專利名稱：同時鑒別q型和b型煙粉虱的特異性pcr方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)，特別是一種同時鑒別Q型和B型煙粉虱的特異性PCR方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
煙粉虱Bemisia taabaci屬半翅目，粉虱科，廣泛分布于世界各大洲，通過直接取食植物汁液、分泌蜜露污染植物以及傳播植物病毒對農(nóng)業(yè)和園藝生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。煙粉虱入侵性極強(qiáng)，過去二十多年來，煙粉虱入侵到全球多個國家和地區(qū)并取代了當(dāng)?shù)囟鄠€土著煙粉虱，對世界各地多種重要作物造成了嚴(yán)重危害，除了本身刺吸植物汁液引起葉片甚至植株萎蔫、寄主植物生理紊亂外，最重要的是煙粉虱傳播的雙生病毒病一番茄黃曲葉病毒病大面積暴發(fā)為害(Brown&Czosnek, 2002 ；Czosnek&Ghanim, 2011),并由南方蔓延到北方(張穗等，2006;吳永漢等，2007 ;周瑩等，2010)。病毒病的流行給番茄生產(chǎn)帶來了巨大威脅，局部地區(qū)的番茄大棚甚至絕收。因而，煙粉虱成為全球密切關(guān)注的“超級害蟲”(Liuet al., 2007; Martinez-CarriI1 and Brown, 2007; Bethke et al., 2009)。煙粉風(fēng)是一個包括許多遺傳型的復(fù)合種，被命名的生物型至少有24個(Dinsdale et al.，2010)，截止到2011年，已經(jīng)報道的亞種至少有32個，目前我國至少存在6種生物型(B，Q，ZHJ-1, ZHJ-2，ZHJ-3，F(xiàn)J-1)(萬方浩等，2009)，這其中分布最為廣泛、危害最為嚴(yán)重的生物型為近年來入侵我國并逐步形成蔓延擴(kuò)散趨勢的B型和Q型煙粉虱。根據(jù)最近發(fā)表的系統(tǒng)發(fā)育分析文獻(xiàn)，雜交試驗(yàn)和交配行為觀察結(jié)果表明煙粉 虱至少包括28個遺傳結(jié)構(gòu)差別明顯、但外部形態(tài)無法區(qū)分的隱種(Dinsdale et al., 2010; Xu et al., 2010; De Barro et al., 2011; Hu etal.，2011)。然而，形態(tài)學(xué)上尚缺乏的有力證據(jù)以及遺傳學(xué)角度的分類方法是否合理，使得隱種的命名法則在分類學(xué)上無充足的依據(jù)，所以本申請中依然沿用生物型的概念。在所有煙粉虱的生物型中，B型和Q型煙粉虱當(dāng)屬入侵性強(qiáng)、在全世界范圍內(nèi)廣泛分布、危害性最嚴(yán)重。B型煙粉虱起源于中東-小亞細(xì)亞地區(qū)(De Barro et al.，2011)，90年代中后期，B型煙粉虱入侵中國，并給農(nóng)業(yè)和園藝生產(chǎn)帶來了經(jīng)濟(jì)損失。2005年在中國云南首次發(fā)現(xiàn)了 Q型煙粉虱(褚棟等，2005)，在隨后的幾年內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Q型煙粉虱逐漸取代了 B型煙粉虱，2009年底我國已經(jīng)至少有21個省市發(fā)現(xiàn)了 Q型煙粉取代了原來為害的B型煙粉虱(Pan etal.，2011);但在一些地區(qū)，田間發(fā)現(xiàn)二者是混合發(fā)生的(褚棟等，2007 ;褚棟等，2009)。B型煙粉虱和Q型煙粉虱表觀一致，在形態(tài)上無法區(qū)分，但二者在生物學(xué)特性、寄主植物、生理和分子水平上存在明顯差異，例如Q型煙粉虱比B型煙粉虱具有更強(qiáng)的寄主適應(yīng)性和抗藥性(Muniz, 2000;Horowitz et al.，2003),對病毒病的傳播能力更強(qiáng)(pan etal.，2012)等，而且許多遺傳型之間存在生殖隔離。目前經(jīng)常用于區(qū)分其生物型的分子鑒定方法就是采用mtCOI特異性引物進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序和序列比對，進(jìn)而來確定是何種生物型(羅晨等，2002)。但是這種方法需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增、克隆、測序、序列比對等諸多步驟，耗時較長，而且需要大量的資金作為支持。
