一種非診斷目的檢測淋巴細(xì)胞增殖情況的方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及細(xì)胞增殖檢測領(lǐng)域，特別涉及一種非診斷目的檢測淋巴細(xì)胞增殖情況的方法及其試劑盒。該方法包括：將第一待測血液樣本與淋巴細(xì)胞多克隆激活劑混合，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，獲得第一血液細(xì)胞；將熒光標(biāo)記的淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記抗體與第一血液細(xì)胞進(jìn)行孵育，裂解紅細(xì)胞，加入絕對計(jì)數(shù)用微球，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞數(shù)量和絕對計(jì)數(shù)用微球數(shù)量，根據(jù)淋巴細(xì)胞數(shù)量、絕對計(jì)數(shù)用微球數(shù)量和絕對計(jì)數(shù)用微球濃度獲得刺激組淋巴細(xì)胞的濃度。本發(fā)明不僅可檢測淋巴細(xì)胞各亞群的增殖比例，還可檢測淋巴細(xì)胞各亞群增殖的絕對值，可準(zhǔn)確反應(yīng)淋巴細(xì)胞的增殖情況；使用全血進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)，不需要分離PBMC，血標(biāo)本量要求很小；操作步驟簡易，耗時(shí)短，誤差較小。
【專利說明】一種非診斷目的檢測淋巴細(xì)胞增殖情況的方法及其試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞增殖檢測領(lǐng)域，特別涉及一種非診斷目的檢測淋巴細(xì)胞增殖情況 的方法及其試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)免疫缺陷病（Primaryimmunodeficiencydisease,PID)系因相關(guān)基因突變導(dǎo) 致免疫細(xì)胞或其組成成分量或質(zhì)的變化，導(dǎo)致機(jī)體對多種病原體易感性顯著增高的疾病。 迄今已發(fā)現(xiàn)的約200多種PID中，已有200余個(gè)基因突變被明確。而免疫功能評估對PID的 診斷及預(yù)后具有重要意義。一方面，已經(jīng)基因確診的PID患兒進(jìn)行免疫功能評估有助于判 斷患兒的病情嚴(yán)重程度，指導(dǎo)臨床用藥，為臨床治療以及造血干細(xì)胞移植提供參考意見；另 一方面，對疑診的PID患兒進(jìn)行免疫功能評估可以為診斷提供線索，并為下一步基因篩查 及診斷治療提供幫助。免疫功能的初步評估通常運(yùn)用全血細(xì)胞計(jì)數(shù)，總的和特異的免疫球 蛋白水平測定，聯(lián)合分析補(bǔ)體系統(tǒng)，評估淋巴細(xì)胞不同亞群的數(shù)量。但是這些檢測指標(biāo)還不 夠，因?yàn)镻ID的臨床表現(xiàn)不一定是由于細(xì)胞數(shù)量的減少導(dǎo)致，而是跟細(xì)胞功能的缺失有關(guān)。
[0003] 淋巴細(xì)胞增殖和分化是機(jī)體免疫應(yīng)答過程的一個(gè)重要階段。因此，檢測淋巴細(xì)胞 增殖水平是細(xì)胞免疫研究和臨床免疫功能檢測的一種常用方法。目前，檢測淋巴細(xì)胞增殖 水平的方法主要包括形態(tài)學(xué)觀察法、放射性核素（3H-TdR，1251-UdR)摻入法、核苷類似物 (BrDU)溴脫氧尿苷摻入法、細(xì)胞能量代謝測定（MTT比色法）和CFSE(羧基熒光素乙酰酸琥 珀酰亞胺酯）染色流式測定法：
[0004](一）形態(tài)學(xué)觀察法
[0005] 形態(tài)學(xué)觀察法是依據(jù)淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的形態(tài)學(xué)特征，借助光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢測。 但其存在多種不足，主要體現(xiàn)在：用形態(tài)觀察的方法判斷淋巴細(xì)胞增殖情況，準(zhǔn)確性較差； 該法只能分析總的淋巴細(xì)胞的增殖情況，無法判斷淋巴細(xì)胞亞群的增殖情況；需要分離外 周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)，血標(biāo)本量要求較大（通常>4mL)，在小年齡患者中收集標(biāo)本更困 難；該法只能計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖比例，不能得到細(xì)胞增殖的絕對值。
[0006] (二）放射性核素（3H-TdR，1251-UdR)摻入法
