專利名稱：蘇木素在測(cè)定細(xì)胞增殖活性和藥物對(duì)細(xì)胞毒效應(yīng)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蘇木素在測(cè)定貼壁細(xì)胞增殖活性和藥物對(duì)貼壁細(xì)胞毒性作用中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)的日益深入，愈來(lái)愈多中藥的抑瘤作用被世人關(guān)注，對(duì)這類藥物或 其提取物進(jìn)行體外篩選亦是藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程的重要環(huán)節(jié)。采用穩(wěn)定、可靠的檢測(cè)方法觀察藥物 對(duì)不同細(xì)胞系體外增殖抑制活性是必需的。
觀察細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞毒性作用，常規(guī)采用四類方法1、同位素方法，主要有3H-TdR 摻入法、^I-UdR及"Cr釋放法，雖然這類方法敏感、特異，但存在對(duì)環(huán)境污染及需復(fù)雜昂貴 的儀器設(shè)備等諸多弊端。2、流式細(xì)胞儀分析法同樣具有敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)，但亦須昂貴復(fù)雜 的儀器設(shè)備，不易在基層推廣應(yīng)用。3、 Gierasa染色法、結(jié)晶紫、臺(tái)盼蘭等染色法，雖然簡(jiǎn) 便、經(jīng)濟(jì)，但存在結(jié)果不穩(wěn)定和嚴(yán)重的非特異性吸附等缺點(diǎn)。4、酶底物法主要有傳統(tǒng)的MTT 比色法等，其特點(diǎn)是以活細(xì)胞的某種酶和相應(yīng)底物之間的反應(yīng)來(lái)顯示細(xì)胞數(shù)量和生存狀態(tài)， 優(yōu)點(diǎn)是敏感快速及重復(fù)性較好，且對(duì)人體無(wú)損傷，通過(guò)對(duì)此方法的不斷改進(jìn)完善，多年來(lái)一 直廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性作用等研究領(lǐng)域。CCK-8是MTT的一種升級(jí)替代產(chǎn)品，其 作用原理與MTT相似，與MTT相比具有敏感性更高，且操作更簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，非常適合用于細(xì) 胞增殖和一般化學(xué)藥物的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。本研究在采用MTT比色法和CCK-8比色法觀察中藥 提取物金蕎麥對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用時(shí)發(fā)現(xiàn)MTT和CCK-8均與金蕎麥提取物發(fā)生不同程度的 非特異性反應(yīng),致使結(jié)果波動(dòng)范圍較大,劑量依賴關(guān)系不明顯?；谏鲜鏊?，尋找特異、穩(wěn) 定、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的體外藥物篩選方法已成當(dāng)務(wù)之急。
蘇木素是一種天然染料，通過(guò)氧化變?yōu)樘K木紅，通常用于生物組織切片細(xì)胞核的染色。 本研究將蘇木素用于檢測(cè)貼壁細(xì)胞增殖和藥物對(duì)貼壁細(xì)胞毒性作用，蘇木素僅能被固定前的 活細(xì)胞吸附，活細(xì)胞數(shù)量越多，狀態(tài)越好，則染色越深，所測(cè)OD值越高；反之，活細(xì)胞數(shù) 量越少，狀態(tài)越差，則染色越淺，OD值越低，從而間接對(duì)活細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行定量。目前尚 無(wú)將其用于測(cè)定貼壁細(xì)胞系體外增殖活性和藥物對(duì)貼壁細(xì)胞毒性作用的研究和報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了蘇木素的一種新用途，即蘇木素在測(cè)定貼壁細(xì)胞增殖 活性和藥物對(duì)貼壁細(xì)胞毒性作用中的應(yīng)用。本發(fā)明還建立了一套測(cè)定貼壁細(xì)胞增殖活性和藥 物對(duì)貼壁細(xì)胞毒性作用的檢測(cè)方法。