而隨著分子生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，研究者試圖尋找通過PCR擴(kuò)增即可明顯鑒定兩個生物型的方法。例如Shatters JRG等(2009)報道通過比較B型和Q型煙粉虱二者之間的mtCOI序列，針對各自的特異性序列分別設(shè)計出各自的特異性引物，通過PCR擴(kuò)增的方法來鑒別這兩個生物型。另外比較常見的鑒定物種的技術(shù)也包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)技術(shù)結(jié)合特征序列擴(kuò)增區(qū)域(sequencecharacterized amplified regions, SCAR)標(biāo)記技術(shù)來篩選出需要鑒定物種的特異片段，然后將目標(biāo)特異性片段進(jìn)行克隆和測序，并以此片段序列進(jìn)行特異性引物設(shè)計，然后以該對特異性引物對基因組DNA片段再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)而將與原特異性片段相對應(yīng)的位點(diǎn)鑒別出來。SCAR標(biāo)記為共顯性遺傳，待檢DNA間的差異可直接通過有無擴(kuò)增產(chǎn)物來顯示(黎裕等，1999)。這樣根據(jù)特異性擴(kuò)增片段長度的大小來進(jìn)行物種鑒別的方法與通常采用的限制片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、喊基序列測定、熒光定量PCR等技術(shù)相比，免去了篩選限制性內(nèi)切酶和堿基序列測定的過程或者費(fèi)用高昂、儀器設(shè)備要求條件高的不利條件，不僅操作簡便、成本低，而且結(jié)果穩(wěn)定、靈敏度高、重復(fù)性好，而且特異性引物一旦獲得，即可用于大規(guī)模樣品的檢測分析，可快速對靶標(biāo)樣品進(jìn)行鑒別。但是目前對B型煙粉虱和Q型煙粉虱進(jìn)行生物型鑒定的分子標(biāo)記中采用的引物對僅能鑒定單個生物型(Shatters et al.，2009)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于鑒定B型煙粉虱和Q型煙粉虱的方法及基于該方法的試劑盒。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:用于檢測B型煙粉虱和Q型煙粉虱的方法，包括對待測煙粉虱的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增所采用的弓丨物對如下:上游引物 Bt-F:5’ -TCT CAT CGG TGT CTTATT G-3’，下游引物Bt-R:5，-CTT CGG GTC GTT TCT CGT-3，；所述檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物指對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳并觀察是否出現(xiàn)特征帶型，Q型煙粉虱的特征帶型為一條507bp條帶；B型煙粉虱特征帶型為507bp和660bp兩條帶。所述PCR擴(kuò)增的體系為:Taq DNA聚合酶0.05U/u IUXTaq緩沖液、氯化鎂1.5mM、dNTPs 200 y M、上游引物和下游引物的濃度分別為0.5 y M、DNA模板濃度為0.17 X 1(T5 0.2ng/ul，加 ddH20 至 20 yl。所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?94°C預(yù)變性3分鐘；然后進(jìn)行30個循環(huán):94°C變性I分鐘、59 °C退火45秒、72 °C延伸110秒；最后72°C延伸IOmin。用于檢測B型煙粉虱和Q型煙粉虱的試劑盒，其特征在于包括一對PCR引物:上游引物Bt-F:5’ -TCT CAT CGG TGT CTTATT G-3，，下游引物Bt-R:5’ -CTT CGG GTC GTT TCT CGT-3，；還包括用于PCR檢測的試劑:Taq DNA聚合酶、dNTPs、氯化鎂、Taq DNA聚合酶緩沖液和無菌水。所述PCR引物預(yù)混于PCR預(yù)混體系中，所述PCR預(yù)混體系如下:Taq DNA聚合酶0.05U/iil、lXTaq緩沖液、1.5mM氯化鎂、200 ii M dNTPs、上游引物和下游引物分別0.5 ii M
和無菌水。本發(fā)明采用0PA、0PB、0PC系列，每個系列包含20條共60條RAPD隨機(jī)引物對分別供試蟲源的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果中發(fā)現(xiàn)一條隨機(jī)引物能夠擴(kuò)增出Q型煙粉虱的特異性條帶(核苷酸序列如Seq ID N0.1所示)，該條帶在B型煙粉虱的擴(kuò)增產(chǎn)物中沒有出現(xiàn)。通過分離并測序該條帶，并基于該條帶設(shè)計Q型煙粉虱特異性SCAR引物，在設(shè)計出的引物中發(fā)現(xiàn)一對特異性引物在B型和Q型煙粉虱中都擴(kuò)增出特征條帶。經(jīng)田間特異性驗(yàn)證，該對特異性引物在B型和Q型煙粉虱中能穩(wěn)定擴(kuò)增出特征帶型，而在其它亞類型的煙粉虱中擴(kuò)增不出條帶。本發(fā)明基于該對特異性引物，提供用于檢測B型煙粉虱和Q型煙粉虱的PCR方法和試劑盒，這樣僅進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增即可通過對擴(kuò)增譜帶的識別同時快速判定B型煙粉虱和Q型煙粉虱，從而顯著縮短了煙粉虱生物型的判定技術(shù)，也節(jié)約了成本，是其分子鑒定技術(shù)上的一大改進(jìn)，該技術(shù)改進(jìn)為煙粉虱不同生物型的分布和識別進(jìn)行快速檢測提供了更簡便的方法，更適宜于田間大批量的樣品測試。


