專利名稱：熱穩(wěn)定β-葡萄糖苷酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)熱穩(wěn)定￠-葡萄糖苷酶基因及其應(yīng)用，該基因編碼的蛋白可用于降解纖維二糖。
背景技術(shù)：
-葡萄糖苷酶又稱P -D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能夠水解結(jié)合于末端非還原性的P-D-葡萄糖苷鍵，同時(shí)釋放出D-葡萄糖和相應(yīng)的配基。1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁中發(fā)現(xiàn)此酶。后來的研究發(fā)現(xiàn)，￠-葡萄糖苷酶廣泛的存在于自然界許多植物、昆蟲、酵母、曲霉、木霉及細(xì)菌體內(nèi)，它參與生物體的糖代謝，對(duì)維持生物體正常生理功能起著重要作用(Ramakrishnan Anish, Mohammad Safikur Rahman, and MalaRaoj2007，Application of cellulase from an alkalothermophilic Thermomonosporasp.1n biopolishing of denims，Biotechnol.Bioeng.，96 (I): 48-56.)。隨著化石能源危機(jī)的日益加劇，以可再生性生物質(zhì)能源替代化石能源是解決目前能源緊張狀況的有效途徑(聶恒，朱靜，段旭，等，2011，纖維類物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的研究進(jìn)展，38 (3):28-34.)。木質(zhì)纖維素是自然界中數(shù)量最大的可再生性物質(zhì)(唐開宇，張全，{冬明友，2009, P -葡萄糖苷酶發(fā)酵技術(shù)的進(jìn)展,17 (3):65-70.),木質(zhì)纖維素能源化利用的關(guān)鍵是纖維素能夠高效降解為可發(fā)酵性單糖。酶法降解纖維素具有物理化學(xué)方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)一一條件溫和、效率高、無抑制后續(xù)發(fā)酵的有害化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生(SassnerP., Martensson C.G., Galbe M.，et al，2008，Steam pretreatment of H2S04-1mpregnatedsalix for the production of bioethanol, Bioresource Technology，99(I):137-145.)。在纖維素的酶法降解中，需要由包括￠-葡聚糖苷酶、纖維二糖水解酶和￠-葡萄糖苷酶3種水解酶組成的復(fù)合酶協(xié)同作用(馬英輝，王聯(lián)結(jié)，2009，秸桿預(yù)處理的最新研究進(jìn)展，纖維素科學(xué)與技術(shù)，17 (3):71-78.)，然而在目前所使用的纖維素降解復(fù)合酶中，普遍存在3 -葡萄糖苷酶活力低、熱穩(wěn)定性差的缺陷，致使纖維二糖積累，從而抑制了其它2個(gè)酶的活性，極大地影響了酶解效率(Garcia-Kirchenr 0., Seguar-GranadosM., Rodriguez-Pascual P., 2005, Effect of media composition and growth conditionson production of旦-glucosidase by Aspergillus niger C~6, Applied Biochemistryand Biotechnology, 121 (1/3):347-359.)。因此對(duì)P -葡萄糖苷酶的深入研究受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。除了在降解纖維素方面有著重要作用外，￠-葡萄糖苷酶在其他領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用，特別是在醫(yī)藥、食品、化工、生物轉(zhuǎn)化中具有重要的應(yīng)用價(jià)值(Michael E.H., MarkF.R., Charles E., 1999, Cellulase for commodity products from cellulosicbiomass.Curr.0pin.Biotechnol.，10 (4): 358 364.)。在醫(yī)學(xué)中，￠-葡萄糖苷酶應(yīng)用在某些癌癥的診斷和治療中，并獲得了許多成功(邵金輝，韓金祥，等，2005，￠-葡萄糖苷酶在工農(nóng)醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用.生命的化學(xué)，5 (01):22-24.)。