專利名稱：淫羊藿黃酮及其有效成分在制備促進神經(jīng)細胞增殖和分化作用藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及淫羊藿黃酮及其有效成分淫羊藿苷在制備促進神經(jīng)細 胞增殖和分化藥物中的用途以及用所述藥物治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方 法。本發(fā)明另一方面涉及用于治療或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)疾病的含淫羊蓬黃 酮或其有效成分的藥物組合物。技術(shù)背景神經(jīng)干細胞(neural stem cell, NSC)是指來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng) 或能分化為中樞神經(jīng)系統(tǒng)成熟神經(jīng)細胞的多潛能細胞。神經(jīng)干細胞具 有自我更新能力和多分化潛能，可分化為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、少 突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞等。神經(jīng)干細胞產(chǎn)生的子代細胞對中樞神 經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、維持以及實施細胞替代治療具有重要作用。同時，大 量體外和在體實驗已經(jīng)證實，成年哺乳動物腦中也存在NSC，這些細 胞在正常情況下處于靜息狀態(tài)；在生長因子或病理狀態(tài)等刺激下，可 以增殖、遷移和分化，新生的神經(jīng)元可替代丟失的神經(jīng)細胞發(fā)揮一定 的功能.神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)和體外分離培養(yǎng)成功，為神經(jīng)系統(tǒng)變性疾 病如帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)、亨廷頓病(HD)和肌萎縮側(cè)索 硬化(ALS)等的細胞替代療法拓寬了道路，可以明顯改善癥狀。此外， 多種原因?qū)е碌闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)損傷如缺血性腦或脊髄損傷、腦或脊髄 外傷等，可以引起神經(jīng)細胞數(shù)目減少。因此，研究有效的促進NSC增 殖和分化的方法，可以為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷等各種原因?qū)е碌某?現(xiàn)神經(jīng)元缺失的疾病提供重要的手段。淫羊蓑是我國傳統(tǒng)補腎中藥。本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過廣泛深入研究， 并令人驚奇地發(fā)現(xiàn)淫羊榮黃酮及其有效成分淫羊藿苷對神經(jīng)干細胞有良好的促增殖和促分化作用，因而完成了此發(fā)明。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了淫羊藿黃酮及其有效成分淫羊藿苷在制備促進神經(jīng) 干細胞增殖和分化作用的藥物中的用途。本發(fā)明淫羊藿黃酮中淫羊藿苷的含量為40%-90%,例如60%。淫羊 S普(icariin， 。3 hoo ois系統(tǒng)命名為3-((6-脫氧吡喃甘露糖基)氧 基)-7-(吡喃葡糖基氣基)-5-羥基-2- (4-曱氧基苯基)-8- (3-甲基-2-丁 烯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮；分子量674.69 )，結(jié)構(gòu)如下OH OH淫羊蓑黃酮和淫羊藿苷可以由市售購得。它們可用于促進神經(jīng)干 細胞增殖和分化，特別用于治療各種原因?qū)е碌某霈F(xiàn)神經(jīng)元缺失的疾 病，包括神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，包含但不僅于帕金森病、阿爾茨海默病、 享廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化遺傳性、運動失調(diào)病、脊髄源性肌肉萎縮 與相關(guān)疾病、影響神經(jīng)系統(tǒng)的系統(tǒng)性萎縮病、基底節(jié)退行性疾病、肌 張力障礙或原發(fā)性的錐體外系疾?。