專利名稱:與腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥相關(guān)的基因突變及其檢測試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及與腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥相關(guān)的基因突變、檢測該突變所使用的引物、探針、抗體和試劑盒。
背景技術(shù):
腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(adrenoleukodystrophy, ALD)是一種遺傳性疾病,其特點是進行性彌漫性腦白質(zhì)硬化,伴有腎上腺皮質(zhì)功能減退。X染色體連鎖性的ALD是最常見的一種類型,其臨床表現(xiàn)具有高度異質(zhì)性。ALD兒童患者僅見于男性,進行性神經(jīng)性失能,10歲前發(fā)病,平均發(fā)病年齡7.2+/-1.7歲(2.75-10歲),3歲前多數(shù)發(fā)育正常,無精神運動障礙。86%病例先出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,其中85%對ACTH興奮顯示皮質(zhì)醇分泌不足,追問病史曾有不能解釋的惡心、嘔吐、脫水、無力、皮膚色素沉著等腎上腺皮質(zhì)功能減退的表現(xiàn),早期的神經(jīng)精神癥狀表現(xiàn)為情緒不穩(wěn)定,學習成績不良,繼而快速發(fā)展為頂顳葉功能障礙,語言辨別能力和實體覺喪失,體全覺差;1/3早期病例視覺喪失,約1/3有全身性和局限性癲癇,短期內(nèi)成為植物人(1.9+/-2年)。青春期ALD,起病介于10-21歲,癥狀類似兒童ALD,但進展慢,表現(xiàn)類似AMN,常伴有性功能障礙。通常,該疾病的可靠診斷是培養(yǎng)纖維母細胞中顯示極長鏈飽和脂肪酸(VLCFAS)濃度增高。產(chǎn)前診斷可作羊膜穿刺細胞培養(yǎng),但VLCFAS檢查技術(shù)上極其困難。CT掃描和MRI有較大價值,病變部位顯示低密度,造影劑加強后低密度區(qū)鄰近有花環(huán)狀造影劑堆積。MRI較CT掃描更具有診斷價值。分子生物學研究表明,X連鎖性ALD是由于位于X染色體長臂28區(qū)的AB⑶I基因發(fā)生突變。AB⑶I基因由10個外顯子和9個內(nèi)含子組成,編碼區(qū)序列長度為2238個堿基(如SEQ ID N0.1所示)。AB⑶I基因編碼的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白包括745個氨基酸(如SEQ IDN0.2所示),該蛋白的作用是將長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運至過氧化物酶體。當AB⑶I基因發(fā)生突變時,其編碼的蛋白的一級序列可能發(fā)生改變,從而無法正常發(fā)揮作用,造成極長鏈飽和脂肪酸在臟器堆積,導(dǎo)致發(fā)病。目前國內(nèi)外均有多個中心可對AB⑶I基因進行基因突變的檢測,已發(fā)現(xiàn)400多種基因突變類型可導(dǎo)致X連鎖隱性ALD,但大多數(shù)家系都具有同一種特殊的基因型。不同家系的表現(xiàn)型差異很大,這一特征與各種修飾基因或其它一些尚未了解清楚的因素有關(guān)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種導(dǎo)致腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥的ABCDl基因的突變,并提供能夠檢測該突變的引物、探針、抗體、試劑盒等,從而為診斷腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥提供一種新的方式。