圖10PA-17對三種煙粉虱的PCR擴(kuò)增結(jié)果(M:200bp ladder ;1-5:Q 型煙粉虱；6-10:B 型煙粉虱；11-15:溫室白粉虱；16:
空白；)圖2特異性SCAR引 物在不同粉虱種類中的PCR擴(kuò)增結(jié)果(M:200bp ladder; 1-2:Q型煙粉虱；3_4:B型煙粉虱；5_6:溫室白粉虱；7_8:桔綠粉虱；9-10:黑刺粉虱；11-12:ZJ-2型煙粉虱)圖3SCAR引物對單頭Q型煙粉虱成蟲DNA及其不同濃度下擴(kuò)增結(jié)果(M:200bp Marker ；1:單頭 Q 型煙粉虱基因組 DNA 原液 3.4ng/ u I ；2:DNA 稀釋 IO1倍；3 =DNA稀釋IO2倍；4 =DNA稀釋IO3倍；5 =DNA稀釋IO4倍；6 =DNA稀釋IO5倍。)圖4特異性引物對擴(kuò)增田間9個煙粉虱種群的檢測結(jié)果(M:Marker II ;其它泳道依次為山東、浙江、山西、河南、上海、江西、海南、天津和河北種群)圖5特異性引物對擴(kuò)增田間9個煙粉虱種群的檢測結(jié)果(M =Marker II ;其它泳道依次為廣東、安徽、北京、長沙、廣西、遼寧、新疆和甘肅種群)
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)驗(yàn)過程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明本發(fā)明:生物材料B型煙粉虱和Q型煙粉虱飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，從2009年飼養(yǎng)至今，寄主植物分別為甘藍(lán)、一品紅，種群維持飼養(yǎng)期間不使用任何農(nóng)藥；桔綠粉虱采集自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院院內(nèi)，記載的已知文獻(xiàn)為:劉循，萬方浩，張桂芬,2009，昆蟲學(xué)報，52 (8): 895-900。
溫室白粉虱、黑刺粉虱和浙江省本地?zé)煼凼N群ZJ-2型由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所張桂芬研究員提供；記載的已知文獻(xiàn)為:劉循，萬方浩，張桂芬，2009，昆蟲學(xué)報，52 (8): 895-900。供試的田間種群為2011年采集自中國不同地區(qū)和寄主上的粉虱類害蟲成蟲，以上供試種群根據(jù)粉虱成蟲的形態(tài)特征初步判斷其種類或者是否為煙粉虱，其中的煙粉虱樣品首先采用mtCOI基因擴(kuò)增和序列比對(羅晨等，2002)來確定其生物型，部分種類也同時采用Shatters等(2009)公開發(fā)表的B型和Q型煙粉虱各自的引物對來鑒定其生物型，之后作為本研究中的驗(yàn)證用材料。生物材料發(fā)放聲明:以上供試?yán)ハx均為目前文獻(xiàn)中記載過的或者公知的煙粉虱不同生物型或不同種類，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過采集和常規(guī)驗(yàn)證方法獲得，本實(shí)驗(yàn)室也有保存，可自申請日起20年內(nèi)向公眾發(fā)放用于驗(yàn)證試驗(yàn)。隨機(jī)引物采用Operon公司的RAPD通用引物系列，采用OPA、OPB、OPC系列，每個系列包含20條引物，隨機(jī)引物和特異性引物分別由上海英竣生物工程公司合成和北京擎科生物工程公司合成。序列測序由北京擎科生物工程公司進(jìn)行。PCR擴(kuò)增中使用的聚合酶為2 X TaqlOMASTER Mix (0.1U TaqE/ U I)購自奧賽博科技發(fā)展有限公司。粉虱害蟲的基因組DNA提取試劑盒和克隆試劑盒分別購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司和北京全式金生物技術(shù)有限公司。