恢袠猩窠?jīng)損傷，包含但不僅于缺血性、外傷性、以及酒精性腦或脊髓損傷。本發(fā)明通過對神經(jīng)元修復(fù) 來治療上述疾病。本發(fā)明也可用于預(yù)防上述疾病。本發(fā)明另一方面提供了舍有淫羊蓉黃酮和/或淫羊藿苷的藥物組 合物，以及用所述藥物組合物治療或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的迅速更新進步，人類將有可能研制出對已經(jīng) 發(fā)育完善的成體神經(jīng)細胞的增殖與分化技術(shù)?；谝蜣近S酮/淫羊藿苷對神經(jīng)干細胞的促增殖與分化作用，淫羊愛黃酮/淫羊藿苷對成體神 經(jīng)細胞也可能有促増殖與分化作用，進而治療各種原因?qū)е碌囊陨窠?jīng)元 缺失為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。以上所述淫羊菱黃酮和/或淫羊藿苷的方法和用途可以是單獨應(yīng) 用促使神經(jīng)疾病患者神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)尚存的干細胞增殖和分化，或者是對 外源性干細胞移植到神經(jīng)疾病患者神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)進行增殖和分化達到治療或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)疾病目的。本發(fā)明的淫羊著黃酮和/或淫羊藿苷可按照本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)經(jīng) 與可藥用栽體混合制成藥物組合物或各種常規(guī)劑型，并按常規(guī)給藥方 式給藥。適當?shù)慕o藥劑量可由主治醫(yī)師根據(jù)疾病的性質(zhì)、疾病的嚴重 程度、患者的年齡和體重等因素決定。由此，本發(fā)明還涉及淫羊葉苷類似物在治療各種原因?qū)е碌囊陨窠?jīng) 元缺失為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的用途。淫羊藿苷類似物是指與淫羊藿苷 的實質(zhì)性結(jié)構(gòu)具有相似性的分子，例如其化學(xué)基團由保護基保護后形成的分子。例如，其羥基被Cl-6烷基或由素取代的衍生物以及其與可藥 用有機酸如乙酸或無機酸如鹽酸等形成的酯。適當?shù)谋Ｗo基是本領(lǐng)域技 術(shù)人員/〉知的。該組合物的組份可以從任何合適來源獲得。例如，它們可以是提 純的形式或者它們可以是草藥的形式，或者優(yōu)選地是草藥的提取物形 式，或草藥的園藝或植物等價物形式，或草藥提取物的化學(xué)或功能等 價物形式，也可以通過幾種化學(xué)合成物的配方獲得。本發(fā)明組合物預(yù)計口服給藥，雖然給藥可以通過任何合適方式， 例如靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、局部、栓劑途徑或植入(緩 慢釋放分子)。該組合物的藥用形式可以是適于注射用，例如無菌水溶液和用于臨時配制無菌注射液或分散液的無菌粉末。該組合物在制備和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，并且必需在抵抗孩史 生物例如細菌和真菌污染作用的條件下保存。栽體可以是溶劑或分散 基質(zhì)，例如包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二 醇等)、它們的合適的混合物和植物油?？梢跃S持合適的流動性，例 如通過應(yīng)用包衣例如卵磷脂。各種抗微生物劑和抗真菌劑例如對羥基 苯甲酸酯類、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等可以預(yù)防微生物 作用。在許多情況下，優(yōu)選包含等滲物質(zhì)，例如糖或氯化鈉。在組合 物中應(yīng)用延遲吸收劑例如單硬脂酸鋁和明膠可以帶來注射用組合物的延遲吸收a無菌注射液的制備是將活性化合物以需要的量加入到按需要有各 種上面列舉的其它成分的合適的溶劑中，然后過濾滅菌。對于用于制 備無菌注射液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技 術(shù)，得到活性成分的粉末，加上先前滅菌過濾溶液的任何另外的所需 成分。該組合物可以口服給予，例如，與惰性稀釋劑或可同化的可食用 的栽體一起給予，或它可以被包裹在硬或軟殼的明膠膠囊中，或者它 可以被壓制成片劑，或者它可以是粉末形式或直接加入飲食的食物中。 