專利名稱：一種生物活性多肽slpq 及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白領(lǐng)域，具體涉及一種乳源性生物活性多肽SLPQ及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在牛乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的過程中，牛乳中的一部分蛋白質(zhì)被乳酸菌代謝利用，并發(fā)生了一系列生理生化反應(yīng)，使蛋白質(zhì)變?yōu)槎嚯幕蛘哂坞x的氨基酸，被人體消化吸收或通過小腸上皮細(xì)胞的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)直接進(jìn)入人體的血液循環(huán)。在這些多肽中，有一部分具有特殊的生理功能，被稱為“生物活性肽”。免疫活性肽是繼阿片肽發(fā)現(xiàn)后首次從乳中獲得并證明其生理活性的一類生物活性多肽。1981年Jolles等人首次發(fā)現(xiàn)，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一個(gè)氨基酸序列為Val-Glu-Pro-1le-Pro-Tyr的六肽，體外實(shí)驗(yàn)證明該肽能夠增強(qiáng)小鼠腹腔巨曬細(xì)胞對(duì)綿羊紅細(xì)胞的吞曬作用。Migliore-Samour等人發(fā)現(xiàn)來自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能夠刺激綿羊血紅細(xì)胞對(duì)小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的吞噬作用以及增強(qiáng)對(duì)于肺炎克雷伯菌的抵抗。李素萍等人用合成的乳源免疫調(diào)節(jié)肽(PGPIPN)飼喂大鼠發(fā)現(xiàn)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬作用和紅細(xì)胞相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)功能有顯著的增強(qiáng)。研究表 明，免疫活性肽不僅能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，刺激機(jī)體淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放、提高機(jī)體抵御外界病原體感染的能力，降低機(jī)體發(fā)病率，而且不會(huì)引起機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)。免疫活性肽無論是作為功能食品還是藥品，其最終都要攝入人體內(nèi)被人體吸收，只有到達(dá)相應(yīng)的靶器官才能發(fā)揮其生理功能。在人體胃腸道復(fù)雜的環(huán)境下，肽極容易受到胃蛋白酶、胰蛋白酶等一系列酶的影響而發(fā)生降解，從而在體內(nèi)失去生理活性，無法達(dá)到預(yù)期目的。因此，研究免疫調(diào)節(jié)肽的抗胃腸道酶降解的能力對(duì)于其今后的應(yīng)用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生物活性多肽，其氨基酸序列為Ser-Leu-Pro-Gln(SLPQ, SEQ ID NO:1)。較優(yōu)的，所述生物活性多肽的來源為乳源性。本發(fā)明的生物活性多肽SLPQ為乳源性，具體來源于￠-酪蛋白，并且為￠-酪蛋白(SEQ IDNO: 3)第84 87位的氨基酸殘基。較優(yōu)的，所述生物活性多肽具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功能。本發(fā)明的生物活性多肽可以通過基因工程的方法和化學(xué)方法人工合成，也可以從乳制品中通過分離純化的方法直接獲得。本發(fā)明還公開了編碼前述生物活性多肽的核苷酸片段?！?酪蛋白的氨基酸序列以及核苷酸序列為既有技術(shù)，編碼￠-酪蛋白第84 87位氨基酸殘基的核苷酸片段能編碼成熟的生物活性多肽SLPQ。進(jìn)一步的,編碼前述生物活性多肽的核苷酸片段,其序列為:agc ctc cca cag(SEQIDN0:2)。本發(fā)明第二方面公開了前述生物活性多肽的制備方法，步驟如下:I)發(fā)酵:將瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)添加到脫脂乳中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，獲得瑞士乳桿菌發(fā)酵乳；2)多肽的粗提:對(duì)步驟I)的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳進(jìn)行低溫離心分離，取上清液；3)多肽的純化:a.對(duì)步驟2)的上清液進(jìn)行超濾處理，收集濾液；b.收集的濾液采用反向?qū)游鲋鵖0URSE5RPC ST (4.6X 150mm)進(jìn)行反相高效液相色譜分離，收集洗脫時(shí)間 為21min的多肽混合物；c.采用超高效液相-電噴霧-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)儀分離獲得多肽SLPQ。本發(fā)明所述脫脂乳為經(jīng)過脫脂處理的乳制品，通常脫脂乳中脂肪含量小于0.1%。