[0007] 放射性核素（3H-TdR，1251-UdR)摻入法是指增殖的細(xì)胞其新合成DNA需攝取核苷 酸原料，故可用核素標(biāo)記的核苷酸參與反應(yīng)，通過測定放射性強(qiáng)度以反映淋巴細(xì)胞增殖水 平。其不足之處包括：標(biāo)記為放射性核素，存在放射性污染危險(xiǎn)；該法只能分析總的淋巴細(xì) 胞的增殖情況，無法判斷淋巴細(xì)胞亞群的增殖情況；需要分離PBMC，血標(biāo)本量要求較大（通 常>4mL)，在小年齡患者中收集標(biāo)本更困難；該法只能計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖比例，不能得到細(xì) 胞增殖的絕對值。
[0008] (三）核苷類似物（BrDU)溴脫氧尿苷摻入法
[0009] 核苷類似物（BrDU)溴脫氧尿苷摻入法的原理同放射性核素?fù)饺敕ǖ脑斫疲?其不足之處包括：該法敏感度不高；該法只能分析總的淋巴細(xì)胞的增殖情況，無法判斷淋 巴細(xì)胞亞群的增殖情況；需要分離PBMC，血標(biāo)本量要求較大（通常>4mL)，在小年齡患者中 收集標(biāo)本更困難；該法只能計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖比例，不能得到細(xì)胞增殖的絕對值。
[0010](四）細(xì)胞能量代謝測定（MTT比色法）
[0011] 細(xì)胞能量代謝測定（MTT比色法）是指活細(xì)胞內(nèi)有活性的線粒體作用于噻唑藍(lán) (MTT)，可生產(chǎn)藍(lán)黑色甲替產(chǎn)物，其生成量與細(xì)胞代謝活躍程度呈正相關(guān)，由此間接定量分 析細(xì)胞增殖水平。其不足之處包括：該法為間接評估淋巴細(xì)胞增殖狀況的方法，是通過計(jì)算 活細(xì)胞的比率，而非直接檢測分裂的細(xì)胞數(shù)；該法只能分析總的淋巴細(xì)胞的增殖情況，無法 判斷淋巴細(xì)胞亞群的增殖情況；需要分離PBMC，血標(biāo)本量要求較大（通常>4mL)，在小年齡 患者中收集標(biāo)本更困難；該法只能計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖比例，不能得到細(xì)胞增殖的絕對值。
[0012] (五）CFSE(羧基熒光素乙酰酸琥珀酰亞胺酯）染色流式測定法
[0013]CFSE(羧基熒光素乙酰酸琥珀酰亞胺酯）染色流式測定法是指用流式細(xì)胞術(shù)檢測 增殖后的CFSE標(biāo)記的細(xì)胞，以及該群細(xì)胞的表面標(biāo)志分子，從而分析目標(biāo)細(xì)胞的增殖動(dòng)力 學(xué)。由于CFSE是非極性分子，可自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，在胞內(nèi)酯酶水解后產(chǎn)生具有熒光特性 的CFSE，并與胞內(nèi)蛋白的賴氨酸等胺基發(fā)生不可逆偶聯(lián)，形成穩(wěn)定的大分子熒光結(jié)合物。當(dāng) 細(xì)胞分裂時(shí)，熒光結(jié)合物平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中，而熒光強(qiáng)度為親代細(xì)胞的一半。在一個(gè) 增殖細(xì)胞群體中，連續(xù)各代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度表現(xiàn)為二倍遞減的特征，所以CFSE標(biāo)記的細(xì)胞 在增殖后具有系列減半的熒光強(qiáng)度這一特點(diǎn)。其不足之處包括：需要分離PBMC，血標(biāo)本量 要求較大（通常>4mL)，在小年齡患者中收集標(biāo)本更困難；PBMC的提取后，通常后續(xù)要多次 洗滌，可能活化，損傷，或選擇性地丟失細(xì)胞；該法只能計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖比例，不能得到細(xì) 胞增殖的絕對值；操作步驟繁復(fù)，誤差較大，而且該方法是基于在刺激組和未刺激組的最初 的PBMC數(shù)量（而不是淋巴細(xì)胞數(shù)量）是相同的，而且后續(xù)多次的洗滌吹打可能引入更多的 誤差；CFSE染色要求均勻，CFSE高濃度時(shí)有一定毒性。
[0014] 基于上述幾種淋巴細(xì)胞增殖水平檢測方法存在的不足，急需開發(fā)一種不需要分離 PBMC，血液標(biāo)本量要求少，不僅能得到淋巴細(xì)胞增殖比例和絕對值，還可以得到分析總的淋 巴細(xì)胞的增殖情況和淋巴細(xì)胞各亞群的增殖情況，操作簡易、誤差小的淋巴細(xì)胞增殖水平 的檢測方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種非診斷目的檢測淋巴細(xì)胞增殖情況的方法及其試劑 盒。該方法不僅可以檢測淋巴細(xì)胞各亞群的增殖比例，還可以檢測淋巴細(xì)胞各亞群增殖的 絕對值，可準(zhǔn)確反應(yīng)淋巴細(xì)胞的增殖情況；使用全血進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)，不需要分離PBMC，血標(biāo) 本量要求很小，最多只需要300yL，是現(xiàn)有技術(shù)用血量的5% ;操作步驟簡易，耗時(shí)短，誤差 較小。