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有特異、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種利用蘇木素測(cè)定貼壁細(xì)胞增殖活性的方法，步驟如下取已稀釋好的待測(cè)細(xì)胞懸液， 置于細(xì)胞培養(yǎng)板的各相應(yīng)孔中，每孔200ul，于37'C、體積分?jǐn)?shù)為5%的C02飽和濕度條件 下，孵育44小時(shí)，甩棄上清，立即加入4%的多聚甲醛溶液，每孔100nl，固定20分鐘后收 集固定液(可反復(fù)利用)，PBS洗3次，每次200nl/孔，棄上清，室溫晾干；取蘇木素染色 液，每孔加入100yl， 20分鐘后收集染色液(可反復(fù)利用)，蒸餾水洗3 5次，以去除未結(jié)合 的染料，室溫晾干；于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞著色狀況，再加入1%的鹽酸酒精，100nl/孔， 此時(shí)各孔液體呈現(xiàn)不同程度的粉紅色，20分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定540nm處的吸光度值并記錄， 取各組OD值均數(shù)并繪制細(xì)胞系增殖曲線。
一種利用蘇木素測(cè)定藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞系毒性作用的方法，步驟如下取待測(cè)細(xì)胞液，置 于細(xì)胞培養(yǎng)板的孔板中，每孔200yl，同時(shí)設(shè)定無(wú)藥物細(xì)胞對(duì)照和培養(yǎng)基酶標(biāo)儀調(diào)零孔，于 37°C、體積分?jǐn)?shù)為5。/。的C02飽和濕度條件下，孵育44小時(shí)；取出細(xì)胞培養(yǎng)板甩棄上清，立 即加入4%的多聚甲醛溶液，150ul/ L，固定20分鐘后收集固定液；PBS洗3次，每次200 Pl/ L，棄上清，室溫晾干；取蘇木素染色液，每孔加入100"1， 20分鐘后收集染色液；蒸 餾水洗3 5次以去除未結(jié)合的染料，室溫晾干；于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞著色狀況，再加入 1%的鹽酸酒精，100wl/ L，此時(shí)各孔液體呈現(xiàn)不同程度的粉紅色，20分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定 540nm處的吸光度值并記錄，按下式計(jì)算藥物的抑瘤率
其中，OD值(試驗(yàn)孔X)表示實(shí)驗(yàn)組各孔OD值的均數(shù)；OD值(細(xì)胞對(duì)照孔X)表
示無(wú)藥細(xì)胞對(duì)照組各孔OD值的均數(shù)。
所述4%的多聚甲醛溶液是按照文獻(xiàn)《組織培養(yǎng)和細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(鄂征，北京出版社P146) 中的描述配制的，方法如下將多聚甲醛40g溶于0.1molPBS 1000ml中，加熱至60'C左右， 不斷攪拌至透明，也可加少許lmolNaOH使溶液透明。
所述蘇木素染色液是按文獻(xiàn)《常用蘇木素幾種配方與染色結(jié)果的比較》(李文，張賽霞， 解剖學(xué)雜志，2000; 23 (4): 393)中的描述配制的，方法如下所示1.5g蘇木素用5ml無(wú)水 乙醇溶解，蒸餾水溶解鉀明礬(加溫至90'C,勿煮沸)，將溶解的蘇木素和碘酸鈉同時(shí)加入鉀 明礬水溶液內(nèi)，流水冷卻至室溫，再加甘油，震蕩l小時(shí)后即可使用，染液可保用6個(gè)月。
所述1%鹽酸酒精溶液是指鹽酸和酒精體積分?jǐn)?shù)分別為1%和70%的溶液。
所述PBS是指0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液，PH=7.2。所述加入4%的多聚甲醛溶液、PBS和蘇木素染色液是采用多通道微量移液器，不僅可 簡(jiǎn)化繁瑣的實(shí)驗(yàn)程序，而且能大大減少各孔之間的誤差。
本發(fā)明的發(fā)明人采用蘇木素染色法對(duì)SGC7901 、M21和Huvec等貼壁細(xì)胞不同時(shí)相(12h、 24h、 48h、 72h)細(xì)胞增殖活性的多次測(cè)定結(jié)果均表明，此方法不僅特異性高，且CV〈3。/。，具 有較好的可重復(fù)性。
