCAACGMTTTACGTGGC-3，,攜帶一個fcoRI位點；引物 B: 5， -TTATCTCCCTCGAGTATTCACCCGCGCTCTTgCA-3，，攜帶一個SD序列和一個位 點；
引物C: 5， -ATACTCGAGGGAGATAAATGATTGCCCATCGCCGT-3，攜帶一個J力ol位點；引 物D: 5， -GGCGTCGACTTAACTAACCGGAAGTTGGAGA-3，攜帶一個5^I位點。
4、 大腸桿菌K12基因組上/7agE基因敲除
(1) 分析pMD18-T的酶切位點及待敲除基因的酶切位點。
(2) PCR擴增T7a^基因(以nagE-u和nagE-d為引物；以大腸桿菌K12 ATCC 25404 基因組為模板)，連接pMD18-T，得到pMD18-T4639。
(3) 用A r5iHI酶切pMD18-T4639，并回收大小約為2.7 kb的片段；用5"aM 雙酶切pL012065，回收大小為1630 bp的片段
(4) 回收的大段和小片段連接得到pMD18-T4740
(5) PCR得到片段nagE::FRT-tet-FRT (以nagE-u和nagE-d為引物；以 pMD18-T4740為模板)，電轉化進入大腸桿菌K12 (pKD46)的電轉感受態(tài)(含有L-阿拉 伯糖誘導后表達的red重組酶)，涂布含有四環(huán)素的固體LB平板，37'C培養(yǎng)。
(6) 挑取重組子，用tet-u和tet-d引物進行PCR驗證。
(7) 在3(TC條件下，用LB培養(yǎng)上述重組子至0D6。。^值為0. 6。培養(yǎng)物轉至42°C 培養(yǎng)，消除菌株中的pKD46。轉接至含100 ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37'C培 養(yǎng)，驗證pKD46質粒徹底消除的菌株。
(8) 把上述消除pKD46的菌株做感受態(tài)，把質粒pFT-A轉化進入感受態(tài)細胞， 涂布含有100 ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，3(TC培養(yǎng)，篩選轉化子。
(9) 挑取轉化子于LB培養(yǎng)基中，30'C培養(yǎng)，加入10 u g/ml金霉素誘導FLP重 組酶表達，培養(yǎng)6小時后，轉為42。C培養(yǎng)消除質粒pFT-A。
(10) 培養(yǎng)液稀釋至適當濃度(約1(T)，涂布LB平板，于37。C培養(yǎng)，挑取多個 單菌落分別轉接到含100 U g/ml氨節(jié)青霉素和10 Ug/ml四環(huán)素的搖管，選擇既消除 四環(huán)素抗性又消除pFT-A質粒的菌株。
其中，擴增"^E基因所用引物如下 上游引物nagE-u: 5， -ATGAATATTTTAGGTTTTTTCC-3 ，， 下游引物nagE-d: 5， -TTACTTTTTGATTTCATACAGC-3 ，。 其中，上述敲除過程中抗性基因PCR檢測用引物如下 上游引物tet-u: 5' -GGGTACCGAGCTCGAATT-3'， 下游引物tet-d: 5， -GGGGAGCTTGTCGACAAT-3，。
5、 構建重組基因工程菌株大腸桿菌(&c力er/cy^'a DT26 (pBVNsS)
以常規(guī)方法將構建質粒pBVNsS轉化進入大腸桿菌(^s"c力eric力/acoJ7) DT26得到 大腸桿菌(foc力en'c/w'a DT26 (pBVNsS)并經(jīng)過SDS-PAGE和酶活性維測具有N-
乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性和N-乙酰葡萄糖胺異構酶活性。
上述大腸桿菌(foc力eWc力j'a coh') DT26 (pBVNsS)菌株已于2009年1月12日保 藏于"中國典型培養(yǎng)物保藏中心"(武漢大學，中國武漢)，保藏號為CCTCCN0:M209018。上述重組大腸桿菌(￡sc/ erj'c/w'a coh') DT26 (pBVNsS) CCTCC NO: M 209018，為 革蘭氏陰性菌，可以用于催化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸。