較優(yōu)的，步驟I)所述厭氧發(fā)酵的條件為:發(fā)酵溫度36 38°C，發(fā)酵培養(yǎng)15 20h ；優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)19h。較優(yōu)的，步驟2)所述低溫離心的條件為:4°C,8000 IOOOOrpm,離心15 30min。較優(yōu)的，步驟3) a所述超濾法所采用的濾膜的截留分子量分別為IOkDa和3kDa。本發(fā)明采用截留分子量分別為10kDa、3kDa的濾膜，使樣品依次通過兩張濾膜進(jìn)行超濾。更優(yōu)的，步驟3)a所述超濾過程中，壓力范圍為0.1 0.3MPa，濾液流速為0.8 1.2mL/min。較優(yōu)的，步驟3 ) b反相高效液相色譜分離法中，流動(dòng)相A為含有2%乙腈和0.05%TFA的ddH20 ;流動(dòng)相B為100%乙腈。本發(fā)明生物活性多肽SLPQ的分子量為444.24Da。本發(fā)明第三方面公開了前述生物活性多肽在制備增強(qiáng)機(jī)體免疫力的食品、保健品及藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還公開了編碼前述生物活性多肽的核苷酸片段在制備增強(qiáng)機(jī)體免疫力的食品、保健品及藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的生物活性多肽SLPQ可以用于酸奶等乳制品食品，并且由于本發(fā)明的生物活性多肽SLPQ能夠通過胃腸道直接吸收不被降解，因此可以用于制備提高免疫力的保健品，或者增強(qiáng)機(jī)體免疫力的藥物。編碼所述生物活性多肽SLPQ的核苷酸片段由于可以用于制備SLPQ，因此，也可以用于制備食品、提高免疫力的保健品，或者增強(qiáng)機(jī)體免疫力的藥物。本發(fā)明第四方面公開了一種增強(qiáng)機(jī)體免疫力藥物，包含前述生物活性多肽SLPQ或前述生物活性多肽SLPQ的衍生物。所述多肽的衍生物，是指在多肽的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)上、氨基端或羧基端進(jìn)行羥基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙?；?、磷酸化、酯化或糖基化等修飾，得到的多肽衍生物。本發(fā)明的生物活性多肽SLPQ能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的體外增殖能力，促進(jìn)巨噬細(xì)胞一氧化氮誘生量增加，提高機(jī)體抵御外界病原體感染的能力，降低機(jī)體發(fā)病率，而且不會(huì)引起機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，對(duì)開發(fā)具有增強(qiáng)免疫功能的乳制品和保健品具有十分重要的意義。


圖1:瑞士乳桿菌發(fā)酵乳與未經(jīng)發(fā)酵處理的脫脂乳超濾后粗提物的質(zhì)譜對(duì)比圖(A:3000Da未經(jīng)發(fā)酵的脫脂乳粗提物質(zhì)譜圖，B:3000Da瑞士乳桿菌發(fā)酵乳粗提物質(zhì)譜圖)圖2:3000Da未經(jīng)發(fā)酵脫脂乳粗提物與3000Da瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂乳粗提物分子
量差異及豐度比較圖3:反相高效液相色譜分離對(duì)照發(fā)酵乳和瑞士乳桿菌發(fā)酵乳中生物活性多肽比較圖(a曲線:對(duì)照發(fā)酵乳反相高效液相色譜215nm的洗脫圖譜；b曲線:瑞士乳桿菌發(fā)酵乳3000Da上清液反相高效液相色譜215nm的洗脫圖譜)圖4:B峰的一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜原始5:經(jīng)過Masslynx軟件處理過的B峰的二級(jí)質(zhì)譜圖(m/z=444)圖6:B峰小肽的氨基酸序列以及az，by斷裂情況圖7:生物活性多肽SLPQ經(jīng)過消化酶處理前后的總離子流8:生物活性多肽SLPQ經(jīng)過胃蛋白酶-胰酶處理所得444.24前峰的一級(jí)質(zhì)譜圖 圖9:生物活性多肽SLPQ經(jīng)過胃蛋白酶-胰酶處理所得444.24后峰的一級(jí)質(zhì)譜圖
具體實(shí)施例方式在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式
之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Samtoook等 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold SpringHarborLaboratory Press,1989and Third edition,2001 ；Ausubel 等，CURRENTPR0T0C0LS INMOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons, New York,1987andperiodic updates ；the seriesMETHODS IN ENZYM0L0GY, Academic Press, SanDiego ；ffolffe, CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION, Third edition, AcademicPress, San Diego, 1998 ；METH0DS IN ENZYM0L0GY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.ffolffe,eds.),Academic Press, San Diego,1999 ;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119, Chromatin Protocols (P.B.Becker,ed.)Humana Press, Totowa, 1999 等。實(shí)施例1活性肽的制備
