專利名稱：抗副豬嗜血桿菌外膜蛋白omp5的單克隆抗體、雜交瘤細胞株hps 1e2及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于免疫學領域，具體涉及一種抗副豬嗜血桿菌外膜蛋白0MP5的單克隆抗體、雜交瘤細胞株及其應用。
背景技術：
副豬嗜血桿菌Parasuis, HPS)屬于巴斯德菌科,嗜血桿菌屬，是一種沒有運動性、小型、NAD依賴、多形態(tài)的革蘭氏陰性桿菌。HPS是一種常在菌，通常定植在豬的上呼吸道，并常?？稍诒乔粌?、扁桃體內和氣管前段分離到，而不見其引起任何臨床癥狀。HPS也是豬格拉澤氏病(Glasser’ s diseas)的病原。在一定條件下，HPS可造成以纖 維素性多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎、腦膜炎為特征的全身感染。格拉澤氏病已在全球范圍內成為影響豬業(yè)的主要細菌性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。迄今已發(fā)現(xiàn)的HPS至少有15種不同的血清型，不同血清型菌株之間缺乏有效的交叉免疫保護性，這增加了預防格拉澤氏病的難度。因此，及時、準確、快捷而方便的病原學診斷方法對于豬格拉澤氏病的防治具有重要意義。目前國內對副豬嗜血桿菌的診斷主要有傳統(tǒng)的病原分離，生化鑒定和血清學等方法，以及基于PCR的檢測方法等。免疫學方法如ELISA、膠體金試紙條等具有特異性強、靈敏度高、操作簡單、快速、對儀器依賴性低等特點，因而常被用于疾病病原檢測以及藥物痕量分析等領域。目前國內尚未有基于抗體的HPS檢測的可商品化診斷方法。HPS的外膜蛋白(Outer member protein,0MP)是其主要毒力因子之一，而且免疫原性強。0MP5是其中主要的一種，各血清型HPS菌株都有0MP5。因此0MP5可作為HPS的特異性診斷靶位。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種分泌抗副豬嗜血桿菌外膜蛋白0MP5單克隆抗體的雜交瘤細胞株HPS 1E2，已于2012年9月25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CHINACENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION)，保藏編號為 CCTCC C2012138。本發(fā)明還提供了由上述保藏編號為CCTCC C2012138的雜交瘤細胞株制備的單克隆抗體。本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體在檢測副豬嗜血桿菌上的應用。本發(fā)明所采用的技術方案是
一種分泌抗副豬嗜血桿菌外膜蛋白0MP5單克隆抗體的雜交瘤細胞株HPS 1E2，于2012年9月25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC C2012138。一種抗副豬嗜血桿菌外膜蛋白0MP5的單克隆抗體，保藏編號為CCTCC C2012138的雜交瘤細胞株產(chǎn)生。所述單克隆抗體為IgG2a亞類。
一種檢測副豬嗜血桿菌抗體的試劑盒，含有由保藏編號為CCTCC C2012138的雜交瘤細胞株產(chǎn)生的單克隆抗體。一種檢測副豬嗜血桿菌的試劑盒，含有由保藏編號為CCTCC C2012138的雜交瘤細胞株產(chǎn)生的單克隆抗體。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明制備得到的單克隆抗體具有以下優(yōu)點
(1)特異性好，與豬大腸桿菌、豬巴氏桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、豬鏈球菌和豬波氏桿菌均無交叉反應；
(2)效價高，純化后的ELISA抗體效價可達I:409600 ；
(3)通用性強，對不同血清型副豬嗜血桿菌都能檢測；
(4)可大量生產(chǎn)；
(5)可廣泛用于副豬嗜血桿菌病的病原學診斷、血清學檢測、免疫學檢測及防治等。


圖I為本發(fā)明的技術流程 圖2為單克隆抗體的特異性檢測結果(M :蛋白Marke ；P5 0MP5 ；1 :豬大腸桿菌；2 :豬鏈球菌2型菌株；3 :豬多殺性巴氏桿菌菌株A ；4 :豬多殺性巴氏桿菌菌株B ；5 :豬胸膜肺炎放線桿菌菌株；6 :豬波氏桿菌菌株)；