上述重組大腸桿菌(￡sc/ er/c/ /a co7/) DT26 (pBVNsS) CCTCC NO: M 209018具 有以下生理生化特征較佳培養(yǎng)溫度為37±rC，可以在含有IOO Hg/ml氨芐青霉素 的LB培養(yǎng)基或LB無機鹽培養(yǎng)基上生長。好氧或兼性好氧，有周生鞭毛，不形成孢子， 革蘭氏陰性。在營養(yǎng)瓊脂上的菌落呈光滑、低凹、潮濕和灰白，表面有光澤、邊緣較整 齊?；苡袡C營養(yǎng)，具有呼吸和發(fā)酵代謝。發(fā)酵D-葡萄糖、其他糖類化合物和多元醇， 產(chǎn)氣。能利用乙酸為唯一碳源，不能利用檸檬酸鹽。
實施例2:全細胞催化劑在N-乙酰神經(jīng)氨酸合成中的應用
(1) 平板培養(yǎng)將上述大腸桿菌(^sc力e77'c力j'a DT26 (pBVNsS) CCTCC NO: M 209018菌株劃線到含有質量體積比為1. 5%瓊脂并含100 ^ g/ml的氨芐青霉素LB平 板上，37'C培養(yǎng)12小時。
(2) —級種子在無菌的條件下，用無菌的牙簽挑取步驟(1)平板上的一個單菌 落，然后接種到5 ml的含100 Pg/ml氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，3(TC搖床振蕩培養(yǎng) 12小時。
(3) 搖瓶培養(yǎng)在無菌條件下，取步驟(2)所培養(yǎng)的培養(yǎng)液以體積比為1%的接
種量，接種到30 ml含有100 y g/ml的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，3(TC旋轉式搖 床200轉/分鐘培養(yǎng)2小時。
(4) 誘導把搖瓶移至45'C搖床，180轉/分鐘誘導4小時。
其中上述步驟(1) (3)中所述的LB培養(yǎng)基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉
5 g/L; NaCl 10 g/L， pH 7.0; 115。C滅菌15分鐘。
上述步驟(4)中所述LB無機鹽液體培養(yǎng)基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉5g/L; Na2HP04 7H20 12. 8 g/L; KH2P04 3 g/L; NaCl 0. 5 g/L; NH4C1 1 g/L; CaCl2 0. 011 g/L; 葡萄糖4 g/L; 115。C滅菌15分鐘。
(5) 收集菌體將步驟(4)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物8，000轉/分鐘離心15分鐘；并用 pH 7. 4、 1/15 M的PBS緩沖液洗滌菌體兩遍。測得N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶比酶活性5.321 U/mg菌體蛋白，N-乙酰葡萄糖胺異構酶比酶活為0.486U/mg菌體蛋白。將離心的菌體 置于4'C的冰箱中冷藏，即得到生物催化劑，待用。
上述細胞催化劑酶活性測量方法為取濃縮10倍菌液，懸浮于破碎緩沖液，超聲 波破碎后，取上清測定酶活性。其中破碎緩沖液成份為60 mM磷酸緩沖液(pH 7.4) 和100g/L甘油。
上述N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性測定方法為如下。酶活測量反應體系20mM磷酸 鉀緩沖液(pH 7.4) 350 ul， 100 "1 N-乙酰神經(jīng)氨酸(5 mg/ml)， 50 ul酶液。酶 活測量反應條件為37'C反應10分鐘，加0. 5 ml DNP溶液顯色20分鐘后，加NaOH (0.4 M) 5 ml顯色。于520 nm比色。
上述N-乙酰葡萄糖胺異構酶活性測定方法如下。反應體系及反應條件0.1 M Tris-HC1 (pH 7. 5)力I] 10 mM MgCl2加50 mM ManNAc力B 5 mM ATP最后加20 u 1酶液 啟動反應。3(TC反應10分鐘后，沸水浴5分鐘終止反應，12，000轉/分鐘，離心，取 上清用高效液相色譜(HPLC)進行分析。(6) 利用上述生物催化劑生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸將歩驟(5)所得的生物催化劑即 重組大腸桿菌(foc/ ar2'c/u'a coh') DT26 (pBVNsS) CCTCC NO: M 209018的細胞醛縮酶 總活性調(diào)節(jié)約至40U，相應的異構酶總活性約為8 U，在3(TC， pH7.4條袢下，丙酮酸 濃度為600 mM， N-乙酰葡萄糖胺濃度為1000 mM,并加入CTAB終濃度為0. 3 g/L，在往 復式搖床振蕩反應42小時，得到含N-乙酰神經(jīng)氨酸轉化液。