實(shí)施例1RAPD擴(kuò)增篩選特異性隨機(jī)引物2.1單頭粉虱害蟲DNA提取基因組DNA的提取采用DNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司，溶液型)，方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。具體操作如下:將單頭煙粉虱成蟲置于滴有IOiU的細(xì)胞裂解液(試劑盒提供)的Parafilm膜上，以0.2ml的PCR管的底部作為勻漿器充分研磨，用另20的裂解液清洗勻漿器2次，合并混勻；然后以微量移液器移入1.5ml離心管；加入蛋白酶K，2 y 1，混勻，55°C，水浴4小時或者過夜；離心幾秒，加入RNase A2.5 u I (10 y g/)，置于37°C烘箱15-30min ;取出上述樣品，晾至室溫，加入蛋白沉淀液25 yl，漩渦振蕩器上高速震蕩25s ；冰浴5min,沉淀蛋白；室溫離心，13000r/min,離心5min ;小心吸取上清液到另一個新管中(不要吸入沉淀)；加入等體積的異丙醇50 ii 1，顛倒混勻30次；室溫離心，12000r/min，離心IOmin,棄上清；加入Iml 70%乙醇顛倒漂洗DNA沉淀,室溫離心，12000r/min,離心2min,棄上清；加入Iml無水乙醇顛倒漂洗DNA沉淀,室溫離心，12000r/min,離心2min,棄上清；力口入20 ill DNA溶解液，溶解DNA65°C，水浴60min，放于_20°C保存?zhèn)溆谩?.2RAPD 擴(kuò)增應(yīng)用RAPD擴(kuò)增技術(shù)，以上述材料與方法中的供試樣品的DNA為模板，采用60條隨機(jī)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，記錄篩選出來的特異條帶以及相應(yīng)擴(kuò)增引物，并對這些條帶進(jìn)行標(biāo)記。擴(kuò)增總體積為20ii 1，分別包含IOii 12XTaqlOMASTER Mix (其中包括Taq DNAPolymerase 0.1U/y l、2XTaq PCR Buffer,3mM MgCl2 和 400 y M dNTP mix)、DNA 模板
Iu IUOmM 的 RAPD 弓 I物 I 和 6 y I dd H2O0PCR反應(yīng)程序?yàn)?首先進(jìn)行94 ° C預(yù)變性4min,之后進(jìn)行40個循環(huán)，包括94。Clmin, 37° C 退火 50s，72° C 延伸 lmin35s，最后 72° C 延伸 lOmin。2.3特異性擴(kuò)增產(chǎn)物回收克隆RAPD擴(kuò)增中，發(fā)現(xiàn)0PA-17引物擴(kuò)增時，在Q型煙粉虱出現(xiàn)一條很亮的擴(kuò)增條帶，大小約為721bp (圖1中箭頭所示)，但在B型煙粉虱中未見到該條帶的出現(xiàn)。在溫室白粉虱種類中也未出現(xiàn)，見圖1。在瓊脂糖凝膠電泳上回收該特異性條帶，采用DNA純化試劑盒(北京百泰克)進(jìn)行純化，之后把該純化片段連接到pEASY-T載體(北京全式金)上，轉(zhuǎn)化到T0P10感受態(tài)細(xì)胞，37° C條件下倒置培養(yǎng)過夜，挑取白色陽性克隆，加入LB液體培養(yǎng)基中37° C過夜振蕩培養(yǎng)，最后采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，陽性質(zhì)粒采用特異性引物擴(kuò)增驗(yàn)證后，送北京交擎科生物工程有限公司進(jìn)行測序。從圖1可知，Q型煙粉虱的特異性擴(kuò)增片段為721bp，回收克隆后測定其序列如SeqIDN0.1 所示。2.4特異性SCAR弓丨物的設(shè)計及驗(yàn)證基于Q型煙粉虱在RAPD擴(kuò)增中出現(xiàn)的特異性條帶Seq ID N0.1，采用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計SCAR特異性引物,其中一對特異性引物如下:Bt-F (5，-TCT CAT CGG TGT CTTATT G-3，)；Bt-R (5，-CTT CGG GTC GTT TCT CGT-3，),采用該引物對Q型煙粉虱進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，以其它粉虱種類(B型煙粉虱、溫室白粉虱、黑刺粉虱、桔綠粉虱及ZJ-2型煙粉虱)作為對照種群。本發(fā)明中優(yōu)化的PCR擴(kuò)增條件和擴(kuò)增程序如下:反應(yīng)體系設(shè)定為20 ii I，其中 2 X TaqlOMASTER Mix (其中包括 TaqDNAPolymerase0.1U/u l，2XTaq PCR Buffer, 3mM MgCl2 400 u M dNTP mix)為 IOu 1，上游引物和下游引物(10 u M)分另Ij為 I u I, DNA 模板為 lul, ddH20 為 7 y I。