專利名稱：編碼糖基水解酶家族1的β-葡萄糖苷酶基因及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個編碼糖基水解酶家族I的β-葡萄糖苷酶基因及其應用，該基因編碼的蛋白質(zhì)可用于降解纖維二糖。
背景技術(shù)：
β_葡萄糖苷酶是纖維素酶系的一種，它催化水解β-D-葡萄糖苷鍵，在人類、動物、植物和微生物的糖類代謝方面具有重要的價值(Ramakrishnan Anish, MohammadSafikur Rahman,and Mala Raoj 2007,Application of cellulase from analkalothermophilic Thermomonospora sp.1n biopolishing of denims, Biotechnol.Bioeng.，96(1):48-56.)。根據(jù)氨基酸序列分類，人們將β _葡萄糖苷酶劃分在糖苷水解酶家族I和3中。家族I中的β-葡萄糖苷酶主要來源于細菌、植物；家族3中的β —葡萄糖苷酶主要來自真菌、細菌和植物。家族I中的β —葡萄糖苷酶除有葡萄糖苷酶活性外，還有很強的半乳糖苷酶活性(HENRISSATB., 1991,A classification of glycosylhydrolasesbased on amino acid sequence similarities, Biochem,293:781-788.Xβ-葡萄糖苷酶在纖維素降解中具有重要作用(Sestelo A.B.F., Poza M.,VillaT.C.2004, β -Glucosidase activity in a Lactobacillus plantarum wine strain.World Journal ofMicrobiology&Biotechnology, 20:633 637.)。纖維素作為植物光合作用的主要多糖類產(chǎn)物，是地球上含量最豐富的碳水化合物，也是數(shù)量最大的一種可再生資源。據(jù)報道，全球每年通過光合作用產(chǎn)生的纖維素高達1.55X 109t，其中85%尚未被人類利用(DUNLAP C，CHIANG G C.Utilization and recycle of agriculture wastesand residues.Shuler M L.Boca Raton, Florida.USA:CRC Press Inc,1980.19.) 當今，能源短缺是人類面臨的重大問題之一。而對于纖維素的利用是解決能源危機、糧食短缺、環(huán)境污染的重要途徑。葡萄糖苷酶水解纖維二糖生成兩分子葡萄糖，是纖維素酶復合酶系發(fā)揮協(xié)同作的關(guān) 鍵酶，對纖維素酶系的整體水解活性有很強的促進作用，可以通過提高纖維素酶系中β -葡萄糖苷酶的活性來改善整個纖維素酶系的功用(BhatK.Μ., Bhat S.1997, Cellulose degrading enzymes and their potential industrialapplications.Biotechnol.Adv.,15:583 620.),因此對β -葡萄糖苷酶的深入研究受到人們越來越多的關(guān)注。除了在降解纖維素方面有著重要作用外，葡萄糖苷酶在其他領(lǐng)域也有廣泛應用，特別是在醫(yī)藥、食品、生物轉(zhuǎn)化中具有重要的應用價值(Mi chae I Ε.H.，MarkF.R., Charles E.,1999,Cellulase for commodity products from cellulosic biomass.Curr.0pin.Biotechnol.，10 (4): 358 364.)。在醫(yī)學中，β -葡萄糖苷酶應用在某些癌癥的診斷和治療中，并獲得了許多成功(邵金輝，韓金祥，等，2005，β-葡萄糖苷酶在工農(nóng)醫(yī)領(lǐng)域的應用.生命的化學，5 (01):22-24.)。在水果、蔬菜、茶葉等食料和中草藥中，葡萄糖苷酶可作為風味酶，對改良果汁風味，果酒增香和茶葉增香均有顯著作用(李遠華.2002，β-葡萄糖苷酶的研究進展.安徽農(nóng)業(yè)大學學報.29(4):421-425.)。許多風味前體物質(zhì)和藥理活性成分主要以糖苷形式存在，需要β-葡萄糖苷酶這種風味酶將其釋放出揮發(fā)性糖苷配基，起到增香作用(金鳳燮，莊子瑜，魚紅閃，等，2009，特異的中草藥配糖體苷酶微生物及其發(fā)酵與酶學特性.生物工程學報，25 (12): 1863-1870.)。除此之外，葡萄糖苷酶還具有轉(zhuǎn)移葡萄糖基的活性，可用于低聚龍膽糖的生產(chǎn)(YonglingQin,Yunkai Zhang, Haiyan He, et al,2011, Screening and identification of afungalβ -glucosidase and the enzymatic synthesis of gentiooligosaccharide.ApplBiochem Biotechnol.163 (8): 1012-9.)