專利名稱：一種定向誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種定向誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的方法。
背景技術(shù)：
在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)不僅可以分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌 肉細(xì)胞等中胚層間質(zhì)組織細(xì)胞，還可跨越胚層界限，分化為外胚層的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)胚層的肝細(xì)胞等。所以近年來MSCs成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)組織器官損傷修復(fù)以及再生領(lǐng)域研究的熱點。而實現(xiàn)MSCs向表皮細(xì)胞的分化是利用其構(gòu)建組織工程皮膚的關(guān)鍵步驟之一。MSCs分化的程序是可能存在于其生存的微環(huán)境中的指導(dǎo)信號，通過相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，啟動并強(qiáng)化關(guān)鍵基因表達(dá)，實現(xiàn)細(xì)胞分化。其實質(zhì)就是MSCs的基因在時空上特異性表達(dá)，合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，從而細(xì)胞在生化、結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)生改變，細(xì)胞表型隨之差異表現(xiàn)。指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子及啟動基因表達(dá)的信號可能存在于MSCs生存的微環(huán)境中，研究表明，微環(huán)境中的各種因子表現(xiàn)類型、濃度和應(yīng)用次序則是影響MSCs分化的重要因素。細(xì)胞局部的微環(huán)境包括細(xì)胞周圍多種細(xì)胞因子、激素、基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix, ECM)等，細(xì)胞因子的作用尤為重要，不同的細(xì)胞因子作用下MSCs可分化為不同的細(xì)胞類型。除了可溶性細(xì)胞信號分子外，直接的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用對于干細(xì)胞的分化也是必要的。Rangappa等利用接觸培養(yǎng)和條件培養(yǎng)兩種方法培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和心肌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)組用CMFDA標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)肌球蛋白重鏈、β-actin和cTnT，而條件培養(yǎng)組只有β-actin表達(dá)。體內(nèi)外實驗均顯示，MSCs與其他細(xì)胞(蒲肯野細(xì)胞、心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞等)共培養(yǎng)時有自發(fā)的細(xì)胞融合，且MSCs在沒有誘導(dǎo)劑的情況下分化成其他細(xì)胞，提示細(xì)胞融合可能是促使MSCs分化的原因之一。MSCs的分化與其生長的微環(huán)境有密切關(guān)系，因此，體外誘導(dǎo)MSCs分化是通過采取不同的方法模擬體內(nèi)相應(yīng)組織細(xì)胞生長的真實環(huán)境和必要條件。利用目標(biāo)細(xì)胞參與進(jìn)行共培養(yǎng)誘導(dǎo)的方法往往比較簡便易行。直接接觸式共培養(yǎng)利用MSCs與其他細(xì)胞共培養(yǎng)時有自發(fā)的細(xì)胞融合，或細(xì)胞的自分泌與旁分泌必要的細(xì)胞因子，MSCs在沒有誘導(dǎo)劑的情況下分化成其他細(xì)胞。但這種誘導(dǎo)方法存在兩種細(xì)胞的分離比較困難的最大缺點，為后續(xù)的鑒定或應(yīng)用帶來障礙。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種定向誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的方法。本發(fā)明提供了一種定向誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的方法，包括如下步驟:將離體的誘導(dǎo)細(xì)胞接種并吸附于聚碳酸酯膜的下表面，將離體的間充質(zhì)干細(xì)胞接種至所述聚碳酸酯膜的上表面，然后將所述誘導(dǎo)細(xì)胞和所述間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，促使所述間充質(zhì)干細(xì)胞分化為目標(biāo)細(xì)胞；所述間充質(zhì)干細(xì)胞和所述誘導(dǎo)細(xì)胞均不能通過所述聚碳酸酯膜的孔徑。所述目標(biāo)細(xì)胞為非胚胎干細(xì)胞。所述誘導(dǎo)細(xì)胞可為表皮干細(xì)胞，具體可為人表皮干細(xì)胞。所述目標(biāo)細(xì)胞可為表皮干細(xì)胞，具體可為人表皮干細(xì)胞。所述間充質(zhì)干細(xì)胞可為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，具體可為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。所述聚碳酸酯膜的孔徑可為0.2 μ m-2.0 μ m，優(yōu)選為0.4_1.0 μ m，更加優(yōu)選為