發(fā)明人在采用MTT比色法和CCK-8比色法觀察葡萄籽原花青素(GSPE)對(duì)細(xì)胞的增殖效 應(yīng)，金蕎麥提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，MTT和CCK-8均可與此類中藥提取物產(chǎn)生 不同程度的非特異性反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果(OD值)與未摻入MTT和CCK-8前鏡檢觀察結(jié)果相差甚 遠(yuǎn)，劑量依賴關(guān)系不明顯，致使結(jié)果波動(dòng)范圍較大。而將蘇木素染色法應(yīng)用于金蕎麥提取物 對(duì)腫瘤細(xì)胞(M21和SGC7901細(xì)胞)的毒性測(cè)定，多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示M21和SGC7901細(xì)胞 對(duì)金蕎麥提取物有較好的劑量依賴關(guān)系，并與鏡檢觀察結(jié)果高度一致，提示此方法可較客觀 地反映此類物質(zhì)對(duì)不同細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。
本發(fā)明的檢測(cè)方法在固定和染色結(jié)束后，固定液和蘇木素染色液可回收并多次反復(fù)使 用。與昂貴的CCK-8試劑相比，蘇木素染色法的經(jīng)濟(jì)實(shí)用則顯得頗為突出。本發(fā)明的檢測(cè)方 法具有效果好、成本低、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為蘇木素染色法和MTT法對(duì)Huvec增殖活性的測(cè)定的比較示意圖2為蘇木素染色法和CCK-8法對(duì)Huvec增殖活性的測(cè)定的比較示意圖3為蘇木素染色法和MTT法對(duì)M21細(xì)胞增殖活性的測(cè)定的比較示意圖4為VCR對(duì)M21細(xì)胞的毒性作用示意圖5為VCR對(duì)SGC7901細(xì)胞的毒性作用示意圖6為5-Fu對(duì)M21細(xì)胞的毒性作用示意圖7為5-Fu對(duì)SGC7901細(xì)胞的毒性作用示意圖8為順鉑對(duì)VX2細(xì)胞的毒性作用示意圖9為蘇木素染色法和CCK-8法測(cè)定金蕎麥提取物對(duì)SGC7卯1細(xì)胞的毒性作用示意圖10為蘇木素染色法測(cè)定金蕎麥提取物對(duì)SGC7901細(xì)胞的毒性作用示意圖11為蘇木素染色法和CCK-8法測(cè)定金蕎麥提取物對(duì)M21細(xì)胞的毒性作用示意圖12為CCK-8法測(cè)定金蕎麥提取物對(duì)M21的毒性作用示意圖13為金蕎麥提取物對(duì)M21細(xì)胞的毒性作用示意圖(100rng/L;放大250倍)；
圖14為金蕎麥提取物對(duì)M21細(xì)胞的毒性作用示意圖(Omg/L;放大250倍)。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明-實(shí)施例1:
(1) 蘇木素染色法檢測(cè)貼壁細(xì)胞增殖活性，如下
取1640完全培養(yǎng)基加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100" 1/孔。0.25%胰酶分別消化Huvec和 M21細(xì)胞，離心后棄上清，用完全培養(yǎng)基調(diào)相應(yīng)的細(xì)胞濃度。然后各取100iU細(xì)胞懸液分別 加入上述96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各相應(yīng)孔中，混勻后倍比2稀釋，依次設(shè)8個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度 3復(fù)孔，然后各孔補(bǔ)充完全培養(yǎng)基至200iU,并設(shè)1孔1640培養(yǎng)基用于酶標(biāo)儀調(diào)零。將96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板置37'C、體積分?jǐn)?shù)為5。/。的C02飽和濕度條件下，孵育44小時(shí)。取出96孔細(xì) 胞培養(yǎng)板甩棄上清，用8通道微量移液器立即加入4%的多聚甲醛溶液，150ul/孔，固定20 分鐘后收集固定液(可反復(fù)應(yīng)用)。PBS洗3次，棄上清，室溫晾干。用8通道微量移液器取 蘇木素染色液100 y 1加入各孔，20分鐘后收集染色液(可反復(fù)利用)。蒸餾水洗3-5次以去除 未結(jié)合的染料，室溫晾干。于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞著色狀況，加入1%的鹽酸酒精，lOOii 1/孔，此時(shí)各孔液體呈現(xiàn)不同程度的粉紅色，20分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定540nm處的吸光度值并 記錄。計(jì)算各組OD值均數(shù)并繪制細(xì)胞系增殖曲線。