在果汁生產(chǎn)中，￠-葡萄糖苷酶可以通過水解果汁中的3-D-糖苷鍵釋放出萜烯類物質(zhì)而增強(qiáng)果汁的香味；同時(shí)可以水解花色苷上的糖基去除果汁的顏色(LETRAON-MASSON M.P.，PELLERINP.，1998，Purification and characterization of two旦-D-glucosidases froman AspergiIlusnigerenzyme preparation:affinity and specificity towardglucosylated compounds characteristic of the processing of fruits,EnzymeMicrob.Tech.,22(5):374-382.)。在釀酒中，P _葡萄糖苷酶是重要的酶類物質(zhì)之一，不僅可以催化產(chǎn)生各類萜烯類物質(zhì)，而且可以水解各種糖苷類物質(zhì)生成各種具有芳香氣味的苷元，這些物質(zhì)共同決定了一種酒的特性(Gonzalez-Pombo P., Farinal L., CarraufF., et al, 2011, A novel extracellular旦-glucosidase from Issatchekia terricola:1solation, immobilization and application for aroma enhancement of white Muscatwine, Process Biochem., 46 (I): 385-389.)。許多風(fēng)味前體物質(zhì)和藥理活性成分主要以糖苷形式存在，需要3 -葡萄糖苷酶這種風(fēng)味酶將其釋放出揮發(fā)性糖苷配基，起到增香作用(金鳳燮，莊子瑜，魚紅閃，等，2009，特異的中草藥配糖體苷酶微生物及其發(fā)酵與酶學(xué)特性.生物工程學(xué)報(bào)，25 (12): 1863-1870.)。除此之外，P -葡萄糖苷酶還具有轉(zhuǎn)移葡萄糖基的活性，可用于低聚龍膽糖的生產(chǎn)(Yongling Qin, Yunkai Zhang, Haiyan He, et al,2011, Screening and identification of a fungal旦-glucosidase and the enzymaticsynthesis of gentiooligosaccharide.Appl Biochem Biotechnol.163(8):1012-9.)、紅景天苷的酶法合成(王夢(mèng)亮，李萬麗.2009，固定化￠-葡萄糖苷酶催化合成紅景天甙的研究.生物技術(shù)，19(1):68-70.)以及非離子表面活性劑烷基糖苷的合成(朱云，2007，葡萄糖酶法生物合成烷基糖苷工藝.浙江化工，38(11):3-6.)。目前已有上百個(gè)微生物、植物及動(dòng)物來源的P-葡萄糖苷酶基因得到克隆并被測(cè)序，其中許多微生物來源的3 -葡萄糖苷酶基因已獲得異源表達(dá)(韓笑，陳介南，王義強(qiáng)，等，2008，￠-葡萄糖苷酶基因的克隆與表達(dá)研究進(jìn)展。生物技術(shù)通報(bào)，3:8 13.)。相比之下，植物來源的￠-葡萄糖苷酶活性遠(yuǎn)比微生物來源的￠-葡萄糖苷酶的要低，因此，目前研究主要集中在微生 物來源上(石彩蕊，王義強(qiáng)，陳介南，等，2011，產(chǎn)￠-葡萄糖苷酶微生物育種研究進(jìn)展，生物技術(shù)通訊，3:59 - 65.)。而微生物中研究的較多的是酵母和絲狀真菌如木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)等霉菌以及細(xì)菌中的芽孢桿菌屬等(孟憲文，宋小紅，陳歷俊，等，2009，￠-葡萄糖苷酶的研究進(jìn)展.乳品加工，10:42-44.)。但木霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中存在多種真菌毒素以及得到的纖維素酶活力較低，尤其是3-葡萄糖苷酶活力很低，致使纖維二糖在反應(yīng)體系中積累而影響酶解效率，因而其應(yīng)用范圍受到限制。以0 -葡萄糖苷酶為關(guān)鍵詞查找國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利檢索數(shù)據(jù)庫(kù)，共出現(xiàn)163項(xiàng)發(fā)明專利。其中有30項(xiàng)發(fā)明專利是描述編碼￠-葡萄糖苷酶的基因及其應(yīng)用，而其他133項(xiàng)是與3 -葡萄糖苷酶在各種領(lǐng)域上的應(yīng)用有關(guān)。在這30項(xiàng)與編碼3 -葡萄糖苷酶的基因及其應(yīng)用相關(guān)的發(fā)明專利中的P-葡萄糖苷酶基因有8個(gè)是來自各種未培養(yǎng)微生物宏基因組文庫(kù)的、其它22個(gè)是來自20種不同生物，有嗜熱脫氨芽孢桿菌、里氏木霉、根瘤土壤桿菌、瓶霉XH8、Pyrococcus furiosus、嗜熱菌、黑曲霉、端氏木霉、黑曲霉、黑翅土白蟻、Clostridium sp.WGC702、曲霉菌株、嗜熱擬青霉、Dictyoglomus thermophilum DSM3960、嗜熱毛殼菌、釀酒酵母、極端嗜堿菌、嗜熱擬青霉、克氏內(nèi)芽孢桿菌和新鞘氨醇菌；1個(gè)來自白藜蘆醇。