圖3為單克隆抗體的通用性檢測結果(M :蛋白Marker ；P5 0MP5 ；1 :1型HPS ；2 :3型HPS ；3 :4 型 HPS ；4 :5 型 HPS ；5 :10 型 HPS ；6 :11 型 HPS ；7 :12 型 HPS ；8 :14 型 HPS ；9 :15 型HPS ；10 :未定血清型HPS)；
圖4為單克隆抗體用于檢測HPS在PK15細胞上的粘附(激光共聚焦顯微鏡觀察)(A 單克隆抗體1E2 ；B -M 0MP5陽性血清對照；C :抗5型HPS全菌陽性血清對照；D :陰性血清對照)。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規(guī)市售試劑，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。主要實驗材料和來源
豬胸膜肺炎放線桿菌I型(APP259，購自中國獸藥監(jiān)察所)；HPS 3型菌株(SW114，澳大利亞昆士蘭州動物健康研究所Pat Blackall博士惠贈);HPS 11型(H456，澳大利亞昆士蘭州動物健康研究所Pat Blackall博士惠贈)；豬大腸桿菌、豬多殺性巴氏桿菌2株菌株、豬鏈球菌2型菌株、豬波氏桿菌、HPS I型菌株、HPS 4型菌株、HPS 5型⑶H45株、HPS 10型菌株、HPS 12型菌株、HPS 14型菌株、HPS 15型菌株及I株未定型HPS菌株均由本實驗室從華南地區(qū)病豬中分離、鑒定并保存。一、免疫原的制備
將HPS 5型⑶H45株在TSA平板上培養(yǎng)18 24h后，挑取單菌落接種于5mL TSB培養(yǎng)基中150rpm振蕩培養(yǎng)10 12h，然后按照1% 4% (v/v)的比例接種于IOOmL TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)10h，梯度稀釋，細菌計數(shù)，同時進行污染檢查。6000r/min，離心IOmin后，用pH7. 4的PBS洗滌并制成IO9 CFU/ml濃度的懸液，加入O. 1% O. 4%的甲醛，37°C滅活24h，備用。二、動物免疫
選取體重在20g左右的雌性Balab/c小鼠。首次免疫，將滅活的HPS菌液與弗氏完全佐劑按I: I的比例進行混合乳化，劑量 為O. I O. 5mL/只，注射方法為背部皮內多點注射。首免后每隔2 3周加強免疫一次，佐劑改用弗氏不完全佐劑。三免后I周左右，剪尾采血，收集血清；用表達純化的HPS 5型⑶H45株外膜蛋白0MP5 (制備方法詳見文獻陳善真，李春玲等，副豬嗜血桿菌0MP5基因的克隆、表達及間接ELISA檢測方法的建立，中國農業(yè)科學，2011，44(14) :3036-3044)對血清中的抗體進行ELISA檢測。免疫進行至抗體效價不再升高。選擇抗體效價高的小鼠，在細胞融合前進3天腹腔注射滅活菌液O. I O. 5mL/只行一次加強免疫。三、雜交瘤細胞的融合、篩選與擴大培養(yǎng)
取效價較高免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤SP2/0細胞，按常規(guī)PEG融合法制備雜交瘤細胞；抗體用重組表達的0MP5進行間接ELISA檢測，篩選陽性克隆并擴大培養(yǎng)；同時采用有限稀釋法對陽性克隆進行亞克隆，至少進行3次，以保證能得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。篩選出高分泌特異性的雜交瘤細胞株HPS 1E2保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年9月25日，保藏編號為CCTCC C2012138。將其分泌的單克隆抗體命名為 HPS 1E2。ELISA所用溶液的配制
包被緩沖液(O. 05mol/L 碳酸鹽緩沖液 pH9. 6) :1. 59g Na2CO3, 2. 93g Na2HCO3 溶于800mL雙蒸水中，調節(jié)pH值至9. 6，并定容至1000mL。封閉液牛血清白蛋白(BSA) Ig加入IOOmL的包被液中，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。洗滌緩沖液(pH7.4 PBST) :0. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12H20，8. Og NaCl，0.2gKC1,0. 5mL Tween-20 (0. 05% V/V)以上各物質準確稱量后，加雙蒸水完全溶解后，調pH值至7. 4，定容至IOOOmL0抗體稀釋液0. 5g BSA溶于IOOmL PBST中。底物緩沖液Na2HP04 · 12H20 3. 8g ;梓檬酸O. 98g，準確稱量后，溶于80mL雙蒸水，調PH值至5. 0，用蒸餾水定容到100mL。TMB底物顯色液A液TMB 50mg溶于IOmL DMSO中4°C避光保存。B液(ρΗ5· 0)