(2) MTT比色法觀察Huvec和M21細(xì)胞系的增殖活性，按文獻(xiàn)田志剛，張建華MTT 法在檢測(cè)細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒效應(yīng)中的應(yīng)用中國(guó)腫瘤生物治療雜志1994; 1 (1): 74方法進(jìn) 行，步驟略。
(3) CCK-8比色法觀察Huvec的增殖活性，如下
首先取100ul完全培養(yǎng)基加入各孔。0.25y。的胰酶消化收集Huvec后，用完全培養(yǎng)基調(diào) 相應(yīng)的細(xì)胞濃度。將細(xì)胞懸液混勻后，分別取100ul加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各相應(yīng)孔中，混 勻后倍比2稀釋，設(shè)8個(gè)稀釋度，每個(gè)濃度3復(fù)孔，并設(shè)1孔1640培養(yǎng)基對(duì)照用于酶標(biāo)儀調(diào) 零。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置37。C、 5%的<302飽和濕度條件下培養(yǎng)44小時(shí)。取CCK-8溶液10 lU加入各孔，繼續(xù)孵育lh后，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處OD值并記錄。計(jì)算各濃度OD值的均 數(shù)并繪制細(xì)胞增殖曲線。
結(jié)果用上述三種方法測(cè)定Huvec孵育44小時(shí)后的增殖活性，繪制的細(xì)胞增殖曲線的比 較如圖l、圖2所示，雖然三種測(cè)定方法需選擇三個(gè)不同波長(zhǎng)(570nm、 540nm和450nm),并 且所測(cè)OD值相差較大，尤其是蘇木素染色法最高OD值僅為0.27,而CCK-8比色法OD值 則接近3.0，但是三種方法所測(cè)OD值不僅線性關(guān)系良好，而且具有相似的反應(yīng)曲線(見(jiàn)圖1、 2)。蘇木素染色法和MTT法對(duì)M21細(xì)胞增殖活性的比較如圖3所示。蘇木素染色法和MTT比 色法測(cè)定結(jié)果顯示，M21細(xì)胞孵育44小時(shí)后，在一定密度范圍內(nèi)細(xì)胞數(shù)量與OD值呈線性關(guān) 系，而M21細(xì)胞濃度為1X1(^/L時(shí)，由于細(xì)胞密度大或培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)而引起細(xì)胞所需營(yíng)養(yǎng)消耗 快，從而導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡或生長(zhǎng)不良，則OD值呈下降趨勢(shì)(圖3)。
實(shí)施例2:
()蘇木素染色法檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞系的毒性作用 分別取M21、 SGC7901和VX2細(xì)胞，用0. 25%的胰酶消化離心后棄上清，用完全培養(yǎng)基調(diào) 相應(yīng)的細(xì)胞濃度，依次加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100wl/孔。將96孔板置37。C、 5%的C02 飽和濕度條件下孵育過(guò)夜使其貼壁。將VCR、 5-Fu、 CDDP和金養(yǎng)麥提取物依次稀釋5或6個(gè) 不同的濃度，分別加入96孔板各相應(yīng)孔中，100yl/孔，3復(fù)孔/濃度，另設(shè)6-9孔無(wú)藥物細(xì) 胞對(duì)照和1孔1640培養(yǎng)基酶標(biāo)儀調(diào)零孔，每孔液體總量為200 "1。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置37 'C、 5%的C02飽和濕度條件下孵育44小時(shí)。取出96孔細(xì)胞培養(yǎng)板甩棄上清，立即加入4% 的多聚甲醛溶液，150yl/孔，固定20分鐘后收集固定液；PBS洗3次，棄上清，室溫晾干； 取蘇木素染色液，每孔加入100iU， 20分鐘后收集染色液；蒸餾水洗3 5次以去除未結(jié)合 的染料，室溫晾干；于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞著色狀況，再加入1%的鹽酸酒精，100ul/孔， 此時(shí)各孔液體呈現(xiàn)不同程度的粉紅色，20分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定540nm處的吸光度值并記錄， 不同藥物的抑瘤率計(jì)算公式如下