本發(fā)明獲得的P -葡萄糖苷酶是來自自行篩選到的鏈霉菌GX6 (Streptomycessp.GX6)，與基因數(shù)據(jù)庫(kù)中公開的P -葡萄糖苷酶的氨基酸的同源性較低，是一個(gè)新的葡萄糖苷酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從廣西南寧篩選到的鏈霉菌GX6的基因組中克隆到一個(gè)熱穩(wěn)定P -葡萄糖苷酶基因，在大腸桿菌宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因生產(chǎn)3 -葡萄糖苷酶，能以纖維二糖為原料降解生成葡萄糖，并且S-bgl6在50°C保溫72小時(shí)還保留有75%的酶活力。本發(fā)明所述的熱穩(wěn)定P -葡萄糖苷酶基因S_bgl6，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。是從實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的鏈霉菌GX6的基因組中克隆得到。該￠-葡萄糖苷酶基因S-bgl6的序列是由2319個(gè)堿基組成，含有完整的P -葡萄糖苷酶基因S-bgl6的開放閱讀框(OpenReading Frame, ORF), S_bgl6基因的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。SEQ ID N0:2的蛋白質(zhì)是基因S_bgl6編碼的￠-葡萄糖苷酶產(chǎn)物S_bgl6，由772個(gè)氨基酸組成，和S_ bgl6催化功能域同源性最高的是Streptomyces ambofaciensATCC23877 (生二素鏈霉菌 ATCC23877)的 putative beta-glucosidase (假定 P -葡萄糖苷酶)兩者的一致性=538/750 (72%)，相似性=599/750 (79%)?；騭-bgl6在大腸桿菌中表達(dá)的重組產(chǎn)物S_bgl6能夠分解纖維二糖。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體，及用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明基因的宿主。本發(fā)明所述的熱穩(wěn)定￠-葡萄糖苷酶基因S_bgl6所編碼的￠-葡萄糖苷酶在50°C保溫72小時(shí)還保留75%的酶活力，并且還具有分解纖維二糖的用途。


圖1是篩選含有0 -葡萄糖苷酶基因S_bgl6重組菌株的七葉苷選擇平板圖。圖2是P -葡萄糖苷酶S_bgl6純化物的SDS-PAGE圖。圖3是P -葡萄糖苷酶S_bgl6水解纖維二糖的HPLC圖。從圖1 了解到，含有P -葡萄糖苷酶基因S_bgl6的重組菌株能夠在七葉苷篩選平板上形成黑色圈。從圖2 了解到，P -葡萄糖苷酶S_bgl6純化物的分子量為82.5kDa。圖3中的A和B分別是葡萄糖和纖維二糖的標(biāo)樣。從圖3的C 了解到，P -葡萄糖苷酶S_bgl6能將纖維二糖水解成葡萄糖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施方法是為了更好的解釋本發(fā)明，而不應(yīng)該被解釋為限制本發(fā)明的目的。在本發(fā)明的實(shí)施例中所用到的材料包括:大腸桿菌(Escherichia coli)株系XLl-blue購(gòu)自大連TaKaRa公司；表達(dá)載體pSE380購(gòu)自Stratagene公司，限制性內(nèi)切酶、修飾酶等試劑購(gòu)自TaKaRa、MBI。下面將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述:I)鏈霉菌 Streptomyces sp.GX6 基因組 DNA 的提取鏈霉菌Streptomyces sp.GX6的基因組DNA是按照BioFlux公司的細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒 Biospin Bacteria Genomic DNA Extraction Kit (目錄號(hào) BSC12S1)的使用說明來提取的。