對于口服治療性和/或預(yù)防性給藥，該活性化合物可以被加入賦形劑并 且以可吸收片劑、含片、錠劑、膠嚢、酏劑、混懸劑、糖漿、糯米紙 囊劑等的形式被應(yīng)用。寬廣的劑量范圍可以適用，取決于患者、病情的嚴重性和用于給 藥的途徑和介質(zhì)。在這種有治療作用的組合物中活性化合物的量是將 獲得適宜的劑量。制備按照本發(fā)明的優(yōu)選的組合物，這樣口服劑量單元形式包含約0. OlMg至約2000mg之間活性化合物。可選的量包括約 l.Oyg至約1500邁g之間，約ljig至約1000mg之間和約lOpg至約 500旭g之間。片劑、錠劑、丸劑、膠嚢等也可以包含下面列出的成分粘合劑 例如樹膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑例如磷酸二鉀；崩解劑例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等；潤滑劑例如硬脂酸鎂；和可 以添加甜味劑例如蔗糖、乳糖或糖精或調(diào)味劑例如薄荷、冬青油或櫻桃調(diào)味劑。當劑量單元形式是膠囊時，除了上述類型的物質(zhì)外，它還 可以包含液體載體?？梢源嬖诟鞣N其它物質(zhì)如包衣或另外用以修飾劑 量單元的物理形式。例如，片劑、丸劑或膠囊可以用蟲膠、糖或兩者 來包衣。糖漿或酏刑可以包含活性化合物，作為甜味劑的蔗糖，作為 防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯，染料和調(diào)味刑例如 櫻桃或橙調(diào)^ 未劑。當然，用于制備任何劑量單元形式的任何物質(zhì)都應(yīng) 該是藥學(xué)上純的并且以使用的量應(yīng)該是基本上無毒的。此外，該活性 化合物可以被加入緩釋制劑。藥學(xué)上可接受的栽體和/或稀釋劑包括任何以及所有溶劑、分散介 質(zhì)、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲物質(zhì)等。這些介質(zhì) 和物質(zhì)對于藥學(xué)活性物質(zhì)的使用在本領(lǐng)域中是公知的。除了與活性成 分不相容以外的任何常規(guī)介質(zhì)或物質(zhì)也被考慮在治療組合物中的應(yīng)用。補充的活性成分也可以被加在該組合物中。以劑量單元形式制備煬胃外組合物對于方便給藥和劑量均勻性是 尤其有利的。本文^t用的刑量單元形式指適宜作為對于被治療的哺乳 動物患者的單一劑重的物理離散單元；每一單元包含經(jīng)計算的預(yù)定量 的活性物質(zhì)和需要的藥物栽體以產(chǎn)生需要的治療作用。主要活性成分或成分組以有效量與合適的藥學(xué)上可接受的栽體被 配制在劑量單元形式中用于方便和有效的給藥。 一個劑量單元形式例如每100g可以包含0. Oljng至約2000mg量的主要活性化合物。以比 例表達，所述活性化合物通常存在于約0. 5 n g至約2000mg/ml栽體中。 在包含補充活性成分的組合物中，參考常用劑量和給予所述成分的方 式來決定劑量?；蛘撸o予的刑量可以按照每千克體重的量的形式被 提出。在這種情況下，每千克體重可以給予約0. OOljig至約1000mg 的量。本發(fā)明考慮的優(yōu)選的范圍包括每千克體重50pg至500mg或約 每千克體重約0. 01 p g至約500mg或大約0.1 p g至約250mg。


圖1.淫羊藿黃酮及其有故成分淫羊藿苷對神經(jīng)千細胞增殖的影響。A.對照組用不加生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)6天，絕大部 分細胞死亡(x 200 ) ; B.不加生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)液中添加淫 羊藿黃酮200pg/ml，培養(yǎng)6天，可見許多懸浮的神經(jīng)干細胞球(x 200 ) ; C.不加生長因子的DMEM/F12加入淫羊藿黃酮200ng/ml培養(yǎng) 27天，神經(jīng)干細胞球依然存活，體積進一步增大(x 200 ) ; D.不加 生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)液中添加淫羊藿苷100pg/ml，培養(yǎng)6天， 可見懸浮的神經(jīng)干細胞球(x 200 ); E.不加生長因子的DMEM/F培養(yǎng) 液加入淫羊藿苷100ng/ml培養(yǎng)27天，神經(jīng)干細胞球仍然生長良好， 體積進一步增大(x 200 )。圖2.淫羊藿黃鯛及其有效成分淫羊禁苷對神經(jīng)千細胞分化的影 響。A.對照組用含1。