0.2 mol/L Na2HPO4. 12H20 51. 4mL,0. I mol/L檸檬酸48. 6mL，IOOmL超純水，再加入 30% H2O2112 μ L于棕色瓶中4°C避光保存。用前A液和B液按I : 50比例混合。終止液(2mol/L H2SO4):雙蒸水 178. 3mL，逐滴加入濃硫酸(98%) 21. 7mL。間接ELISA具體操作如下
I)包被用包被液稀釋重組HPS外膜蛋白0MP5至濃度為3. 475 μ g /mL, 100 μ L/孔，加入96孔聚苯乙烯酶聯(lián)反應板，4°C包被過夜；棄去包被液，每孔加250 μ L PBST洗滌液，靜置3min，棄洗滌液，將ELISA板在吸水紙上用力拍干，重復三次。2)封閉加封閉液，10(^17孔，37°〇條件下封閉211，棄去封閉液，在每孔加2501^PBST,靜置3min，在吸水紙上用力拍干，重復三次。
3)加樣每孔加入100μ L細胞培養(yǎng)上清\腹水\純化后的抗體，用PBST按1:1000稀釋抗HPS陽性小鼠血清，作為陽性對照，取SP2/0培養(yǎng)上清為陰性對照，37°C作用lh，作用完畢后棄去樣品。每孔加250 μ L PBST靜置3min，在吸水紙上用力拍干，重復三次。4)加酶標二抗每孔加50μ L用PBST 1:4000稀釋的辣根過氧化物標記山羊抗小鼠抗體，37°C作用30min，作用完畢后棄去二抗，每孔加250 μ L PBST靜置3min，在吸水紙上用力拍干，重復三次。5)加顯色液每孔加入100 μ L顯色液，顯色液要用新鮮配制的，室溫條件下避光顯色lOmin。6)加入終止液顯色完畢后,立即加入終止液終止反應,每孔100 μ L。7)測OD值用酶標儀測定0D450nm處吸光值。
四、雜交瘤細胞株上清與腹水單抗(HPS 1E2)效價的測定
將雜交瘤細胞培養(yǎng)上清和制備的腹水，連續(xù)倍比稀釋，然后用間接ELISA (操作方法同三)測定其效價，并設陽性、陰性血清以及SP2/0細胞培養(yǎng)上清作陰性對照。結果顯示，雜交瘤細胞培養(yǎng)上清的效價為1:2560，腹水效價為I :51200，純化后的抗體效價為I: 409600。五、單克隆抗體HPS 1E2腹水的大量制備
取10周齡雌性健康Balb/c小鼠，O. 5ml/只腹腔注射降植烷；I周后，O. 2 O. 5 ml/只腹腔注射濃度為5X IOVml的雜交瘤細胞；待小鼠腹部明顯脹大，用手觸摸皮膚時有緊致感時，收集腹水并以2000rpm離心5min，上清液即為含單克隆抗體的腹水。將腹水從1:100進行倍比稀釋，然后用間接ELISA (操作方法同四)測定其效價，結果顯示，腹水的效價為1:51200。所獲得的腹水可于一 80°C或液氮中保存。六、單克隆抗體HPS 1E2的純化
用Roche公司的蛋白A親和層析試劑盒將單克隆抗體從篩選到的雜交瘤細胞培養(yǎng)液或腹水中純化出來，具體步驟按試劑盒的說明書操作。純化后的效價為I : 409600。七、單克隆抗體IgG亞類鑒定
參照 Sigma 公司的 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents 使用說明，運用捕捉ELISA法測定HPS 1E2雜交瘤細胞分泌的免疫球蛋白的亞類類型，結果表明1E2為IgG2a亞類。八、雜交瘤細胞分泌抗體HPS 1E2的穩(wěn)定性分析
將雜交瘤細胞在液氮中凍存I個月后復蘇，以0MP5為抗原用間接ELISA法測定細胞培養(yǎng)上清液中的抗體效價，然后再次放入液氮中凍存；1個月后再次取出復蘇，如此連續(xù)重復凍融三次。比較分析幾次雜交瘤細胞培養(yǎng)上清的抗體效價的測定值。結果表明，雜交瘤細胞經(jīng)過三次反復凍融，其細胞培養(yǎng)上清液抗體效價恒定，說明分泌的單抗具有良好的穩(wěn)定性。