將提取好的鏈霉菌Str印tomyces sp.GX6的基因組DNA送華大基因公司測(cè)定基因組序列。2)鏈霉菌Streptomyces sp.GX6的基因組序列中編碼0 -葡萄糖苷酶基因序列的分析將獲得的鏈霉菌Streptomyces sp.GX6的基因組序列用NCBI (NationalCenter for Biotechnology Information, http://www.ncb1.nlm.nih.gov)上的軟件ORF finder (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)和Blast (http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行分析。結(jié)果共獲得 8 個(gè)與 ￠-葡萄糖苷酶具有較高同源性的開放閱讀框(Open Reading Frame, 0RF),本發(fā)明只涉及其中一個(gè) 0RF。3) ￠-葡萄糖苷酶基因S_bgl6的核苷酸序列分析用NCBI (National Center for BiotechnologyInformation, http://www.ncb1.nlm.nih.gov)上的軟件 ORF finder(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)和Blast (http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi) M DNA 序歹Ij 講-對(duì)〒分木斤?；騍-bgl6的開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)由2319個(gè)核苷酸組成,序列如SEQIDNO:1所示。其中，S-bgl6基因的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。4) ￠-葡萄糖苷酶基因S_bgl6編碼的產(chǎn)物S_bgl6的氨基酸序列分析^ -葡萄糖苷酶基因S_bgl6編碼一個(gè)含772個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，用DNAStar軟件預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的理論分子量大小為82494.18道爾頓。用簡(jiǎn)單組件結(jié)構(gòu)研究工具(SimpleModular Architecture ResearchTool, SMART, http://smart, embl-heidelberg.de)分析 3 -葡萄糖苷酶 S_bgl6 的組件結(jié)構(gòu)，結(jié)果是自N端的第30-252位和321-539位氨基酸為家族3糖基水解酶(glycosylhydrolase)功能域。5) ￠-葡萄糖苷酶基因S_bgl6的克隆和表達(dá)使用上游引物5 ’ -CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACACCGCGACCGAAGAAGACGCCG-3，和下游引物5’ -CATAAGCTTTCAGCTCACCTGCCGACCGCTC-3’，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增
葡萄糖苷酶基因S-bgl6，用限制性內(nèi)切酶Pag I和Hind III酶切￠-葡萄糖苷酶基因S-bgl6后，與經(jīng)Nco I和Hind III酶切的表達(dá)載體pSE380進(jìn)行連接。再將連接產(chǎn)物用CaC12法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XLl-blue中，涂布到含100 y g/mL氨芐青霉素的LA平板上。轉(zhuǎn)化得到的單菌落點(diǎn)板至含有100 u g/mL氨芐青霉素、七葉苷、檸檬酸鐵銨的LA復(fù)篩培養(yǎng)基(每IOOmL復(fù)篩培養(yǎng)基含:七葉苷:0.2g，檸檬酸鐵銨:0.5g，蛋白胨:lg,酵母粉:0.5g，NaCl:
0.5g，瓊脂粉:1.5g)平板上，將平板置于37°C恒溫箱培養(yǎng)5小時(shí)，對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)點(diǎn)菌落逐個(gè)滴加I U L用LB培養(yǎng)基稀釋成1%的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，然后，將平板置于37°C恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。時(shí)間到后，進(jìn)行氯仿熏蒸破胞，再把平板置于37°C恒溫箱使表達(dá)的S-bgl6酶與七葉苷和檸檬酸鐵銨反應(yīng)4小時(shí)。觀察篩選平板。然后進(jìn)一步提取在篩選平板能形成黑色圈的克隆子的質(zhì)粒DNA，并將其命名為pSE-S-bgl6，用限制性內(nèi)切酶NcoI和HindIII完全酶切pSE-S_bgl6后，進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果pSE-S-bgl6 除有一個(gè)約4.5kb的DNA片段外，還有一條大小約為1.9kb的DNA片段。將含有質(zhì)粒pSE-S_bgl6的重組大腸桿菌XLl-blue菌株接種到600mL含100 U g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)，待0D_為0.4時(shí)，加入IPTG使其終濃度為