[0016] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0017] 本發(fā)明提供了一種非診斷目的檢測淋巴細(xì)胞增殖情況的方法，包括如下步驟：
[0018] 將第一待測血液樣本與淋巴細(xì)胞多克隆激活劑混合，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，獲得第一血液 細(xì)胞；將熒光標(biāo)記的淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記抗體與第一血液細(xì)胞進(jìn)行孵育，裂解紅細(xì)胞，加入絕 對計(jì)數(shù)用微球，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞數(shù)量和絕對計(jì)數(shù)用微球數(shù)量，根據(jù)淋巴細(xì)胞 數(shù)量、絕對計(jì)數(shù)用微球數(shù)量和絕對計(jì)數(shù)用微球濃度獲得刺激組淋巴細(xì)胞的濃度；
[0019] 將第二待測血液樣本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，獲得第二血液細(xì)胞；將熒光標(biāo)記的淋巴細(xì)胞 表面標(biāo)記抗體與第二血液細(xì)胞進(jìn)行孵育，裂解紅細(xì)胞，加入絕對計(jì)數(shù)用微球，采用流式細(xì)胞 術(shù)檢測淋巴細(xì)胞數(shù)量和絕對計(jì)數(shù)用微球數(shù)量，根據(jù)淋巴細(xì)胞數(shù)量、絕對計(jì)數(shù)用微球數(shù)量和 絕對計(jì)數(shù)用微球濃度獲得未刺激組淋巴細(xì)胞的濃度；
[0020] 比較刺激組淋巴細(xì)胞的濃度與未刺激組淋巴細(xì)胞的濃度，獲得淋巴細(xì)胞增殖情 況；
[0021] 第一待測血液樣本與所述第二待測血液樣本的來源相同。
[0022] 淋巴細(xì)胞（lymphocyte)是白細(xì)胞的一種，由淋巴器官產(chǎn)生，機(jī)體免疫應(yīng)答功能的 重要細(xì)胞成分，是體內(nèi)極為復(fù)雜的不均一細(xì)胞群體，包括許多形態(tài)上相似而功能不同的亞 群，功能和表面標(biāo)記各不相同，具有明顯的異質(zhì)性。根據(jù)淋巴細(xì)胞的發(fā)育部位、表面、抗原、 受體及功能等不同，可將淋巴細(xì)胞分為T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等多種。T淋巴細(xì) 胞和B淋巴細(xì)胞是其中最主要的兩大群體。
[0023] T淋巴細(xì)胞（又名T細(xì)胞）和B淋巴細(xì)胞（又名B細(xì)胞）都起源于造血干細(xì)胞。T 細(xì)胞隨血循環(huán)到胸腺，在胸腺激素等的作用下成熟，然后再隨血循環(huán)到周圍淋巴器官，在各 自既定的區(qū)域定居、繁殖。受抗原激活即分化增殖，產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞，行使其免疫功能。T淋巴 細(xì)胞的免疫功能主要是抗胞內(nèi)感染、瘤細(xì)胞與異體細(xì)胞等。B細(xì)胞則在骨髓或腔上囊發(fā)育成 熟，可以釋放淋巴因子促進(jìn)T細(xì)胞的形成。B淋巴細(xì)胞可以增殖分化為效應(yīng)B淋巴細(xì)胞（所 謂的漿細(xì)胞）和記憶B淋巴細(xì)胞，而效應(yīng)B淋巴細(xì)胞可以釋放抗體（免疫球蛋白），作用于 抗原，形成沉淀物，最終被吞噬細(xì)胞吞噬。淋巴細(xì)胞的增殖和分化是機(jī)體免疫應(yīng)答過程的一 個(gè)重要階段。因此，檢測淋巴細(xì)胞增殖水平是細(xì)胞免疫研究和臨床免疫功能檢測的一種常 用方法。
[0024] 在淋巴細(xì)胞表面具有可供鑒別的特殊結(jié)構(gòu)，這一特殊結(jié)構(gòu)為表面標(biāo)記。在淋巴細(xì) 胞的不同分化階段，其各種表面標(biāo)記的表達(dá)也各不相同。淋巴細(xì)胞與其它細(xì)胞之間、與周圍 環(huán)境中的分子間的相互作用以及淋巴細(xì)胞識別抗原、活化、輔助、抑制、殺傷等生物學(xué)作用 均與其表面標(biāo)記有關(guān)。因此，淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記可用于淋巴細(xì)胞及其亞群的鑒別。淋巴細(xì) 胞表面標(biāo)記主要包括簇分化抗原（⑶)、組織相容性抗原（MHC)等。