(7) 將轉化液以8,000轉/分離心10分鐘，去除所加入的生物催化劑，測定上清 液中N-乙酰神經(jīng)氨酸和丙酮酸的含量分別為191 mM和253 mM。
(8) 用HZ201X8樹脂將轉化液中的N-乙酰神經(jīng)氨酸分離。收集的流出液，在真空 度0.095MPa， 5(TC的條件下濃縮。濃縮液進行冰乙酸沉淀，4"C下靜置得到結晶。純度 約為98.0%,回收率約為90.2%。
上述HPLC檢測反應體系方法為樣品處理方法如下。樣品沸水浴10分鐘后，12, 000 轉/分鐘，離心20分鐘。取離心液上清，用流動相稀釋至合適倍數(shù)，用0.22 wni濾膜 過濾，濾過液進行HPLC檢測。使用BioRad Aminex HPX-87H (300X7.8咖)色譜柱對 樣品進行分析。柱溫為55°C，以10 mM硫酸水溶液為流動相，流速為0.4 ml/分鐘， 在Agilent 1100高效液相色譜儀上運行，進樣量5 u l，檢測器為示差折光檢k(器(RID)。
實施例3:全細胞催化劑在N-乙酰神經(jīng)氨酸合成過程中的應用
(1) 平板培養(yǎng)將大腸桿菌(fsc/ er化/w'a coh') DT26 (pBVNsS) CCTCC NO: M 209018 菌株劃線到含有質量體積比為1. 5%瓊脂并含100 P g/mL的氨芐青霉素LB平板上，37'C 培養(yǎng)12小時。
(2) —級種子在無菌的條件下，用無菌的牙簽挑取步驟(1)平板上的一個單菌 落，然后接種到5ml的含100iig/ml氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，37'C搖床振蕩培養(yǎng) 12小時。
(3) 二級種子在無菌條件下，取步驟(2)所培養(yǎng)的培養(yǎng)液以體積比為1%的接 種量，接種到500 ml含有100 Ug/ml的氨芐青霉素的LB無機鹽液體培養(yǎng)基中，30'C 搖床振蕩培養(yǎng)12小時。
(4) 發(fā)酵罐培養(yǎng)在無菌條件下，取步驟(3)所得的培養(yǎng)液以體積比'為10%的接 種量接種5 L的上述LB無機鹽液體培養(yǎng)基，42'C誘導6小時。
其中上述步驟(1) (3)中所述的LB培養(yǎng)基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉
5 g/L; NaCl 10 g/L， pH 7.0; U5。C，滅菌15分鐘。
上述步驟(4)中所述LB無機鹽液體培養(yǎng)基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉5g/L; Na2HP04 7H20 12. 8 g/L; KH2P04 3 g/L; NaCl 0. 5 g/L; NHXl 1 g/L; CaCl2 0. Oil g/L; 葡萄糖4 g/L; 115'C，滅菌15分鐘。
(5) 收集菌體將步驟(4)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物8，000轉/分鐘離心15分鐘；并用 pH 7.4、 1/15 M的PBS緩沖液洗滌菌體兩遍。測得N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶比酶活為 1. 765。， N-乙酰葡萄糖胺異構酶比酶活為0.142。將離心的菌體置于4'C的冰箱中冷藏， 即得到生物催化劑，待用。
上述細胞催化劑酶活性測量方法為取濃縮10倍菌液，懸浮于破碎緩沖液，超聲 波破碎后，取上清測定酶活性。其中破碎緩沖液成份為60 mM磷酸緩沖液'(pH 7.4) 和100 g/L甘油。
13上述N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性測定方法為如下。酶活測量反應體系20mM磷酸 鉀緩沖液(pH 7.4) 350 ul, 100 ixl N-乙酰神經(jīng)氨酸(5 mg/ml)， 50 "1酶液。酶 活測量反應條件為37。C反應10分鐘，加0. 5 ml 2， 4 二硝基苯肼(DNP)溶液顯色20 分鐘后，加NaOH (0.4 M) 5 ml顯色。于520 nm比色。
