一種副豬嗜血桿菌的檢測試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體涉及一種副豬嗜血桿菌的檢測試劑盒及其檢測方 法，屬于分子生物學技術領域。
【背景技術】
[0002] 副豬嗜血桿菌（Haemophliusparasuis，HPS)是一種NAD依賴型、不運動的革蘭氏 陰性細小桿菌，屬于巴斯德菌科（Pastteurellacea)嗜血桿菌屬（Haemophilus),有15種血 清型，還有20%的菌株血清型無法確定。該菌能夠引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎以及腦膜 炎，由該菌引起的副豬嗜血桿菌病又稱為豬革拉斯氏?。℅lkser'sdisease)。HPS可以影 響2周齡~4月齡的豬，主要在斷奶前后和保育舍階段發(fā)病，常見于5~8周齡，發(fā)病率可 達40%，嚴重時死亡率可達50%。隨著我國規(guī)?；B(yǎng)豬場的發(fā)展，HPS感染有明顯增加趨勢， 已成為豬場保育仔豬發(fā)病率和死亡率增加的重要原因之一，每年給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經 濟損失。因此，建立一種副豬嗜血桿菌的檢測技術，對于監(jiān)控該菌的繁殖、疾病發(fā)生和流行 以及疾病的及時防治都具有重要的意義。
[0003] 常規(guī)的生理生化方法雖然可以準確鑒定待檢菌株，但是操作繁瑣，耗時長。中國專 利CN102220426A公開了副豬嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，該試劑盒是針對傳統(tǒng)的16SrRNA序 列設計的引物，對巴氏桿菌科及嗜血桿菌屬的其他成員（如巴氏桿菌、副禽嗜血桿菌等）特 異性效果欠佳，且其靈敏度仍需改善。

【發(fā)明內容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強、靈敏度高、耗時 短、檢測準確、有效的副豬嗜血桿菌的檢測試劑盒。
[0005] 本發(fā)明為了實現(xiàn)上述目的所采用的技術方案為： 本發(fā)明提供了一種副豬嗜血桿菌的檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括序列如SEQIDN0: 1-2所示的引物對F1、R1各100ML、2XPCRMix1.25mL、陽性對照副豬嗜血桿菌DNA200ML 和ddH20 2X1. 25mL; 所述引物對序列為： mviN-Fl5'GGTATGACCCTACTTTCTCG3' mviN-Rl5'TTAATTTACCTTGAATGATCTTATT3' 上述檢測試劑盒內為100次含量。
[0006] 進一步的，所述PCRMix包括PCR緩沖液，dNTP，PfuDNA聚合酶。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種副豬嗜血桿菌的檢測方法，該檢測方法為使用上述提供的檢 測試劑盒進行副豬嗜血桿菌的檢測。
[0008] 上述檢測方法包括以下步驟： a、 提取樣品DNA:提取待檢樣品中的DNA備用； b、 基因擴增：將提取的樣品DNA加入檢測試劑盒中，對待檢樣品中的DNA進行PCR擴 增； C、結果檢測：對DNA擴增結果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0009] 進一步的，步驟a中，所述待檢樣品為細菌分離培養(yǎng)物、組織研磨液或血液樣品。
[0010] 進一步的，步驟b中，PCR擴增條件為：95°C5min;95°C45s，55°C45s，72°C90s， 32 個循環(huán)；72°C10min;4°C保存。
[0011] 本發(fā)明中所述的檢測試劑盒中，陰性對照為滅菌水（ddH20)，陽性對照為副豬嗜血 桿菌DNA。
[0012] 本發(fā)明設計的特異性好、靈敏度高的引物是實現(xiàn)所述目的的關鍵因素，為了克服 傳統(tǒng)的針對16SrRNA序列設計的引物對于巴氏桿菌、副禽嗜血桿菌等特異性結果欠佳的弊 端，本發(fā)明針對mviN基因序列，設計出特異性好、靈敏度高的引物，mviN基因有其自身的獨 特性，存在于許多對人、動物及植物致病的微生物中，且mviN基因具有高度保守區(qū)域，因此 用于HPS的檢測時準確度高。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果為：本發(fā)明針對具有高度保守區(qū)域的mviN基因序列設 計的引物，具有特異性好，能夠準確的區(qū)別副豬嗜血桿菌LC株同副禽嗜血桿菌、豬胸膜肺 炎放線桿菌、巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌；且本發(fā)明提供的試劑盒 靈敏度高，可檢測副豬嗜血桿菌DNA不低于100Xl(T5ng/ML的待檢樣本，耗時短且檢測準 確、有效。
【附圖說明】
[0014] 圖1為檢測引物的選擇結果。
[0015] 其中，M:MarkerDL2000 ;1 :固體培養(yǎng)物（引物對F1/R1) ;2 :液體培養(yǎng)物（引物對 F1/R1) ;3 :固體培養(yǎng)物（引物對F2/R2) ;4 :液體培養(yǎng)物（引物對F2/R2) ;5 :陽性對照；6 :陰 性對照。
[0016] 圖2為副豬嗜血桿菌mviN基因PCR特異性試驗結果。
[0017] 其中，M:MarkerDL2000 ;1 :副豬嗜血桿菌LC株；2 :副禽嗜血桿菌；3 :豬胸膜肺炎 放線桿菌；4 :巴氏桿菌；5 :化膿隱秘桿菌；6 :金黃色葡萄球菌；7 :豬鏈球菌；8 :陰性對照。