M I株雜交瘤細應分泌中抗HPSIE2S記性試驗 第I次-U - ； 第2次父蘇第3次U 'S 1:25601:2560! :2560九、單克隆抗體HPS1E2的特異性檢測將不同的細菌，包括豬大腸桿菌、豬多殺性巴氏桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌I型、豬鏈球菌2型和豬波氏桿菌培養(yǎng)后收集菌體；用4°C滅菌蒸餾水洗滌菌體3次，4°C超聲波破碎，以8000rpm離心lOmin，取上清液進行SDS-PAGE電泳，轉移到硝酸纖維素膜(NC)上，同時以重組HSP OMP5為陽性對照；以單克隆抗體HPS1E2為一抗，以辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠抗體為二抗進行Western-blotting檢測。Western Blot檢測按以下步驟進行
(I)樣品制備將蛋白樣品與上樣緩沖液體積按1:1的比例混合均勻后，煮沸l(wèi)Omin。(2) SDS-PAGE電泳制膠，加樣進行SDS-PAGE電泳，當預染蛋白Marker跑到預定位置后，斷開電源。(3)電泳完畢后，卸下凝膠，并用電轉移緩沖液平衡3次，每次5min。
(4) PVDF膜處理預先裁好與膠條同樣大小的PVDF膜和濾紙，將PVDF膜用甲醇處理5s，然后平鋪于雙蒸水面，侵入水中IOmin使其靠毛細作用吸水后排干凈氣泡，隨后放入電轉緩沖液中平衡。(5)取膠膠在轉移緩沖液中平衡后，置于潔凈玻璃板上，依次鋪上NC膜、三層濾紙(兩側都鋪)。(6)轉膜往電轉槽加入適量電轉液，將膠平鋪于用電轉緩沖液潤濕過的海綿上進行固定(固定時注意膜對著正極一側)；固定后放入電轉移槽，恒流IOOmA轉移(將電轉槽放在冰水混合物中，防止電轉過程中溫度過高)3h后，斷開電源取膜做免疫印跡。(7)洗膜將膜放入TBST中，靜置5min，重復三次。(8)包被將膜加入包被液中，室溫條件下平穩(wěn)搖動包被2h。(9)洗膜棄去包被液，將膜放入TBST中，靜置5min，重復三次。(10)加一抗一抗即單克隆抗體HPS 1E2，用TBST按1:500比例稀釋，室溫下平穩(wěn)搖動Ih。(11)洗膜棄去一抗，將膜放入TBST中，靜置5min，重復四次。(12)加二抗將辣根過氧化物標記的山羊抗小鼠抗體，按1:5000比例用TBST稀釋，室溫平穩(wěn)搖動感作lh。(13)洗膜反應完畢后，棄去酶標二抗，用TBST先后洗膜3次，每次5min ;然后將膜轉入TBS中靜置lOmin，重復兩次。(14)顯色加入DAB顯色液，室溫條件下避光顯色，當出現(xiàn)條帶時，顯色結束；立即將膜放入超純水中終止反應。結果見圖2。從圖中可以看出，本發(fā)明所獲得的單克隆抗體與豬大腸桿菌、豬多殺性巴氏桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、豬鏈球菌2型菌株和豬波氏桿菌的菌體蛋白均無反應，在HPS的0MP5蛋白(約57KD)處可見到特異性反應條帶，說明所獲得的單抗可與HPS 0MP5特異性結合。十、單克隆抗體HPS1E2的通用性檢測
將HPS I型菌株、3型菌株、4型菌株、5型菌株、10型、11型菌株、12型菌株、14型菌株、15型菌株等9個不同血清型的副豬嗜血桿菌菌株及I株未定型菌株培養(yǎng)后收集菌體；用4°C滅菌蒸餾水洗滌菌體3次，4°C超聲波破碎，以8000rpm離心lOmin，取上清液進行SDS-PAGE電泳，轉移到硝酸纖維素膜(NC )上，同時做重組HSP 0MP5陽性對照；以獲得的單抗HPS1E2為一抗，以辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠抗體為二抗進行Western-blotting 檢測。結果見圖3。從圖中可以看出，本發(fā)明所獲得的單克隆抗體HPS1E2與所有9個血清型的副豬嗜血桿菌菌體蛋白及未定型菌株均發(fā)生反應。在0MP5蛋白(約57KD)處可見到特異性反應條帶，說明所獲得的單抗HPS1E2通用性良好。i^一、單克隆抗體HPS1E2用于HPS的免疫熒光檢測激光共聚焦免疫熒光檢測
I.激光共聚焦專用細胞培養(yǎng)皿的處理
(I)預平衡吸取3mL細胞培養(yǎng)液到培養(yǎng)皿中，然后在細胞培養(yǎng)箱中孵育15min。(2)倒掉細胞培養(yǎng)液，加入500 μ L細胞懸液，在細胞培養(yǎng)箱中放置2h，讓細胞沉降
貼壁。