、紅景天苷的酶法合成(王夢亮，李萬麗.2009，固定化β_葡萄糖苷酶催化合成紅景天甙的研究.生物技術(shù)，19(1):68-70.)以及非離子表面活性劑烷基糖苷的合成(朱云，2007，葡萄糖酶法生物合成烷基糖苷工藝.浙江化工，38(11):3-6.)。目前已有上百個微生物、植物及動物來源的β-葡萄糖苷酶基因得到克隆并被測序，其中許多微生物來源的葡萄糖苷酶基因已獲得異源表達(韓笑，陳介南，王義強，等，2008，β-葡萄糖苷酶基因的克隆與表達研究進展。生物技術(shù)通報，3:8 13.)。相比之下，植物來源的葡萄糖苷酶活性遠比微生物來源的葡萄糖苷酶的要低，因此，目前研究主要集中在微生物來源上(石彩蕊，王義強，陳介南，等，2011，產(chǎn)β -葡萄糖苷酶微生物育種研究進展，生物技術(shù)通訊，3:59 - 65.)。而微生物中研究的較多的是酵母和絲狀真菌如木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)等霉菌以及細菌中的芽孢桿菌屬等(孟憲文，宋小紅，陳歷俊，等，2009，β-葡萄糖苷酶的研究進展.乳品加工，10:42-44.)。但木霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中存在多種真菌毒素以及得到的纖維素酶活力較低，尤其是β_葡萄糖苷酶活力很低，致使纖維二糖在反應體系中積累而影響酶解效率，因而其應用范圍受到限制。在產(chǎn)葡萄糖苷酶的微生物中有很多種都不止編碼一種葡萄糖苷酶，該酶分子量變化較大，微生物中從18kD 480kD均有報道，酶學性質(zhì)也可相差很遠(韓笑，陳介南，王義強，2008，β-葡萄糖苷酶基因的克隆與表達研究進展。生物技術(shù)通報，3:8 13.)。

以β -葡萄糖苷酶為關(guān)鍵詞查找國家知識產(chǎn)權(quán)局專利檢索數(shù)據(jù)庫，共出現(xiàn)163項發(fā)明專利。其中有30項發(fā)明專利是描述編碼β_葡萄糖苷酶的基因及其應用，而其他133項是與β_葡萄糖苷酶在各種領(lǐng)域上的應用有關(guān)。在這30項與編碼β_葡萄糖苷酶的基因及其應用相關(guān)的發(fā)明專利中的β-葡萄糖苷酶基因有8個是來自各種未培養(yǎng)微生物宏基因組文庫的、其它22個是來自20種不同生物，有嗜熱脫氨芽孢桿菌、里氏木霉、根瘤土壤桿菌、瓶霉ΧΗ8、Pyrococcus furiosus、嗜熱菌、黑曲霉、端氏木霉、黑曲霉、黑翅土白蟻、Clostridium sp.WGC702、曲霉菌株、嗜熱擬青霉、Dictyoglomus thermophilum DSM3960、嗜熱毛殼菌、釀酒酵母、極端嗜堿菌、嗜熱擬青霉、克氏內(nèi)芽孢桿菌和新鞘氨醇菌；1個來自白藜蘆醇。本發(fā)明獲得的β -葡萄糖苷酶是自行篩選的鏈霉菌GX6 (Streptomycessp.GX6),與基因數(shù)據(jù)庫中公開的β_葡萄糖苷酶的氨基酸的同源性較低，是一個新的β_葡萄糖苷酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從廣西南寧篩選到的鏈霉菌GX6的基因組中克隆到一個編碼β -葡萄糖苷酶的基因，在大腸桿菌宿主細胞中表達該基因生產(chǎn)β_葡萄糖苷酶，并能以纖維二糖為原料降解生成葡萄糖。
本發(fā)明涉及一種編碼糖基水解酶家族I的β_葡萄糖苷酶的基因S_bgl4，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，是從實驗室篩選到的鏈霉菌GX6的基因組中克隆得到。該β -葡萄糖苷酶基因S-bg4的序列是由1278個堿基組成，含有完整的β -葡萄糖苷酶基因S-bgl4的開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)，S_bg4基因的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。SEQ ID N0:2的蛋白質(zhì)是基因S_bgl4編碼的β-葡萄糖苷酶產(chǎn)物S_bgl4，由425個氨基酸組成，和S_bgl4催化功能域同源性最高的是Streptomyces ambofaciensATCC23877 (生二素鏈霉菌 ATCC23877)的 putative beta-glucosidase (假定 β -葡萄糖苷酶)兩者的一致性=305/427 (71%)，相似性=345/427 (80%)?；?Sbgl4在大腸桿菌中表達的重組產(chǎn)物S_bgl4能夠分解纖維二糖。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明基因的表達載體，及用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明基因的宿主。本發(fā)明提供了一個編碼糖基水解酶家族I的葡萄糖苷酶基因，該基因所編碼糖基水解酶家族I的β-葡萄糖苷酶能夠在分解纖維二糖中應用。