本發(fā)明的第一個方面是提供一種AB⑶I基因突變體,其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。所述基因突變體是ABCDl基因的編碼序列第657、658位的胞嘧啶缺失所形成的。發(fā)明人通過基因測序的方法對ALD病患進行檢測,發(fā)現(xiàn)該病患的AB⑶I編碼基因第657、658位胞嘧啶缺失,該位點位于ABCDl基因的第一外顯子中。進一步分析其家庭成員的AB⑶I基因序列,病患父親的AB⑶I基因正常,病患母親的AB⑶I基因為雜合子,是該突變的攜帶者,但母親沒有發(fā)病。該突變是首次在中國ALD病患中發(fā)現(xiàn),之前未見文獻報導(dǎo),為檢測和判斷ALD病患提供一種新的方式。本發(fā)明提供的基因突變體或包括缺失位點的基因突變體片段可以作為分子標記,在檢測ABCDl編碼基因是否存在突變時作為標準,供相關(guān)人員分析。在一種優(yōu)選的實施方式中,所述包括缺失位點的ABCDl基因突變體片段包含SEQID N0.3中的至少10個連續(xù)核苷酸,并且所述至少10個連續(xù)核苷酸包含SEQ ID N0.3的第656、657、658位核苷酸。這樣的基因突變體片段的長度可以是10-700個核苷酸,例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650 等任意長度。在一種優(yōu)選的實施方式中,所述包括缺失位點的ABCDl基因突變體片段是上述片段的反向互補序列。由于本發(fā)明的ABCDl基因突變體缺失了兩個胞嘧啶,導(dǎo)致其編碼的氨基酸序列發(fā)生變化,無法翻譯出能夠行使正常功能的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白,從而導(dǎo)致發(fā)生ALD。因此,本發(fā)明的第二個方面是提供一種多肽,所述多肽具有如SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列,所述氨基酸序列由SEQ ID N0.3的核苷酸序列編碼。將該基因突變體編碼 的氨基酸序列(SEQ ID N0.4)與正常AB⑶I基因編碼的氨基酸(SEQ ID N0.2)進行比對可見,由于本發(fā)明的基因突變體核苷酸序列中缺失對應(yīng)于正常AB⑶I基因編碼序列的第657、658位核苷酸,使得其編碼的氨基酸序列(SEQ ID N0.4)從第220位起開始發(fā)生變化,并且第299位氨基酸由組氨酸變成終止密碼子。該基因突變體所編碼的蛋白質(zhì)無法實施正??缒さ鞍椎霓D(zhuǎn)運功能。同樣,本發(fā)明提供的多肽或多肽片段可以作為分子標記,用于在檢測該跨膜蛋白是否存在突變時作為對照品。在一種優(yōu)選的實施方式中,所述多肽片段包括SEQ ID N0.4的第220位至第298位中的至少10個連續(xù)氨基酸。所述多肽片段的長度可以是1(T298個氨基酸。在進一步優(yōu)選的實施方式中,所述多肽片段是PGRG⑶FLHPASGGP (SEQ ID N0.11)。本發(fā)明的第三個方面是提供能夠擴增出SEQ ID N0.3所示序列的第657、658位核苷酸的引物,利用所述引物通過測序的方法檢測ABCDl基因的序列。設(shè)計引物的原則包括:(I)可以擴增出SEQ ID N0.3所示序列的第657、658位核苷酸(S卩,ABCDl基因編碼序列的第657、658位核苷酸);(2)在核酸序列的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計,同時需要具有特異性;(3)利用所述引物擴增出的產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu);(4)引物長度一般在15 30個堿基;(5)G+C含量為40% 60% ; (6)引物與靶序列作用的Tm值以60°C左右最佳;(7)堿基要隨機分布;(8)單向引物自身不能有連續(xù)4個堿基互補;(9)雙向引物之間不能有連續(xù)4個堿基互補;(10)引物5'端可以修飾;(11)引物3'端不可修飾;(12)引物3'端要避開密碼子的第3位。在一種優(yōu)選的實施方式中,本發(fā)明提供的擴增引物是:上游引物:ABCD1-F:5,-CCACGCCTACCGCCTCTACTT-3,(SEQID N0.5);下游引物:ABCD1-R:5’-AGACTGTCCCCACCGCTC-3’(SEQ ID N0.6)。