0.4 μ m $ 1.0 μ m。所述共培養(yǎng)具體可在細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔和放置于所述培養(yǎng)孔上的Transwell小室中進(jìn)行。所述共培養(yǎng)時，所述誘導(dǎo)細(xì)胞的培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔進(jìn)行。所述間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)在Transwell小室中進(jìn)行。所述聚碳酸酯膜可以阻斷細(xì)胞通過，所述誘導(dǎo)細(xì)胞分泌的誘導(dǎo)因子通過所述聚碳酸酯膜后誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為具有所述誘導(dǎo)細(xì)胞屬性的目標(biāo)細(xì)胞。所述表皮干細(xì)胞表現(xiàn)為表達(dá)P63、CK19和β 1-1ntegrin的細(xì)胞。P63、CK19和β 1-1ntegrin是三種早期表 皮細(xì)胞的標(biāo)志物，P63經(jīng)常用來鑒定表皮干細(xì)胞，而CK19和β Ι-1ntegrin是表皮干細(xì)胞相對特異的標(biāo)志物。缺乏β l-1ntegrin會顯著影響體外角質(zhì)細(xì)胞的分化，而持續(xù)表達(dá)的β l-1ntegrin對于維持表皮干細(xì)胞的特性是重要的。近年來利用Transwell技術(shù)通過共培養(yǎng)對間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行非直接接觸式共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化越來越多的得到應(yīng)用，通常是將間充質(zhì)干細(xì)胞與誘導(dǎo)細(xì)胞分別接種于Transwell上下室之中，通過誘導(dǎo)細(xì)胞生長為間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)造適宜分化的微環(huán)境，通過旁分泌等方式誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生分化以及表型的轉(zhuǎn)變。而間充質(zhì)干細(xì)胞與誘導(dǎo)細(xì)胞不直接接觸是Transwell技術(shù)的特點之一,能夠使得誘導(dǎo)后的細(xì)胞成分相對單一，避免了分選、純化或標(biāo)記等繁瑣步驟，為方便誘導(dǎo)后細(xì)胞的鑒定及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明中先通過對UCMSCs在不同孔徑常用Transwell插件聚碳酸酯膜生長以及遷移情況進(jìn)行觀察，確定0.4 μ m的孔徑和1.0 μ m的孔徑可以阻斷細(xì)胞遷移，為進(jìn)一步采用合適孔徑的聚碳酸酯膜正反兩面培養(yǎng)細(xì)胞提供前期實驗準(zhǔn)備。根據(jù)上述實驗結(jié)果，本發(fā)明建立了預(yù)培養(yǎng)目標(biāo)細(xì)胞的新型間接接觸式共培養(yǎng)方法，將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與表皮干細(xì)胞于聚碳酸酯膜正反兩面進(jìn)行共培養(yǎng)，提供了雙層ESCs生長的環(huán)境，尤其是膜底面的hESCs能夠近距離的提供穩(wěn)定的局部微環(huán)境，并不排除UCMSCs與ESCs通過聚碳酸酯膜微孔有直接接觸，掃描電鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞偽足能夠探入微孔，大大提高了誘導(dǎo)效率，而同時，聚碳酸酯膜物理性地隔開了兩種細(xì)胞。使用這種系統(tǒng)誘導(dǎo)UCMSCs分化并不需要將干細(xì)胞與目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行混合，也不需要特定的誘導(dǎo)液。而這種隔離能夠簡化鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞的步驟。UCMSCs能夠在本發(fā)明提供的新型的非直接接觸式共培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)誘導(dǎo)分化為表皮樣細(xì)胞。本發(fā)明為新型非直接接觸式共培養(yǎng)在UCMSCs分化為表皮樣細(xì)胞中的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。同樣，該共培養(yǎng)系統(tǒng)也可應(yīng)用于其它類型細(xì)胞的分化研究，在基礎(chǔ)課題以及臨床研究中具有潛在的重要價值。而UCMSCs向表皮細(xì)胞的分化在未來能夠為臨床皮膚再生的研究的進(jìn)展起到有益作用。本發(fā)明為增加MSCs多向分化的誘導(dǎo)方法開拓思路，為進(jìn)一步采用UCMSCs為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚提供依據(jù)。