(2) MTT比色法檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞系的毒性作用按文獻(xiàn)田志剛，張建華MTT法在檢 測(cè)細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒效應(yīng)中的應(yīng)用中國(guó)腫瘤生物治療雜志1994; I (1): 74中的方法進(jìn)行， 步驟略。
結(jié)果蘇木素染色法和MTT比色法測(cè)定VCR、 5-Fu對(duì)M21和SGC7901細(xì)胞的毒性作 用，結(jié)果顯示兩種腫瘤細(xì)胞系對(duì)藥物均有劑量反應(yīng)關(guān)系，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好(CV^86/。)。有趣的 是蘇木素染色法所測(cè)抑瘤率均高于MTT比色法所測(cè)抑瘤率(圖4、 5、 6、 7)，本研究認(rèn)為蘇木 素染色法所測(cè)結(jié)果接近顯微鏡下觀察結(jié)果。因?yàn)樘K木素染色法僅能使固定前的活細(xì)胞著色， 而固定前已死亡的細(xì)胞及碎片不能吸附染料，表明此方法具有較強(qiáng)的特異性和穩(wěn)定性。圖9 顯示順鉑對(duì)VX2細(xì)胞具有良好的抑瘤作用，兩種方法所測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系。 實(shí)施例3: CCK-8比色法檢測(cè)金蕎麥提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用 分別取M21、 SGC7901細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化離心后，完全培養(yǎng)基調(diào)相應(yīng)的細(xì)胞濃度，依次加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100lU/孔。將96孔板置37°C、 5%的(302飽和濕度條件 下孵育過(guò)夜使其貼壁。將金蕎麥提取物稀釋6個(gè)不同濃度，依次加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各相應(yīng) 孔中，100ul/孔，3復(fù)孔/濃度，另設(shè)無(wú)藥物細(xì)胞對(duì)照6孔和1孔1640培養(yǎng)基酶標(biāo)儀調(diào)零孔， 每孔液體總量為200ul。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置37'C、 5% C02孵箱中孵育44小時(shí)。取出96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用微量移液器輕輕吸棄100yl上清，然后加入CCK-8溶液10ixl/孔。37'C繼 續(xù)孵育1小時(shí)，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處OD值并記錄結(jié)果。抑瘤率的計(jì)算公式同實(shí)施例2。
結(jié)果采用MTT比色法、CCK-8比色法和蘇木素染色法測(cè)定金蕎麥提取物對(duì)SGC7901 和M21細(xì)胞的毒性作用。MTT比色法所測(cè)OD值基本是一直線，無(wú)劑量依賴關(guān)系(結(jié)果未 列)。圖9表明CCK-8比色法顯示金蕎麥提取物在400mg/L和200mg/L對(duì)SGC7901細(xì)胞有 較強(qiáng)的毒性作用，100mg/L以下濃度OD值均高于無(wú)藥物細(xì)胞對(duì)照孔，但鏡下觀察發(fā)現(xiàn) 100mg/L各孔中的細(xì)胞卻有50%左右死亡破碎。同時(shí)50mg/L和25mg/L各實(shí)驗(yàn)孔中的細(xì)胞均 有不同程度的死亡，而無(wú)藥對(duì)照組各孔細(xì)胞生存狀態(tài)良好，基本無(wú)細(xì)胞死亡，但OD值卻呈 下降趨勢(shì)。蘇木素染色法所測(cè)OD值不僅線性關(guān)系良好，同時(shí)鏡下觀察不同藥物濃度各孔細(xì) 胞生存狀態(tài)與所測(cè)OD值相符(圖10)。采用兩種方法檢測(cè)金蕎麥提取物對(duì)M21細(xì)胞的毒性作 用結(jié)果與SGC7901細(xì)胞相似。