0.Smmol /T,, 30°C、220轉(zhuǎn)誘導(dǎo) 10 小時(shí)。IIOOOrpm離心 3min,收集菌體，用 4mT, pH7.0lOOmmoI/L的磷酸緩沖液重懸菌體，超聲波破胞9分鐘。12000rpm離心20min,取上清進(jìn)行后面的蛋白質(zhì)純化。按每4mL上清液加入lmL50%的鎳親和層析膠體，在4°C用200轉(zhuǎn)搖60分鐘，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加ImL沖洗緩沖液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl,20mmol/L咪唑，pH8.0)到柱子里，緩慢攪拌，收集流出物。重復(fù)沖洗步驟4次。加入洗脫緩沖液(50mmol/LNaH2P04，300mmol/LNaCl，250mmol/L 咪唑，pH8.0)洗脫蛋白質(zhì)。收集洗脫的蛋白質(zhì)溶液，用變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)有目的大小的蛋白質(zhì)條帶。6) ￠-葡萄糖苷酶S_bgl6水解纖維二糖的測(cè)定^ -葡萄糖苷酶S_bgl6以纖維二糖為底物、在pH6.5的磷酸氫二鈉磷酸二氫鈉緩沖液和50°C下作用30分鐘。反應(yīng)時(shí)間到后，在100°C加熱10分鐘終止反應(yīng)。S-bgl6水解纖維二糖的產(chǎn)物用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行檢測(cè)。HPLC檢測(cè)的結(jié)果顯示:S_bgl6能夠?qū)⒗w維二糖水解成葡萄糖。

HPLC條件:儀器:Agilentll00色譜儀；色譜柱:氨基柱;流動(dòng)相:乙腈:水(70:30);流速:1.0mL/min;檢測(cè)器:RID (折光檢測(cè)器)。7) ^ -葡萄糖苷酶S_bgl6熱穩(wěn)定性的測(cè)定將純化的S_bgl6放置在溫度為50°C的水浴鍋中保溫72小時(shí)。開始的48小時(shí)每隔6個(gè)小時(shí)取樣、后24小時(shí)每隔3個(gè)小時(shí)分別取出IOii L的S-bgl6酶液。然后以對(duì)硝基苯基-P -D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)為底物在pH6.5和50°C條件下測(cè)定S_bgl6的酶活，其中以保存在4°C的S-bgl6在相同條件下測(cè)定的酶活作為對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)P -葡萄糖苷酶S_bgl6在50°C保溫72小時(shí)后仍然保留有75%的酶活力。
權(quán)利要求
1.一個(gè)熱穩(wěn)定￠-葡萄糖苷酶基因S-bgl6，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:I所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的基因所編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQID N0:2所示。
3.—種表達(dá)載體,其特征在于,它含有權(quán)利要求1所述的基因。
4.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它是權(quán)利要求3所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
5.權(quán)利要求 2所述的蛋白質(zhì)在降解纖維二糖中的應(yīng)用。
全文摘要
一個(gè)熱穩(wěn)定β-葡萄糖苷酶基因S-bgl6及其應(yīng)用，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，所述基因編碼的β-葡萄糖苷酶S-bgl6，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，所述基因編碼的β-葡萄糖苷酶S-bgl6在50℃保溫72小時(shí)還保留有75%的酶活力。該酶能夠在分解纖維二糖中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/42GK103146725SQ20131004960
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月7日
發(fā)明者杜麗琴, 韋宇拓, 龐浩, 黃日波, 王子龍, 陸堅(jiān) 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)