(3)小心補加3mL細胞培養(yǎng)液。2. PK-15細胞的傳代培養(yǎng)用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)PK-15細胞，等細胞長到對數(shù)生長期后開始傳代。具體操作如下倒去培養(yǎng)液，用滅菌PBS洗去殘留培養(yǎng)液；加入ImL胰酶，輕輕搖晃作用2min，看到瓶底細胞呈霧狀時倒掉胰酶，用滅菌PBS洗去殘留胰酶；用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液將細胞懸浮起來，然后將細胞懸液一分為二，分裝到兩個細胞培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代后Ih換液將聚集成團的細胞倒掉，以免影響實驗效果。3.待細胞長至80%滿度后，給細胞換液，加入血清5型HPS菌液，使其終濃度為I X 106cfu/mL,置37°C，2h進行共培養(yǎng)；棄去培養(yǎng)液，用PBS充分洗滌，加入2ml含15 μ L/mL正常山羊血清的PBS，37°C放置15min ;用PBS洗滌。加入2mL含2%戊二醛和I. 5%甲醛的PBS 4°C 固定 2h。4.每孔加入含10%胎牛血清和1%BSA的PBS，每孔500 μ L，37°C封閉Ih ;封閉完畢后，棄去封閉液，加入PBS充分洗滌；將用抗01^5的單克隆抗體即3^2制作的腹水做1:100稀釋(用含5%胎牛血清和O. 05%Tween-20的PBS為稀釋液，以下同)，分別加入各培養(yǎng)皿，每個500 μ L，37°C作用2h，同時設抗5型HPS全菌多抗、抗0MP5多抗和HPS陰性血清對照；作用完畢后，棄去腹水，用PBS洗滌?？?型HPS全菌多抗和抗0MP5多抗的制備方法為將經(jīng)甲醛滅活的5型HPS或將純化的重組外膜蛋白P5分別與弗氏完全或不完全佐劑制備的油乳劑亞單位疫苗，分別皮下多點注射免疫Balb/c小鼠，共免疫三次，中間間隔14天，于第三次免疫后14天進行采血，分離血清。5.以FITC-羊抗鼠抗體為二抗，用PBST按1:1000的比例進行稀釋，加入各培養(yǎng)皿，每個500 μ L，37°C作用2h ;作用完畢后棄去二抗，用PBS洗滌；最后加入少許PBS，以防止細胞失水。6.激光共聚焦顯微觀察將培養(yǎng)皿置激光共聚焦顯微鏡(laser confocalscanning light microscope, Leica TCS SP),調 Ar Ion Laser 波長至 488nm,調焦收集聚焦息。結果見圖4。圖中結果顯示，單抗HPS1E2與抗5型HPS全菌陽性血清和抗0MP5陽性血清對照一樣，能引起吸附有HPS的PK-15細胞周圍發(fā)出綠色熒光，說明單抗HPS1E2與天然抗原能發(fā)生反應，可用于HPS的臨床檢測。
權利要求
1.一種分泌抗副豬嗜血桿菌外膜蛋白0MP5單克隆抗體的雜交瘤細胞株HPS 1E2，于2012年9月25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC C2012138。
2.一種抗副豬嗜血桿菌外膜蛋白OMP5的單克隆抗體，由權利要求I所述的雜交瘤細胞株產(chǎn)生。
3.根據(jù)權利要求2所述的抗副豬嗜血桿菌外膜蛋白OMP5的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體為IgG2a亞類。
4.一種檢測副豬嗜血桿菌抗體的試劑盒,含有權利要求2或3所述的單克隆抗體。
5.一種檢測副豬嗜血桿菌的試劑盒，含有權利要求2或3所述的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗副豬嗜血桿菌外膜蛋白OMP5的單克隆抗體、雜交瘤細胞株HPS1E2及應用。所述雜交瘤細胞株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCC2012138。由其制備的單克隆抗體特異性好，與豬大腸桿菌、豬巴氏桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、豬鏈球菌和豬波氏桿菌均無交叉反應；效價高，純化后的ELISA抗體效價可達1409600；通用性強，對不同血清型副豬嗜血桿菌都能檢測；可廣泛用于副豬嗜血桿菌病的病原學診斷、血清學檢測、免疫學檢測及防治等。
文檔編號C07K16/12GK102876636SQ20121037176
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權日2012年9月28日
發(fā)明者李春玲 申請人:廣東省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所