雖然CCK-8比色法所測(cè)OD值線性關(guān)系尚可(圖11、 12)，但 在金蕎麥提取物為100mg/L時(shí)，OD值雖然比無(wú)藥物對(duì)照孔略低，鏡下觀察各孔M21細(xì)胞狀 態(tài)較差，細(xì)胞死亡明顯(圖13)與無(wú)藥物細(xì)胞對(duì)照孔相比差異較大(圖14)，提示CCK-8比 色法和MTT比色法不能真實(shí)地反映藥物作用后細(xì)胞的生存狀態(tài)。蘇木素染色法所測(cè)金蕎麥提 取物對(duì)M21細(xì)胞的毒性作用線性關(guān)系良好，證明該方法穩(wěn)定、特異，具有良好的可重復(fù)性 (CV<8%)。
以上實(shí)施例所用到的材料、主要試劑及主要儀器來(lái)源如下
A、 細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
M21 (人黑素瘤細(xì)胞)和Huvec (人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)，均可從美國(guó)菌種保藏中心購(gòu)買； SGC7901 (人胃腺癌細(xì)胞)可從中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買。VX2細(xì)胞為 兔鱗狀細(xì)胞癌，本實(shí)驗(yàn)室將VX2腫瘤組織塊分離成單個(gè)細(xì)胞，并在體外連續(xù)培養(yǎng)了 300余天， 體外傳100余代，凍存復(fù)蘇后生物學(xué)特性未見(jiàn)改變，已建系，武漢大學(xué)可提供體內(nèi)傳代腫瘤 組織塊。
B、 主要試劑
蘇木素(上海進(jìn)口分裝)，按文獻(xiàn)李文，張賽霞常用蘇木素幾種配方與染色結(jié)果的比較 解剖學(xué)雜志，2000; 23 (4): 393配制Carazzi蘇木素染色液;1%鹽酸酒精溶液，鹽酸和酒精體積分?jǐn)?shù)分別為1%和70%;
4%的多聚甲醛，按文獻(xiàn)《組織培養(yǎng)和細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(鄂征，北京出版社P146)方法配制; MTT (四甲基偶氮唑鹽，F(xiàn)luka產(chǎn)品)，用生理鹽水溶解為5g/L，過(guò)濾除菌； 體積分?jǐn)?shù)為1(P/。的SDS (十二垸基硫酸鈉，Sigma產(chǎn)品)水溶液； CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品；
RPMI1640培養(yǎng)基(GiBCO產(chǎn)品)，按說(shuō)明書配制，內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清(國(guó)產(chǎn)) 或胎牛血清(GiBCO產(chǎn)品)，為完全培養(yǎng)基(CM);
胰酶Hanks溶液，將體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶溶于Hanks溶液中；
長(zhǎng)春新堿(浙江海正藥業(yè)有限公司)、5-氟尿嘧啶(上海旭東海普藥業(yè)有限公司)、順鈾 (山東省齊魯制藥廠)，均用生理鹽水溶解至相應(yīng)的濃度，-20^凍存?zhèn)溆茫?br> 金蕎麥提取物(云南曲靖格力康生物科技發(fā)展公司)，20M的乙醇溶液溶解后-2(TC凍存
備用o
C、主要儀器-
BioRad550酶標(biāo)儀(美國(guó)BioRad公司產(chǎn)品)，C02孵育箱(日本ESPEC)， 8通道微量移 液器(法國(guó)吉爾森公司產(chǎn)品)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司)，100目不銹鋼網(wǎng)等，其余略。
最后，需要指出蘇木素染色法在該領(lǐng)域的應(yīng)用尚處于起步階段，測(cè)定結(jié)果的最大OD 值一般在1.0以下，存在線性范圍較窄的問(wèn)題，如何進(jìn)一步提高活細(xì)胞對(duì)染料的吸附能力或 尋找更合適的脫色液增強(qiáng)顯色強(qiáng)度，進(jìn)一步提高其靈敏度是今后需解決的關(guān)鍵所在。另外， 在應(yīng)用蘇木素染色法進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)時(shí)，嚴(yán)格控制起始細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞孵育時(shí)間、細(xì)胞固定、 染色和脫色時(shí)間等亦是獲得滿意實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基本條件。