圖1是篩選含有β -葡萄糖苷酶基因S_bg4重組菌株的七葉苷選擇平板圖。圖2是β -葡萄糖苷酶S_bgl4純化物的SDS-PAGE圖。圖3是β -葡萄糖苷酶S_bgl4水解纖維二糖的HPLC圖。從圖1 了解到，含有β -葡萄糖苷酶基因S_bgl4的重組菌株能夠在七葉苷篩選平板上形成黑色圈。

圖2 了解到，β -葡萄糖苷酶S_bgl4純化物的分子量為46.1kDa0圖3中的A和B分別是葡萄糖和纖維二糖的標樣。從圖3的C 了解到，β -葡萄糖苷酶S_bgl4能將纖維二糖水解成葡萄糖。
具體實施例方式下述實施方法是為了更好的解釋本發(fā)明，而不應該被解釋為限制本發(fā)明的目的。在本發(fā)明的實施例中所用到的材料包括:大腸桿菌(Escherichia coli)株系XLl-blue購自大連TaKaRa公司；表達載體pSE380購自Stratagene公司，限制性內(nèi)切酶、修飾酶等試劑購自TaKaRa、MBI。下面將通過實施例對本發(fā)明作詳細描述:I)鏈霉菌 Streptomyces sp.GX6 基因組 DNA 的提取鏈霉菌Streptomyces sp.GX6的基因組DNA是按照BioFlux公司的細菌基因組DNA 提取試劑盒 Biospin Bacteria Genomic DNA Extraction Kit (目錄號 BSC12S1)的使用說明來提取的。將提取好的鏈霉菌Str印tomyces sp.GX6的基因組DNA送華大基因公司測定基因組序列。2)鏈霉菌Streptomyces sp.GX6的基因組序列中編碼β -葡萄糖苷酶基因序列的分析將獲得的鏈霉菌Streptomyces sp.GX6的基因組序列用NCBI (NationalCenter for Biotechnology Information, http: //www.ncb1.nlm.nih.gov)上的軟件 ORFfnder (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)和 Blast(http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行分析。結(jié)果共獲得8個與β -葡萄糖苷酶具有較高同源性的開放閱讀框(Open Reading Frame, 0RF),本發(fā)明只涉及其中一個0RF。3)編碼糖基水解酶家族I的β -葡萄糖苷酶基因S_bgl4的核苷酸序列分析用 NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncb1.nlm.nih.gov)上的軟件 ORF finder (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)和Blast (http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對 DNA 序列進行分析。基因 S_bgl4的開放閱讀框(Open Reading Frame, 0RF)由1278個核苷酸組成,序列如SEQ ID NO:10其中，S-bgl4基因的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。4)編碼糖基水解酶家族I的β -葡萄糖苷酶基因S_bgl4編碼的產(chǎn)物S_bgl4的氨基酸序列分析β -葡萄糖苷酶基因S_bgl4編碼一個含425個氨基酸的蛋白質(zhì)，用DNAStar軟件預測該蛋白質(zhì)的理論分子量大小為46183.9道爾頓。用簡單組件結(jié)構(gòu)研 究工具(SimpleModular Architecture ResearchTool, SMART, http://smart, embl-heidelberg.de)分析 β -葡萄糖苷酶 S_bgl4 的組件結(jié)構(gòu)，結(jié)果是自N端的第7-263位和284-410位氨基酸為家族I糖基水解酶(glycosyIhydrolase)功能域、第35-192位為纖維素酶cellulase的功能域。5)編碼糖基水解酶家族I的β -葡萄糖苷酶基因S_bgl4的克隆和表達使用上游引物5 ’ -CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACACGCCCCCGTTCGGGTCCGAAC-3 ’和下游引物5’ -CATAAGCTTCTAACGCGCGGTCGGGGCACCG-3’,通討聚合酶鏈式反應(PCR)擴增β-葡萄糖苷酶基因S-bgl4，用限制性內(nèi)切酶Pag I和Hind III酶切葡萄糖苷酶基因S_bgl4后，與經(jīng)Nco I和Hind III酶切的表達載體pSE380進行連接。