/。胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)液誘導(dǎo)神經(jīng)干 細胞分化7天，單細胞從細胞球周緣遷出，遷出細胞的形態(tài)大致分為兩 種①小部分細胞胞體形態(tài)接近橢圃形，有2 3個細長的突起，類似 于神經(jīng)元的形態(tài)；②大部分細胞的胞體較大，形狀不規(guī)則，類似于M 細胞(x 200) ; B.用含淫羊藿黃酮10 ^g/ml的DMEM/F12培養(yǎng)液(無 FBS)誘導(dǎo)分化7天，較多的單細胞從細胞球遷移出來，細胞生長狀態(tài)良 好，多數(shù)細胞類似于神經(jīng)元的形態(tài)(x 200 ); C.用含淫羊藿黃酮100ng/ml 的DMEM/F12培養(yǎng)液(無FBS)誘導(dǎo)分化7天，細胞的生長狀態(tài)與B組相 似，細胞球幾乎完全貼壁，分化更好，胞體為橢圓形細胞的比例增加， 并且可以看到該類細胞的突起變的粗且長，分枝增加，有明顯的軸突和 樹突，為典型的神經(jīng)元形態(tài)(x 200) ; D.用含淫羊藿苷50pg/ml的 DMEM/F12培養(yǎng)液(無FBS)誘導(dǎo)分化7天，細胞球生長狀態(tài)良好，幾乎 完全貼壁，分化較好，與C組相似(x 200 )。實施例1、淫羊褒黃酮及其有效成分淫羊蕃苷對神經(jīng)干細胞的促 增殖作用一、實驗?zāi)康挠^察淫羊菱黃酮及其有效成分淫羊菱苷對原代培養(yǎng)神經(jīng)千細胞(NSC)的存活和增殖的影響。二、 實驗方法取新生l天的SD大鼠，無菌條件下取腦，分離海馬，置于盛有少 量高糖DMEM/F12的培養(yǎng)皿中；剝除腦膜及血管組織，將組織盡量剪碎， 加細胞培養(yǎng)液5 ml，用火焰拋光的Pasteur吸管輕輕吹打制成細胞懸 液，400目篩網(wǎng)過濾，胎盼藍染色計數(shù)活細胞的比例，細胞計數(shù)后以2 x 106個細胞/ml的密度接種到25ml的培養(yǎng)瓶。常規(guī)NSC的培養(yǎng)需要 基礎(chǔ)培養(yǎng)基畫EM/F12 (1:1)以及輔助因子B27(2%)、生長因子EGF(20 ng/ml) +bFGF (10 ng/ml)，細胞在培養(yǎng)液中呈球狀懸浮生長。 為觀察不同濃度的淫羊藿黃酮及其有效成分淫羊藿苷對原代培養(yǎng)的 NSC的作用，采用不含生長因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)液DMBM/F12 (1:1)和B27(2%)，分別加入終濃度為10、 50、 100、 200、 400 ng/ml的淫羊藿 黃酮或淫羊藜苷，將培養(yǎng)板移入37X:、 5%C02、 95%空氣平衡濕度培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況，微尺測量細胞球直徑。神經(jīng)干細胞鑒定取上述細胞球，去除含有生長因子EGF和bFGF 的培養(yǎng)液，加含10%FBS的DMEM/F12，種于鋪有多聚賴氨酸的24孔 培養(yǎng)板中，于16小時時行nestin和doublecortin (DCX)免疫細胞 化學(xué)染色，細胞幾乎均為nestin和doublecortin陽性，說明培養(yǎng)的 細胞球是神經(jīng)千細胞。三、 實驗結(jié)果從圖l可以看出，用不加生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)6天， 絕大部分細胞死亡，細胞呈彌散狀態(tài)。DMEM/F12培養(yǎng)液中添加淫羊藿 黃酮或淫羊蓑苷，培養(yǎng)6天，形成許多懸浮的神經(jīng)千細胞球；藥物濃 度越高，細胞生長狀態(tài)越好(2()0 40()ng/ml組細胞生長最好)，神 經(jīng)干細胞球的數(shù)目多且體積大。培養(yǎng)至27天時，淫羊藿黃酮200 ~400 叫/ml組和淫羊紫苷100~ 200 jig/ml組的神經(jīng)干細胞球不僅依然生長 很好，而且體積也明顯變大，表明促進了神經(jīng)干細胞增殖。四、 結(jié)論淫羊藿黃酮及其有效成分淫羊褒苷具有類似于絲裂原樣生長因子的作用，能促進神經(jīng)千細胞的增殖。實施例2、淫羊藿黃酮及其有效成分淫羊藿苷促進神經(jīng)干細胞分 化的作用一、 實驗?zāi)康挠^察淫羊霍黃嗣及其有效成分淫羊霍苷對神經(jīng)干細胞分化作用的 影響。