利用弓丨物擴增-測序方法檢測ABCDl基因的步驟是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如,采集待測樣本的血液,提取DNA ; WDNA為模板,利用本發(fā)明提供的引物進行擴增;對得到的產(chǎn)物進行測序分析;將所得的序列與正常的ABCDl基因序列比較,判斷待測樣本中的ABCDl基因是否存在第657、658位核苷酸缺失。本發(fā)明的第四個方面是提供能夠檢測SEQ ID勵.3所示序列的第657、658位核苷酸(即,ABCD1基因編碼序列第657、658位核苷酸)的探針。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知,通過雜交的方法,利用探針是否能夠與待測序列(如基因或基因片段或擴增產(chǎn)物)結(jié)合來檢測待測序列是否存在變異。本領(lǐng)域中已知有多種利用探針檢測序列的方法。在已知檢測位點是ABCDl基因編碼序列第657、658位核苷酸缺失的情況下,本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠充分了解如何設(shè)計探針。在一種實施方式中,本發(fā)明的探針是Taqman探針,該探針的設(shè)計原則包括:(I)探針與擴增產(chǎn)物間有完全互補的序列;(2)探針位置盡可能靠近擴增引物(擴增產(chǎn)物50-150bp)上游,但不能與引物重疊;(3)探針序列不易形成二級結(jié)構(gòu);(3) Tm值高于引物(10°C),退火溫度Tm控制在68-70°C左右;(4)探針的5’端第一個堿基不能是鳥嘌呤(G);
(5)避免同一堿基重復(fù)過多,特別是連續(xù)4個或更多的G ; (6)檢測SNP或突變時,區(qū)分位點盡量位于探針中央;(7) G-C含量控制在40-80%左右;(8)探針序列中含有比較多的堿基C0在一種優(yōu)選的實施方式中,所述探針序列為:對照組:5’-AGCCACTCCTGGACGT-3’ (SEQ ID N0.7);突變組:5’-AGCCACTTGGACGT-3,(SEQ ID N0.8)。在另一種實施方式中,所述探針為MLPA方法的探針,探針序列為:正向:5’-CTGACCAAGCCACT-3’ (SEQ ID N0.9);反向:5’-GTCACAGCCACGTCCA-3’ (SEQ ID N0.10)。在另一種實施方式中,所述探針為基因芯片的探針,探針序列為:5,-AGCCACTTGGACGT-3,(SEQ ID N0.8)。本發(fā)明的第五個方面是提供抗本發(fā)明的多肽或多肽片段的抗體,特別是抗包含SEQ ID N0.4的第220位至第298位中的至少10個連續(xù)氨基酸的多肽片段的抗體。在一種優(yōu)選的實施方式中,本發(fā)明的抗體是抗PGRG⑶FLHPASGGP多肽片段的抗體。利用本發(fā)明提供的抗體檢測ALD的方式有:1)用抗正常AB⑶I蛋白的抗體檢測,若在樣本中未現(xiàn)陽性信號,則說明該樣本不表達或表達的ABCDl蛋白有異常;2)用抗突變型ABCDl蛋白的抗體檢測,若樣本中出現(xiàn)陽性信號,則說明該樣本發(fā)生異常;3)用抗正常ABCDl和突變型ABCDl蛋白的抗體同時檢測,若在樣本中兩者都出現(xiàn)陽性信號,則樣本為攜帶者;若只抗正常AB⑶I的抗體出現(xiàn)陽性信號,則為正常;反之,則為患者。具體的檢測方法可選用ELISA法,試紙條法等。這些方法的過程和結(jié)果判斷方式都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本發(fā)明的第六個方面是提供能夠檢測SEQ ID N0.3所示序列的第657、658位核苷酸的試劑盒,所述試劑盒包括本發(fā)明的引物和/或探針,以及為進行PCR實驗或雜交實驗所必需的試劑。在另一種實施方式中,所述試劑盒能夠檢測SEQ ID N0.4的多肽,包括本發(fā)明的抗體以及為進行抗體抗原免疫反應(yīng)實驗所必需的試劑。所述PCR實驗、雜交實驗和抗體抗原免疫反應(yīng)實驗都是本領(lǐng)域的公知技術(shù),本領(lǐng)域技術(shù)人員毫無疑義地知道做這些實驗必需哪些試劑。因此,本發(fā)明的第七個方面是提供本發(fā)明的引物、探針或抗體在制備檢測ABCDl基因突變體的試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的核苷酸序列是ABCDl基因編碼序列缺失了兩個胞嘧啶,從而導(dǎo)致編碼的蛋白從第220位開始發(fā)生氨基酸序列改變,且第299位的組氨酸變成終止密碼子,形成無義突變。該突變導(dǎo)致編碼的蛋白無法發(fā)揮跨膜轉(zhuǎn)運的作用,使極長鏈飽和脂肪酸在臟器堆積,發(fā)生腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良病。因此,本發(fā)明提供的核苷酸序列、氨基酸序列、引物、探針、抗體、試劑盒等能夠準確檢測是否發(fā)生該突變,從而診斷待測個體是否患有腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良病或預(yù)測待測個體的患病風險。