[0018] 圖3為副豬嗜血桿菌mviN基因PCR靈敏度試驗結果。
[0019] M：MarkerDL2000 ；1 ： 100XlO^ng/l^L；2 ： 100X10_2ng/m；3 ： 100XlO^ng/M'L；4 ： 100Xl(T4ng/ML;5 :100Xl(T5ng/ML;6 :100Xl(T6ng/ML;7 :100Xl(T7ng/ML;8 :陰性對照。
[0020] 圖4為死亡豬組織樣品中副豬嗜血桿菌的檢測結果。
[0021] 其中，M:MarkerDL2000 ;1 :死亡豬1號組織樣品；2.死亡豬2號組織樣品；3 :陰 性對照；4 :陽性對照。
[0022] 圖5為死亡豬1號的組織擴增產物測序結果。
【具體實施方式】
[0023] 以下結合實施例的具體實例方式再對本發(fā)明的上述內容作進一步的詳細說明，但 不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。
[0024] 本發(fā)明所需材料、試劑 1.菌株 副豬嗜血桿菌LC株、副禽嗜血桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌、 金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌等均由本實驗室分離、鑒定及保存。
[0025] 2?試劑 TSA培養(yǎng)基稱取40gTSA粉末加入940ml蒸餾水中，經121°C滅菌15分鐘。冷卻至 50°C左右，加入50ml新生牛血清和10ml過濾除菌的濃度為0. 1%的輔酶（NAD)溶液，充分 搖勻后倒平皿。
[0026] TSB培養(yǎng)基稱取30gTSB粉末加入940ml蒸餾水中，經121°C滅菌15分鐘。臨 用前加入50ml新生牛血清和10ml過濾除菌的濃度為0. 1%的NAD溶液，混合均勻后配制而 成。
[0027] PCRMix(PCR 緩沖液 800ML，dNTP 400ML，Pfu DNA 聚合酶 5〇ML)，SDS 溶液，蛋白 酶K，Tris飽和酚，氯仿，異戊醇，無水乙醇。
[0028] 實施例1 1. DNA模板的制備： 液體培養(yǎng)物取副豬嗜血桿菌LC株菌液10000r/min離心5min，棄上清液，用滅菌水重 懸后，于沸水中煮沸l(wèi)Omin，-20°C凍結，融化后，10000r/min離心5min，取上清液作為DNA模 板。
[0029] 固體培養(yǎng)物挑取若干個菌落懸浮于100ML滅菌水中，吹吸混勻后，于沸水中煮沸 lOmin，-20°C凍結，融化后，10000r/min離心5min，取上清液作為DNA模板。
[0030] 2.引物設計 根據(jù)GenBank公布的故5mviN基因序列（CP001321. 1)，設計兩對特異性引物，送上海 生工生物工程技術服務有限公司合成，PCR引物對序列見表1。
[0031] 表1PCR引物對序列
【主權項】
1. 一種副豬嗜血桿菌的檢測試劑盒，其特征在于：包括序列如SEQIDNO: 1-2所示的 引物對FI、R1各100ML、2XPCRMix1. 25mL、陽性對照副豬嗜血桿菌DNA200ML和ddH20 2X1. 25mL； 所述引物對序列為： mviN-Fl5'GGTATGACCCTACTTTCTCG3' mviN-Rl5'TTAATTTACCTTGAATGATCTTATT3'。
2. 根據(jù)權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于：所述PCRMix包括PCR緩沖液， dNTP，PfuDNA聚合酶。
3. -種副豬嗜血桿菌的檢測方法，其特征在于：使用權利要求1所述的檢測試劑盒進 行副豬嗜血桿菌的檢測。
4. 根據(jù)權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： a、 提取樣品DNA:提取待檢樣品中的DNA備用； b、 基因擴增：將提取的樣品DNA加入檢測試劑盒中，對待檢樣品中的DNA進行PCR擴 增； c、 結果檢測：對DNA擴增結果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
5. 根據(jù)權利要求4所述的檢測方法，其特征在于：步驟a中，所述待檢樣品為細菌分離 培養(yǎng)物、組織研磨液或血液樣品。
6. 根據(jù)權利要求4或5所述的檢測方法，其特征在于：步驟b中，PCR擴增條件為： 95°〇51^11;951：458,551：458,721：9〇8,32個循環(huán) ；721：1〇111111;41：保存。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種副豬嗜血桿菌的檢測試劑盒及其檢測方法，屬于分子生物學技術領域，該檢測試劑盒包括引物對、PCR Mix、陽性對照和ddH2O。本發(fā)明針對具有高度保守區(qū)域的mviN基因序列設計的引物對，特異性好，能夠準確的區(qū)別副豬嗜血桿菌LC株同副禽嗜血桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌；且本發(fā)明提供的試劑盒及檢測方法靈敏度高，耗時短且檢測準確，對于監(jiān)控該菌的繁殖、疾病發(fā)生和流行以及疾病的及時防治都具有重要的意義。
【IPC分類】C12Q1-04, C12Q1-68, C12R1-01
【公開號】CN104711359
【申請?zhí)枴緾N201510120697
【發(fā)明人】于江, 王金寶, 吳家強, 張玉玉, 杜以軍, 李俊, 陳智
【申請人】山東省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年3月19日