上述N-乙酰葡萄糖胺異構酶活性測定方法如下。反應體系及反應條件0.1 M Tris-HC1 (pH 7. 5)力卩10 mM MgCl2加50 mM ManNAc加5 mM ATP最后加20 u 1酶液 啟動反應。30'C反應10分鐘后，沸水浴5分鐘終止反應，12，000轉/分鐘，離心15分 鐘，取上清用高效液相色譜(HPLC)進行分析。
(6) 利用上述生物催化劑生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸將步驟(5)所得的生物催化劑即 重組大腸桿菌(￡sc/ en'c/;j'a coh') DT26 (pBVNsS) CCTCC NO: M 209018的細胞N-乙 酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性約為4011，相應N-乙酰葡萄糖胺異構酶活性約為8 U,在3(TC, pH7.4條件下，丙酮酸濃度為400 mM， N-乙酰葡萄糖胺濃度為600 mM，并加入CTAB終 濃度為0.2g/L,往復式搖床振蕩反應36小時，得到含N-乙酰神經(jīng)氨酸轉化液。
(7) 將轉化液以8,000轉/分離心IO分鐘，去除所加入的生物催化劑，測定上清 液中N-乙酰神經(jīng)氨酸和丙酮酸的含量為75±2 mM和252士2 mM。
(8) 用HZ201X8樹脂將轉化液中的N-乙酰神經(jīng)氨酸分離。收集的流出液，在真空 度0.095MPa， 50'C的條件下濃縮。濃縮液進行冰乙酸沉淀，4'C下靜置得到結晶。純度 約為98. 1%,回收率約為90.03%。
上述HPLC檢測反應體系方法為:樣品處理方法如下。樣品沸水浴10分鐘后，12, 000 轉/分鐘離心20分鐘。取離心液上清，用流動相稀釋至合適倍數(shù)，用0.22 !xm濾膜過 濾，濾過液進行HPLC檢測。使用BioRad Aminex HPX-87H (300X7.8 mm)色譜柱對樣 品進行分析。柱溫為55°C，以10 mM硫酸水溶液為流動相，流速為0.4 ml/分鐘，在 Agilent 1100高效液相色譜儀上運行，進樣量5 P 1，檢測器為示差折光檢測器(RID)。
實施例4:全細胞催化劑在N-乙酰神經(jīng)氨酸合成中的應用
(1) 平板培養(yǎng)將重組大腸桿菌(^sc力en'c/ ia co i) DT26 (pBVNsS) CCTCC NO: M 209018菌株劃線到含有質量體積比為1. 5%瓊脂并含100 u g/mL的氨芐青霉素LB平 板上，37'C培養(yǎng)12小時。
(2) —級種子在無菌的條件下，用無菌的牙簽挑取步驟(1)平板上的一個單菌 落，然后接種到5ml的含100 U g/ml氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，30。C搖床振蕩培養(yǎng) 12小時。
(3) 二級種子在無菌條件下，取步驟(2)所培養(yǎng)的培養(yǎng)液以體積比為1%的接 種量，接種到IOO ml含有100 ug/ml的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37'C搖床振 蕩培養(yǎng)10小時。 '
(4) 發(fā)酵罐培養(yǎng)在無菌條件下，取步驟(3)所得的培養(yǎng)液以體積比為1%的接 種量接種10 L的限制碳源的LB無機鹽液體培養(yǎng)基，42'C誘導，流加葡萄糖控制比生長 速率，培養(yǎng)6小時
其中上述步驟(1) (3)中所述的LB培養(yǎng)基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉
5 g/L; NaCl 10 g/L， pH 7.0; 115。C，滅菌15分鐘。
上述步驟(4)中所述LB無機鹽液體培養(yǎng)基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉5g/L;Na2HP04 7H20 12. 8 g/L; KH2P04 3 g/L; NaCl 0. 5 g/L; NH4C1 1 g/L; CaCl2 0. Oil g/L; 葡萄糖4 g/L; 115°C，滅菌15分鐘。
上述細胞催化劑酶活性測量方法為取濃縮10倍菌液，懸浮于破碎緩沖液，超聲
波破碎后，取上清測定酶活性。其中破碎緩沖液成份為60 mM磷酸緩沖液.(pH 7.4) 和100 g/L甘油。