[0025] CD是淋巴細(xì)胞在分化成熟過程中，不同的發(fā)育階段和不同亞類的淋巴細(xì)胞可表達(dá) 不同的分化抗原，這是區(qū)分淋巴細(xì)胞的重要標(biāo)記。淋巴細(xì)胞表面主要⑶抗原及其分布見表 1〇
[0026] 表1參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞表面主要⑶抗原及其分布
[0027]

【權(quán)利要求】
1. 一種非診斷目的檢測淋巴細(xì)胞增殖情況的方法，其特征在于，包括如下步驟： 將第一待測血液樣本與淋巴細(xì)胞多克隆激活劑混合，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，獲得第一血液細(xì)胞； 將熒光標(biāo)記的淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記抗體與所述第一血液細(xì)胞進(jìn)行孵育，裂解紅細(xì)胞，加入絕 對計(jì)數(shù)用微球，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞數(shù)量和絕對計(jì)數(shù)用微球數(shù)量，根據(jù)所述淋巴 細(xì)胞數(shù)量、所述絕對計(jì)數(shù)用微球數(shù)量和絕對計(jì)數(shù)用微球濃度獲得刺激組淋巴細(xì)胞的濃度； 將第二待測血液樣本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，獲得第二血液細(xì)胞；將熒光標(biāo)記的淋巴細(xì)胞表面 標(biāo)記抗體與所述第二血液細(xì)胞進(jìn)行孵育，裂解紅細(xì)胞，加入絕對計(jì)數(shù)用微球，采用流式細(xì)胞 術(shù)檢測淋巴細(xì)胞數(shù)量和絕對計(jì)數(shù)用微球數(shù)量，根據(jù)所述淋巴細(xì)胞數(shù)量、所述絕對計(jì)數(shù)用微 球數(shù)量和絕對計(jì)數(shù)用微球濃度獲得未刺激組淋巴細(xì)胞的濃度； 比較所述刺激組淋巴細(xì)胞的濃度與所述未刺激組淋巴細(xì)胞的濃度，獲得淋巴細(xì)胞增殖 情況； 所述第一待測血液樣本與所述第二待測血液樣本的來源相同。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記抗體為T淋巴細(xì)胞 表面標(biāo)記抗體和/或B淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記抗體為CD3抗 體、⑶8抗體、⑶45抗體、⑶4抗體、⑶14抗體或⑶15抗體中的一種或兩者以上的混合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述B淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記抗體包括CD3抗 體、⑶45抗體、⑶19抗體、⑶14抗體或⑶15抗體中的一種或兩者以上的混合物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述淋巴細(xì)胞多克隆激活劑為PWM或 PHA。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測血液樣本的用量不大于300 y L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)具體為在35°C?40°C、4? 6% C02的條件下培養(yǎng)5?10天。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育具體為：在20°C?30°C避光條 件下孵育1〇?30min。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解所用的試劑為溶血素。
10. -種檢測淋巴細(xì)胞增殖情況的試劑盒，其特征在于，包括淋巴細(xì)胞多克隆激活劑、 熒光標(biāo)記的淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記抗體，溶血素、絕對計(jì)數(shù)用微球和抗凝劑。
【文檔編號】G01N15/10GK104458539SQ201410786994
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月17日
【發(fā)明者】趙曉東, 秦濤 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院