再將連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XLl-blue中，涂布到含100 μ g/mL氨芐青霉素的LA平板上。轉(zhuǎn)化得到的單菌落點板至含有100 μ gmL氨芐青霉素、七葉苷、檸檬酸鐵銨的LA復篩培養(yǎng)基(每IOOmL復篩培養(yǎng)基含:七葉苷:0.2g，檸檬酸鐵銨:0.5g，蛋白胨:lg，酵母粉:0.5g，NaCl:0.5g，瓊脂粉:1.5g)平板上，將平板置于37°C恒溫箱培養(yǎng)7小時，對每個轉(zhuǎn)點菌落逐個滴加I μ L用LB培養(yǎng)基稀釋成1%的IPTG誘導表達，然后，將平板置于37°C恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)6小時。時間到后，進行氯仿熏蒸破胞，再把平板置于37° C恒溫箱使表達的S-bgl4酶與七葉苷和檸檬酸鐵銨反應8小時。觀察復篩平板。然后進一步提取在復篩平板能形成黑色圈的克隆子的質(zhì)粒DNA，并將其命名為pSE-S-bgl4，用限制性內(nèi)切酶NcoI和HindIII完全酶切pSE-S_bgl4后，進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果pSE-S-bgl4除有一個約4.4kb的DNA片段外，還有一條大小約為975bp的DNA片段。將含有質(zhì)粒pSE-S_bgl4的重組大腸桿菌XLl-Blue菌株接種到600mL含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)，待0D_為0.4時，加入IPTG使其終濃度為
0.Smmol /T,, 30°C、200轉(zhuǎn)誘導 10 小時。IIOOOrpm離心 3min,收集菌體，用 4mT, pH7.0IOOmmoI/L的磷酸緩沖液重懸菌體，超聲波破胞9分鐘。12000rpm離心20min,取上清進行后面的蛋白質(zhì)純化。按每4mL上清液加入lmL50%的鎳親和層析膠體，在4°C用200轉(zhuǎn)搖60分鐘，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加ImL沖洗緩沖液(50mmol/LNaH2P04，300mmol/LNaCl,20mmol/L咪唑，pH8.0)到柱子里，緩慢攪拌，收集流出物。重復沖洗步驟4次。加入洗脫緩沖液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl，250mmol/L 咪唑，pH8.0)洗脫蛋白質(zhì)。收集洗脫的蛋白質(zhì)溶液，用變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗證，發(fā)現(xiàn)有目的大小的蛋白質(zhì)條帶。6)編碼糖基水解酶家族I的β -葡萄糖苷酶S_bgl4水解纖維二糖的測定β -葡萄糖苷酶S_bgl4以纖維二糖為底物、在pH6.5的磷酸氫二鈉_檸檬酸緩沖液和45°C下作用30分鐘。反應時間到后，在100°C加熱10分鐘終止反應。S_bgl4水解纖維二糖的產(chǎn)物用高效液相色譜法(HPLC)進行檢測。HPLC檢測的結(jié)果顯示:S_bgl4能夠水解纖維二糖生成葡萄糖。HPLC條件:儀器=AgilentllOO色譜儀；色譜柱:氨基柱;流動相:乙腈:水(70:30);流速:1.0mL/min;檢測器:RID (折光檢測器)。S-bgl4以 纖維二糖為底物的酶活力為214.78U/mg。
權(quán)利要求
1.一個編碼糖基水解酶家族I的β-葡萄糖苷酶的基因s-bgl4，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的基因所編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
3.—種表達載體,其特征在于,它含有權(quán)利要求1所述的基因。
4.一種宿主細胞，其特征在于，它是權(quán)利要求3所述表達載體轉(zhuǎn)化的原核細胞或真核細胞。
5.權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)在降解纖維二糖中的應用。
全文摘要
一個來自鏈霉菌的編碼糖基水解酶家族1的β-葡萄糖苷酶的基因及其應用，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，所述基因編碼的β-葡萄糖苷酶S-bgl4，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，該酶能夠在分解纖維二糖中應用。
文檔編號C12N9/42GK103114099SQ201310049608
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月7日
發(fā)明者杜麗琴, 王子龍, 韋宇拓, 龐浩, 黃日波, 譚慧敏, 閉海 申請人:廣西大學