圖1是正常AB⑶I基因第652-665位核苷酸的測序峰圖;圖2是母親AB⑶I基因(雜合子)的第652-665位核苷酸的測序峰圖;圖3是父親AB⑶I基因(正常半合子)的第652-665位核苷酸的測序峰圖;圖4是病患AB⑶I基因(突變半合子)的第652-665位核苷酸的測序峰圖;圖5a和5b是母親AB⑶I基因(雜合子)的兩條染色體的第652-665位核苷酸測序峰圖,圖5a是突變半合子,圖5b是正常半合子;圖6是目標堿基擴增片段電泳圖;圖7是兔抗A肽、B肽和C肽的多克隆抗體的純化結(jié)果圖,其中M為分子標記;圖8是抗體檢測試紙條及檢測結(jié)果圖;圖9是抗體芯片及檢測結(jié)果圖;圖1Oa-1Oc是MLPA檢測結(jié)果圖;其中,圖1Oa是正常人(父親)的MLPA結(jié)果圖,圖1Ob是攜帶者(母親)的MLPA結(jié)果圖,圖1Oc是患者(病患)的MLPA結(jié)果圖;圖11是基因芯片檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式先結(jié)合具體實施例說明本發(fā)明。若無特別說明,實施例中使用的試劑和儀器均為市售產(chǎn)品。一些具體的試劑和儀器如下所示:試劑:DNA 提取試劑盒(Tiangen,DP304_02);感受態(tài)細胞(Takara,DH5 a , D9057A);pGEM T 載體(Takara, D101A);引物(Invitrogen 合成);dNTP (Fermentas, EP0192) ;Taq 酶(Fermentas, EP0402);瓊脂糖(Klontech);氨節(jié)青霉素(Klontech) ;T4 連接酶(TaKaRa);DNA純化試劑盒(Tiangen,DP214-03);質(zhì)粒提取試劑盒(Tiangen,DP103-03);胰化蛋白胨(0X0ID, LP0042);酵母提取物(0X0ID,LP0021)。儀器: 生物安全柜(BioBase);水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司,DS-S24);NanoDrop 紫外分光光度計(Thermo, ND2000) ;PCR 儀(ABI9700);測序儀(ABI3500);搖床(Thermo, MAXQ4000) ;NaCl (國藥,10019318)。培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基:胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCllOg,調(diào)pH至7.0后,用去離子水定容到IOOOml。LB培養(yǎng)平板:胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCllOgJl^ 15g,調(diào)pH至7.0后,用去離子水定容至Ij IOOOml0以下實施例中受試的個體是病患及其父母雙親。平行地對三個受試個體進行檢測分析。實施例1:取血利用真空采血針從待測個體的靜脈取血,并立即將真空采血針的另一端插入EDTA抗凝的采血管中,收集血樣。將采血管上下輕輕顛倒混勻5-10次,切勿用力振搖,用于下一步檢測。實施例2:提取DNAI)將血樣加入至標本管中,用振蕩器振蕩,振蕩速率為1800/min下點三次,使全血混勻。2)向離心管中加入20iiL蛋白酶K、200iiL血樣、200iiL緩沖液GB,蓋緊蓋子,振蕩速率為2200/min,充分混勻;70°C水浴lOmin,自然冷卻至室溫;簡短離心(達到5 X IOOOrpm)去除管蓋內(nèi)壁的水珠。3)加入200 ii L無水乙醇,充分振蕩,振蕩速率為2500_3000/min,點三下,簡短離