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權(quán)利要求
1.蘇木素在測(cè)定細(xì)胞增殖活性和藥物對(duì)細(xì)胞毒效應(yīng)中的應(yīng)用。
2. —種利用蘇木素測(cè)定貼壁細(xì)胞增殖活性的方法，其特征在于，步驟如下取已稀釋好的待 測(cè)細(xì)胞懸液，置于細(xì)胞培養(yǎng)板的各相應(yīng)孔板中，每孔200tU，于37'C、體積分?jǐn)?shù)為5%的 CCb飽和濕度條件下，孵育44小時(shí)，甩棄上清，立即加入4%的多聚甲醛溶液，每孔IOO Hl，固定20分鐘后收集固定液，PBS洗3次，棄上清，室溫晾千；取蘇木素染色液，每 孔加入100iU， 20分鐘后收集染色液，蒸餾水洗3 5次，以去除未結(jié)合的染料，室溫晾 干；于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞著色狀況，再加入1%的鹽酸酒精，100lU/孔，此時(shí)各孔液 體呈現(xiàn)不同程度的粉紅色，20分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定540nm處的吸光度值并記錄，取各組 OD值均數(shù)并繪制細(xì)胞系增殖曲線。
3. —種利用蘇木素測(cè)定藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞系毒性作用的方法，其特征在于，步驟如下取待測(cè) 細(xì)胞液，置于細(xì)胞培養(yǎng)板的孔板中，每孔200ul，同時(shí)設(shè)定無(wú)藥物細(xì)胞對(duì)照和培養(yǎng)基酶標(biāo) 儀調(diào)零孔，于37'C、體積分?jǐn)?shù)為5y。的C02飽和濕度條件下，孵育44小時(shí)；取出細(xì)胞培 養(yǎng)板甩棄上清，立即加入4%的多聚甲醛溶液，150"1/孔，固定20分鐘后收集固定液； PBS洗3次，棄上清，室溫晾干；取蘇木素染色液，每孔加入100ul， 20分鐘后收集染 色液；蒸餾水洗3 5次以去除未結(jié)合的染料，室溫晾千；于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞著色 狀況，再加入1%的鹽酸酒精，100tU/ L，此時(shí)各孔液體呈現(xiàn)不同程度的粉紅色，20分鐘 內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定540nm處的吸光度值并記錄，按下式計(jì)算藥物的抑瘤率抑瘤率(％)=1 —O，(實(shí)驗(yàn)孔X) X100%; 、J OD值一胞對(duì)照孔J^其中，OD值(試驗(yàn)孔X)表示實(shí)驗(yàn)組各孔OD值的均數(shù)；OD值(細(xì)胞對(duì)照孔I)表示 無(wú)藥細(xì)胞對(duì)照組各孔OD值的均數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了蘇木素在測(cè)定貼壁細(xì)胞增殖活性和藥物對(duì)貼壁細(xì)胞毒性作用中的應(yīng)用，利用蘇木素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，然后測(cè)定特定波長(zhǎng)下的吸光度值，從而得出相應(yīng)的數(shù)據(jù)和結(jié)論。發(fā)明人采用蘇木素染色法對(duì)SGC7901、M21和Huvec等貼壁細(xì)胞不同時(shí)相(12h、24h、48h、72h)細(xì)胞增殖活性的多次測(cè)定結(jié)果均表明，此方法不僅特異性高，且CV＜3％，具有較好的可重復(fù)性。本發(fā)明具有靈敏度高、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、適用范圍廣、成本低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101603068SQ200910016250
公開(kāi)日2009年12月16日 申請(qǐng)日期2009年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月23日
發(fā)明者張建華, 王郡甫, 紅 陳 申請(qǐng)人:山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所