上述N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性測定方法為如下。酶活測量反應體系20mM磷酸 鉀緩沖液(pH 7.4) 350 ul, 100 ul N-乙酰神經(jīng)氨酸(5 mg/ml), 50 ul酶液。酶 活測量反應條件為37。C反應10分鐘，加0.5 ml 2, 4 二硝基苯肼(DNP)溶液顯色20 分鐘后，加NaOH (0.4 M) 5 ml顯色。于520nra比色。
上述N-乙酰葡萄糖胺異構酶活性測定方法如下。反應體系及反應條件0.1 M Tris-HCl (pH 7, 5)加10 mM MgCljB 50 mM ManNAc力B 5 mM ATP最后加20 u 1酶液 啟動反應。3(TC反應10分鐘后，沸水洛5分鐘終止反應，12,000轉/分鐘，離心15分 鐘，取上清用高效液相色譜(HPLC)進行分析。
(5) 收集菌體將步驟(4)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物8，000轉/分鐘離心15分鐘；并用 pH 7.4 1/15 M的PBS緩沖液洗滌菌體兩遍后，測得N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶比酶活為 5.023。， N-乙酰葡萄糖胺異構酶酶活性比酶活為0.523。將離心的菌體置于4'C的冰箱 中冷藏，即得到生物催化劑，待用。
(6) 利用上述生物催化劑生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸將步驟(5)所得的生物催化劑 即重組大腸桿菌(&c力ar化力j'a c。h.) DT26 (pBVNsS) CCTCC NO: M 209018的細胞N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶酶活性約為30U，相應N-乙酰葡萄糖胺異構酶酶活性約為4U，在 30°C， pH7.4條件下，丙酮酸濃度為1000 mM， N-乙酰葡萄糖胺濃度為800 mM，加入CTAB 終濃度為0.2 g/L往復式搖床振蕩反應36小時，得到含N-乙酰神經(jīng)氨酸轉化液。
(7) 將轉化液以8，000轉/分離心l0分鐘，去除所加入的生物催化劑，測定上清 液中N-乙酰神經(jīng)氨酸和丙酮酸的含量分別約為382 mM和400士50 mM;
(8) 用HZ201X8樹脂將轉化液中的N-乙酰神經(jīng)氨酸分離。收集的流出液，在真 空度0.095 MPa, 50。C的條件下濃縮。濃縮液進行冰乙酸沉淀，4。C下靜置得到結晶。 純度約為97. 9% ，回收率約為83. 03% 。
上述HPLC檢測反應體系方法為樣品處理方法如下。樣品沸水浴10分鐘后，12, 000 轉/分鐘，離心20分鐘。取離心液上清，用流動相稀釋至合適倍數(shù)，用0.22 txm濾膜 過濾，濾過液進行HPLC檢測。使用BioRad Aminex HPX-87H (300X7.8 mm)色譜柱對 樣品進行分析。柱溫為55°C，以10 mM硫酸水溶液為流動相，流速為0.4 ml/分鐘， 在Agilent 高效液相色譜儀上運行，進樣量5 iil，檢測器為示差折光檢測器(RID)。序列表
〈110〉山東大學
〈120〉 一株溫控共表達外源基因的重組大腸桿菌及其應用 〈141〉 2009-7-3
〈160〉 1
〈210〉 1
〈211〉 5743
〈212〉 DNA
〈213〉大腸桿菌(^sr力eric力/a co力')
〈221〉 pBVNsS
〈222〉 (1)…(5743)
〈400〉 1
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1.一株溫控共表達外源基因的重組大腸桿菌，其特征在于該菌株命名為大腸桿菌(Escherichia coli)DT26(pBVNsS)；所述菌株已于2009年1月12日保藏于“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號為CCTCC NOM 209018。
2. 根據(jù)權利要求1所述的溫控共表達外源基因的重組大腸桿菌，其特征在于所 述菌株的基因型為4"^E: :FRT;其含有溫控共表達載體即構建質粒pBVNsS。