心去除管蓋內(nèi)壁上水珠。4)將溶液加入到對應(yīng)的一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中,吸附柱柱蓋上標注流水號),8000rpm離心60s,將吸附柱CB3放入新收集管中,棄廢液及原收集管。5)向吸附柱中加入500 u L緩沖液⑶(使用前檢查是否已加入無水乙醇),8000rpm離心60s,將吸附柱CB3放入新收集管中,棄廢液及原收集管。6)向吸附柱中加入600 ii L漂洗液PW(使用前檢查時候已加入無水乙醇),12000rpm離心3min,將吸附柱CB3放入去蓋的離心管中,棄廢液及原收集管,吸附柱開蓋并置于室溫下5-10分鐘,晾干殘余的漂洗液。7)向吸附柱中間位置懸空滴加200 ii L洗脫緩沖液TE,蓋上蓋。室溫放置2_5min,IOOOOrpm離心60s,將溶液收集到離心管中。8)測定DNA濃度,同時記錄0D26(l/0D28(l的比值。實施例3 =PCR擴增反應(yīng)利用提取的DNA作為模板,擴增包含AB⑶I基因的編碼序列第657、658位核苷酸的片段。反應(yīng)物及試劑:
PCR Master Mix2 (自制,含 Mg2+、Taq 酶、dNTP 等)|20y L
權(quán)利要求
1.一種AB⑶I基因突變體,其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
2.—種AB⑶I基因突變體片段,包含SEQ ID N0.3中的至少10個連續(xù)核苷酸,并且所述至少10個連續(xù)核苷酸包含SEQ ID N0.3的第656、657、658位核苷酸;或者是其反向互補序列。
3.根據(jù)權(quán)利2所述的基因突變體片段,其特征在于,所述基因突變體片段用作檢測SEQ ID N0.3的第657、658位核苷酸的探針;優(yōu)選地,所述基因突變體片段是5, -AGCCACTTGGACGT-3,。
4.用于擴增SEQID N0.3所示序列的第657、658位核苷酸的引物;優(yōu)選地,所述引物是: 上游引物:ABCD1-F:5’ -CCACGCCTACCGCCTCTACTT-3’ ; 下游引物:ABCD1-R:5,-AGACTGTCCCCACCGCTC-3,。
5.一種多肽,其氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
6.一種多肽片段,包括SEQ ID N0.4的第220位至第298位中的至少10個連續(xù)氨基酸;優(yōu)選地,所述多肽片段的氨基酸序列是PGRGCDFLHPASGGP。
7.一種抗權(quán)利要求5所述的多肽或權(quán)利要求6所述的多肽片段的抗體。
8.一種試劑盒,包括檢測SEQ ID N0.3所示序列的第657、658位核苷酸或檢測SEQ IDN0.4的多肽的試劑,其中,檢測SEQ ID N0.3所示序列的第657、658位核苷酸的試劑包括權(quán)利要求3所述的基因突變體片段或權(quán)利要求4所述的引物,檢測SEQ ID N0.4的多肽的試劑包括權(quán)利要求7所述的抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒,其特征在于,所述檢測SEQID N0.3的第657、658位核苷酸的試劑是探針,所述探針序列為: 對照組:5’ -AGCCACTCCTGGACGT-3’ ; 突變組:5’ -AGCCACTTGGACGT-3’ ;或者 正向:5,-CTGACCAAGCCACT-3’ ;反向:5’ -GTCACAGCCACGTCCA-3,。
10.權(quán)利要求3的基因突變體片段、權(quán)利要求4所述的引物或權(quán)利要求7所述的抗體在制備檢測ABCDl基因突變體的試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥相關(guān)的基因突變、檢測該突變所使用的引物、探針、抗體和試劑盒。本發(fā)明為檢測腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥提供了一種新的方式。
文檔編號C12N15/12GK103146707SQ20131004971
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月7日
發(fā)明者陳子江, 高媛, 高選, 黃色新, 曹永芝, 王謝桐 申請人:國家輔助生殖與優(yōu)生工程技術(shù)研究中心