圖1為實施例1中掃描電鏡下UCMSCs在不同孔徑聚碳酸酯膜的生長、遷移情況(X1500)。圖2為實施例2中的分組處理的流程示意圖。圖3為實施例2中掃描電鏡觀察的照片。圖4為實施例2中相差顯微鏡觀察的照片。圖5為實施例2中免疫熒光檢測的結(jié)果。圖6為實施例2中Western Blotting圖譜。圖7為實施例2中實時定量PCR檢測結(jié)果。圖8為實施例2中流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。實施例中，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以X ± S表示，采用單因素方差分析比較，以P < 0.01為統(tǒng)計學(xué)差異有顯著意義。β I整合素(β 1-1ntegrin)、角蛋白19 (CK19)和P63均為表皮干細(xì)胞的主要標(biāo)志物。人表皮干細(xì)胞(Epidermal Stem Cells, ESCs):楊亞東，伍津津，朱堂友，畢建軍，表皮干細(xì)胞的分選鑒定及培養(yǎng)，重慶醫(yī)學(xué)2008年2月第37卷第3期，275-281 ;馬英智，王心蕊，何旭，牛云，李玉林，人表皮干細(xì)胞的分離、純化培養(yǎng)及鑒定，中國實驗診斷學(xué)2009年 2 月第 13 卷第 2 期，143-145 ；Zeng Yuan-linl, Xin Guo-hual, Qiu Ze-liang2, In vitroisolation and culture of human epidermal stemCells,中國組織工程研究與臨床康復(fù)第 12 卷第 43 期 2008 - 10 - 21 出版，8597-8600。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSCs，臍帶MSCs):侯克東盧世璧張莉袁玫孫明學(xué)彭江趙斌眭翔許文靜，人臍帶Wharton膠中間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定，解放軍醫(yī)學(xué)雜志2008年4月第33卷第4期，375-378。Dispease酶:Gibco (美國)。HKGS (人角質(zhì)化細(xì)胞培養(yǎng)因子):Gibco (美國)。Trypsin-EDTA:Gibco (美國)。人胎盤IV型膠原:Sigma (美國)。青霉素_鏈霉素:PAA (德國)。兩性霉素B:PAA (德國)。TE =Gibco (美國)。DTI =Gibco (美國)。Eplife培養(yǎng)基:Gibco (美國)。DMEM 培養(yǎng)基:Gibco (美國)。DMSO:Amresco (美國)。絲裂霉素 C:Roche (美國)。FBS =Gibco (美國)。針對CK19的一抗為兔抗人CK19單克隆抗體:Abcam (美國)。針對P63的一抗為兔抗人P63單克隆抗體:Abcam(美國)。針對β 1-1ntegrin的一抗為鼠抗人β 1-1ntegrin單克隆抗體:Abcam (美國)。FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG:Abcam (美國)。PE標(biāo)記的羊抗兔IgG:Abcam (美國)。鼠抗人GAPDH單克隆抗體:北京中杉金橋。HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG:北京中杉金橋。HRP標(biāo)記羊抗兔IgG:北京中杉金橋。間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基:含100U/ml青霉素、0.lmg/ml鏈霉素和2.5 μ g/ml兩性霉素B的DMEM/F12培養(yǎng)基。表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基:含100U/ml青霉素、0.lmg/ml鏈霉素和2.5 μ g/ml兩性霉素B的Eplife培養(yǎng)基。
PBS 緩沖液(ρΗ7.4):NaC18.0g、KC10.2g、Na2HPO4L 44g、KH2PO40.24g、蒸餾水定容至 1000ml，用 Na2HPO4 或 KH2PO4 調(diào)節(jié) pH 至 7.4。實施例1、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在不同孔徑聚碳酸酯膜的生長及遷移一、分組處理1、將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞用含10mg/L絲裂霉素C的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基處理3h，然后用間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞并懸浮細(xì)胞。2、分組處理:第一組:將6個TranswelI小室(底部的聚碳酸酯膜的直徑為24mm、孔徑為
0.4 μ m、厚度為10 μ m)放置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上；第二組:將6個TranswelI小室(底部的聚碳酸酯膜的直徑為24mm、孔徑為