優(yōu)化的反應(yīng)程序如下:94°C預(yù)變性3min，之后進(jìn)行30個循環(huán)(94°C變性lmin，59°〇退火4586(:，721:延伸lmin50sec)，最后72°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，吸取PCR產(chǎn)物5U1進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示:在Q型煙粉虱中出現(xiàn)一條507bp的特異性條帶(見圖2中1_2號泳道);而在B型煙粉虱中出現(xiàn)兩條帶，大小約為507bp和660bp (見圖2中3_4號泳道)，而作為對照的其他粉虱種類中均未出現(xiàn)任何條帶，見圖2。2.5特異性引物對田間煙粉虱種群的特異性和穩(wěn)定性驗(yàn)證利用采自全國各地田間的不 同種群驗(yàn)證引物對的特異性和穩(wěn)定性，采集的種群先采用mtCOI基因擴(kuò)增并經(jīng)序列測定后確定其生物型或者種類，詳細(xì)信息見下表。驗(yàn)證試驗(yàn)中采用的田間煙粉虱種群的采集信息
權(quán)利要求
1.關(guān)于檢測B型煙粉虱和Q型煙粉虱的方法，包括對待測煙粉虱的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其特征在于: 所述PCR擴(kuò)增所采用的引物對如下:上游引物 Bt-F:5’ -TCT CAT CGG TGT CTT ATT G-3’，下游引物 Bt-R:5’ -CTT CGG GTC GTT TCT CGT-3’ ； 所述檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物指對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳并觀察是否出現(xiàn)特征帶型，Q型煙粉風(fēng)的特征帶型為一條507bp條帶；B型煙粉風(fēng)特征帶型為507bp和660bp兩條帶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述PCR擴(kuò)增的體系:TaqDNA聚合酶0.05U/yl、IXTaq緩沖液、氯化鎂1.5mM、dNTPs 200 ii M、上游引物和下游引物的濃度分別為0.5 ii M、DNA 模板濃度為 0.17 X 1(T5 0.2ng/ul，加 ddH20 至 20 yl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?94°C預(yù)變性3分鐘；然后進(jìn)行30個循環(huán):94°C變性I分鐘、59°C退火45秒、72°C延伸110秒；最后72°C延伸lOmin。
4.關(guān)于檢測B型煙粉虱和Q型煙粉虱的試劑盒，其特征在于包括一對PCR引物:上游引物 Bt-F:5’ -TCT CAT CGG TGT CTT ATT G-3’，下游引物 Bt-R:5’ -CTT CGG GTC GTT TCT CGT-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒 ，還包括用于PCR檢測的試劑:TaqDNA聚合酶，dNTPs，氯化鎂，Taq DNA聚合酶緩沖液和無菌水。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，所述PCR引物預(yù)混于PCR預(yù)混體系中，所述PCR預(yù)混體系如下:Taq DNA聚合酶0.05U/ill、I X Taq緩沖液、1.5mM氯化鎂、200 ii M dNTPs、上游引物和下游引物分別0.5 ii M和無菌水。
全文摘要
本發(fā)明同時鑒別Q型和B型煙粉虱的特異性PCR方法及試劑盒，屬于分子生物學(xué)檢測技術(shù)，包括對待測煙粉虱的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其特征在于所述PCR擴(kuò)增所采用的引物對如下上游引物Bt-F5’-TCT CAT CGG TGT CTTATT G-3’，下游引物Bt-R5’-CTT CGG GTC GTT TCT CGT-3’；所述檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物指對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳并觀察是否出現(xiàn)特征帶型，Q型煙粉虱的特征帶型為一條507bp條帶；B型煙粉虱特征帶型為507bp和660bp兩條帶，本發(fā)明還基于該方法提供了試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK103088147SQ20131004977
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月7日
發(fā)明者王少麗, 王金娜, 張友軍, 吳青君, 謝文, 徐寶云 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所