3. 根據(jù)權利要求2所述的溫控共表達外源基因的重組大腸桿菌，其特征在于所 述質粒pBVNsS是以載體pBV220為出發(fā)載體，在&&啟動子下游順序插入了 N-乙酰神 經(jīng)氨酸醛縮酶(Neu5Ac aldolase)基因朋M和加有SD序列的N-乙酰葡萄糖胺異構酶(GlcNAc 2-印imerase)基因Wrl975，具有雙順反子片段"朋A-SD-W/i975。
4. 根據(jù)權利要求3所述的溫控共表達外源基因的重組大腸桿菌，其特征在于所 述N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因朋M來源于大腸桿菌K12 ATCC 25404。
5. 根據(jù)權利要求3所述的溫控共表達外源基因的重組大腸桿菌，其特征在于所 述N-乙酰葡萄糖胺異構酶基因slrl975來源于集胞藻(S印ec力oc/s"s sp. ) PCC6803。
6. 權利要求1所述溫控共表達外源基因的重組大腸桿菌作為催化劑在全細胞催化 的制備N-乙酰神經(jīng)氨酸中的應用。
7. 根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于所述溫控共表達外源基因的重組大 腸桿菌用于制備全細胞催化劑的條件為誘導前培養(yǎng)溫度20 35°C，誘導前培養(yǎng)時間 0.5 5小時；誘導溫度37 45。C，誘導時間4 30小時，搖床轉速150 250轉/分鐘， 發(fā)酵罐氧溶解度15 45%;使用上述全細胞催化劑制備N-乙酰神經(jīng)氨酸的反應體系及反 應條件是反應體系中全細胞催化劑N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶酶活性為20 40 U，相應 的N-乙酰葡萄糖胺異構酶酶活性為4 8U, N-乙酰葡萄糖胺濃度為200 1000 mM，丙 酮酸濃度為200 1500 mM，磷酸緩沖液濃度40 80 mM， Mg"濃度10 30 mM，反應體 系中添加0.1 10 g/L Triton X_100、 0. 1 10 g/L SDS、 0.1~10 g/L CTAB或0. l 10g/LCHAPs，反應pH值為7 7.8，反應溫度為25 37°C，反應時間為12 72小時， 反應過程使用往復式搖床或控制發(fā)酵罐轉速使氧溶解度為30~70%。
8. 根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于所述溫控共表達外源基因的重組大 腸桿菌用于制備全細胞催化劑的條件為誘導前培養(yǎng)溫度27 32°C，誘導前培養(yǎng)時間 1.5 2.5小時;誘導溫度42 45"C，誘導時間4. 5 5. 5小時。
9. 根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于所述使用上述全細胞催化劑制備N-乙酰神經(jīng)氨酸的反應體系及反應條件是反應體系中全細胞催化劑N-乙酰神經(jīng)氨酸醛 縮酶酶活性為27 35 U，相應的N-乙酰葡萄糖胺異構酶酶活性為5 7U， N-乙酰葡萄 糖胺濃度為800 1000 mM，丙酮酸濃度為600 800 raM，磷酸緩沖液濃度60 80 mM， Mg"濃度15 30 raM，反應體系中添加濃度為0. 2 0. 6 g/L的CTAB，反應pH.值為7. 2~ 7.4，反應溫度為32 35°C，反應時間為32 60小時，反應過程控制發(fā)酵罐氧溶解度 為40 70%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株溫控共表達外源基因的重組大腸桿菌，名為大腸桿菌(Escherichia coli)DT26(pBVNsS)CCTCC NOM 209018，其基因型為ΔnagE::FRT；含有溫控共表達載體pBVNsS。同時本發(fā)明還公開了所述重組大腸桿菌作為催化劑在全細胞催化制備N-乙酰神經(jīng)氨酸中的應用。本發(fā)明的溫控共表達外源基因的重組大腸桿菌在規(guī)?；呋a(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸過程中具有催化劑制備安全方便，催化過程操作簡單，價格便宜，效率較高，易于提取等特點。
文檔編號C12N1/21GK101603023SQ200910016499
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月10日 優(yōu)先權日2009年7月10日
發(fā)明者張奕南, 平 許, 馬翠卿 申請人:山東大學