1.0 μ m、厚度為10 μ m)放置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上；第三組:將6個TranswelI小室(底部的聚碳酸酯膜的直徑為24mm、孔徑為
3.0 μ m、厚度為10 μ m)放置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上；第四組:將6個TranswelI小室(底部的聚碳酸酯膜的直徑為24mm、孔徑為
8.0 μ m、厚度為10 μ m)放置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。3、將步驟I得到的細(xì)胞接種于步驟2得到的細(xì)胞培養(yǎng)板上的Transwell小室中，每個小室接種1.5X IO5個細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后，在Transwell小室中加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，在Transwell小室下的培養(yǎng)孔中加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7天，每天將Transwell小室和培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基。二、統(tǒng)計細(xì)胞遷移率完成步驟一后在相差顯微鏡下觀察、計數(shù)遷移至膜底面的細(xì)胞數(shù)，高倍鏡(X400)下視野直徑為560 μ m，隨機(jī)選取6個視野計數(shù)。重復(fù)實驗3次，計算每個視野下平均細(xì)胞數(shù)。根據(jù)視野面積與聚碳酸酯膜面積的比率，計算不同孔徑聚碳酸酯膜背面(朝向培養(yǎng)孔的面)上UCMSCs的總數(shù)，并根據(jù)計算遷移率。
權(quán)利要求
1.一種定向誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的方法，包括如下步驟:將離體的誘導(dǎo)細(xì)胞接種并吸附于聚碳酸酯膜的下表面，將離體的間充質(zhì)干細(xì)胞接種至所述聚碳酸酯膜的上表面，然后將所述誘導(dǎo)細(xì)胞和所述間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，促使所述間充質(zhì)干細(xì)胞分化為目標(biāo)細(xì)胞；所述間充質(zhì)干細(xì)胞和所述誘導(dǎo)細(xì)胞均不能通過所述聚碳酸酯膜的孔徑。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述誘導(dǎo)細(xì)胞為表皮干細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述誘導(dǎo)細(xì)胞為人表皮干細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述目標(biāo)細(xì)胞為表皮干細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述目標(biāo)細(xì)胞為人表皮干細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述間充質(zhì)干細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于:所述聚碳酸酯膜的孔徑為0.2 μ m-2.0 μ m,優(yōu)選為 0.4-1.0 μ m,更加優(yōu)選為 0.4 μ m 或 1.0 μ m。
9.如權(quán)利要求1至 8中任一所述的方法，其特征在于:所述共培養(yǎng)是在細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔和放置于所述培養(yǎng)孔上的Transwell小室中進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定向誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的方法。本發(fā)明提供的定向誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的方法，包括如下步驟將離體的誘導(dǎo)細(xì)胞接種并吸附于聚碳酸酯膜的下表面，將離體的間充質(zhì)干細(xì)胞接種至所述聚碳酸酯膜的上表面，然后將所述誘導(dǎo)細(xì)胞和所述間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，促使所述間充質(zhì)干細(xì)胞分化為目標(biāo)細(xì)胞；所述間充質(zhì)干細(xì)胞和所述誘導(dǎo)細(xì)胞均不能通過所述聚碳酸酯膜的孔徑。UCMSCs向表皮細(xì)胞的分化在未來能夠為臨床皮膚再生的研究的進(jìn)展起到有益作用。本發(fā)明為增加MSCs多向分化的誘導(dǎo)方法開拓思路，為進(jìn)一步采用UCMSCs為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚提供依據(jù)。
文檔編號C12N5/074GK103146642SQ20131004941
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月7日
發(fā)明者柴家科, 李東杰, 申傳安, 孫天駿 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院