二、 實驗方法取培養(yǎng)中的第二代神經(jīng)千細胞球，去除培養(yǎng)瓶內(nèi)舍有生長因子的 培養(yǎng)液，細胞球被隨機分為2組①胎牛血清(FBS)對照組培養(yǎng)液 為DMEM/F12 + 1%FBS;②淫羊蓉黃酮處理組培養(yǎng)液DMEM/F12(無FBS ) 中分別加入終濃度為10、 50、 100、 200、 400 pg/ml的淫羊蓬黃酮；③ 淫羊藿苷處理組培養(yǎng)液DMEM/F12 (無FBS )中分別加入終濃度為10、 50、 100、 200、 400 jxg/ml的淫羊蓑苷。上述三組細胞種于鋪有多聚賴 氨酸的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)7天后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并 行免疫熒光染色，觀察拍照。三、 實驗結(jié)果從圖2可以看出，用含"/。胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液誘導(dǎo)神經(jīng) 干細胞分化7天時，細胞球完全貼壁，單細胞從細胞球周緣遷出，遷 出細胞的形態(tài)大致可分為兩種①小部分細胞胞體形態(tài)接近橢圃形， 有2 3個細長的突起；為神經(jīng)元形態(tài)；②大部分細胞的胞體較大，形 狀不規(guī)則，突起較多，為膠質(zhì)細胞形態(tài)。經(jīng)免疫細胞化學(xué)染色筌定， 從神經(jīng)干細胞球分化出來的細胞分別是神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形 膠質(zhì)細胞；說明神經(jīng)干細胞具有多分化潛能。用含淫羊藿黃鯛10、 50、 100 pg/ml的DMEM/F12培養(yǎng)液(無 FBS)誘導(dǎo)分化7天，較多的單細胞遷移出來，細胞生長狀態(tài)良好，細 胞形態(tài)與FBS組相似，不同的是神經(jīng)元樣細胞的胞體為橢圃形細胞的 比例增加，并且該類細胞的突起變得粗且長，分枝增加，有明顯的軸 突和樹突，為典型的神經(jīng)元形態(tài)，淫羊$苷50、 100ng/ml誘導(dǎo)分化7天，神經(jīng)千細胞球生長狀態(tài)良好，幾乎完全貼壁，分化較好，與淫羊藿 黃酮組相似。四、結(jié)論淫羊藿黃酮及其有效成分淫羊釐苷對神經(jīng)干細胞有良好的促分化 作用。
權(quán)利要求
1. 淫羊藿黃酮和/或淫羊藿苷及其類似物在制備促進神經(jīng)細胞增殖和/或分化的藥物中的用途。
2. 按照權(quán)利要求1的用途，其中所述促進神經(jīng)細胞增殖和/或分化 是用于治療備種原因?qū)е碌某霈F(xiàn)神經(jīng)元缺失的疾病。
3. 按照權(quán)利要求l的用途，其中所述促進神經(jīng)細胞增殖和/或分 化是用于治療神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。
4. 按照權(quán)利要求2或3的用途，其中所述疾病為帕金森病、享廷 頓病、肌萎縮側(cè)索硬化遺傳性、運動失調(diào)病、脊髄源性肌肉萎縮與相 關(guān)疾病、影響神經(jīng)系統(tǒng)的系統(tǒng)性萎縮病、基底節(jié)退行性疾病、肌張力 障礙、原發(fā)性的錐體外系疾病.
5. 按照權(quán)利要求2或3的用途，其中所述疾病為阿爾茨海默病。
6. 按照權(quán)利要求l的用途，其中所述促進神經(jīng)細胞增殖和/或分 化是用于治療中樞神經(jīng)損傷。
7. 按照權(quán)利要求6的用途，其中所述中樞神經(jīng)損傷為缺血性、外 傷性、以及酒精性腦或脊號損傷。
8. 按照權(quán)利要求l的用途，其中藥物中的活性成分為淫羊藿黃嗣。
9. 按照權(quán)利要求8的用途，其中所述淫羊藿黃酮中淫羊藿苷含量 為40-90重量％。
10. 按照權(quán)利要求9的用途，其中所述含量為60重量％。
11. 按照權(quán)利要求l的用途，其中藥物中的活性成分為淫羊藜苷。
全文摘要
本發(fā)明公開了淫羊藿黃酮及其有效成分淫羊藿苷在制備促進神經(jīng)細胞增殖和/或分化的藥物中的用途以及用其治療與神經(jīng)細胞增殖和/或分化相關(guān)疾病的方法。
文檔編號A61P25/16GK101244074SQ20071007894
公開日2008年8月20日 申請日期2007年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月16日
發(fā)明者姚瑞芹, 蘭 張, 林 李, 李小黎, 晉 楚, 魏海峰 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院