一、發(fā)酵乳的制備I)瑞士乳桿菌發(fā)酵乳采用脫脂奶粉(新西蘭NZMP牌脫脂奶粉)與水配置12wt%的脫脂乳(12g脫脂奶粉加入到88g水中，下同)。在無菌條件下，挑取瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus,CICC6024)菌落三環(huán)，將其加入已滅菌的12wt%的脫脂乳中，攪拌均勻。接種完成后，用鋁箔封口，以防止污染。置于培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)19小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將凝乳攪拌均勻，即完成瑞士乳桿菌的活化，制得用于制備瑞士乳桿菌發(fā)酵乳的發(fā)酵劑。取IOmL已制備的瑞士乳桿菌發(fā)酵劑接種到500mL已滅菌的12% (v/v)脫脂乳中(接種率為2v/v%)，37°C發(fā)酵19小時(shí)后，攪開凝乳后，在4°C條件下保存，得到瑞士乳桿菌發(fā)酵乳。2)對(duì)照發(fā)酵乳采用同樣方法，使用保加利亞乳桿菌(Lactobacillus Bulgaricus,LB340)和嗜熱鏈球茵(Streptococcus Thermophilus, TA40)作為發(fā)酵菌種制作對(duì)照發(fā)酵乳。具體方法為:在無菌條件下，分別挑取保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球茵菌落三環(huán)，將其分別加入已滅菌的12% (w/w)的脫脂乳中，攪拌均勻。接種完成后，用鋁箔封口，以防止污染。置于培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)19h。培養(yǎng)結(jié)束后，將凝乳攪拌均勻，即完成保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球茵的活化，制得用于制備對(duì)照發(fā)酵乳的兩種發(fā)酵劑。取5mL已制備的保加利亞乳桿菌發(fā)酵劑和5mL嗜熱鏈球菌發(fā)酵劑，共同接種到500mL已滅菌的12%脫脂乳中(接種率為2v/v%)，37°C發(fā)酵19h后，攪開凝乳后，在4°C條件下保存，得到對(duì)照發(fā)酵乳。
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二、生物活性多肽的確認(rèn)1.實(shí)驗(yàn)方法I)樣品處理分別將前一步驟制備的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳和對(duì)照發(fā)酵乳，以及12wt%的脫脂乳裝入離心管中進(jìn)行低溫離心，離心條件為9000rpm/min，4°C，20min。離心后棄沉淀，取上清液。將上清液分別倒入超濾杯中，為了防止生物活性多肽氧化，打開氮?dú)夤迚毫﹂y充氮，同時(shí)打開磁力攪拌裝置，以防止溶液出現(xiàn)濃差極化現(xiàn)象。使樣品分別通過截留分子量為IOkDa、3kDa的濾膜，待有濾液流出時(shí)進(jìn)行收集。超濾過程中，應(yīng)保持流速穩(wěn)定，濾液清澈。流速控制在lmL/min左右，壓力為0.1 0.3MPa，分別收集瑞士乳桿菌發(fā)酵乳、對(duì)照發(fā)酵乳，以及未發(fā)酵的12wt%脫脂乳的濾液作為實(shí)驗(yàn)樣、對(duì)照樣以及空白對(duì)照，于-4V冷凍保存。2)質(zhì)譜分析將前一步驟收集的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳超濾后的濾液(實(shí)驗(yàn)樣)和脫脂乳超濾后的濾液(空白對(duì)照)進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜條件如下:離子方式:ES+質(zhì)量范圍(m/z):100-1500毛細(xì)管電壓(Capillary)(kV):3.0采樣錐(V):35.0離子源溫度(°C)):100
去溶劑溫度CC):350去溶劑氣流(L/hr):600.0碰撞能量(eV):6.0掃描時(shí)間(sec):0.3內(nèi)掃描時(shí)間(sec):0.022.實(shí)驗(yàn)結(jié)果瑞士乳桿菌發(fā)酵乳超濾后的濾液(實(shí)驗(yàn)樣)和脫脂乳超濾后的濾液(空白對(duì)照)的質(zhì)譜對(duì)比結(jié)果見圖1 2。圖1中的A曲線為3000Da未經(jīng)發(fā)酵的脫脂乳(空白對(duì)照)粗提物樣品，圖1中的B曲線為3000Da瑞士乳桿菌發(fā)酵乳粗提物樣品(實(shí)驗(yàn)樣)。經(jīng)過比較可以看出，經(jīng)過瑞士乳桿菌發(fā)酵后，3000Da未經(jīng)發(fā)酵乳粗提物和3000Da瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂乳粗提物的組分上發(fā)生很大變化，且這些組分由于疏水性不同保留時(shí)間亦有所差異。此質(zhì)譜質(zhì)量范圍為100Da-1500Da，因此可知脫脂乳在1500Da以下、210nm處有吸收的小分子物質(zhì)相對(duì)較少；而經(jīng)過瑞士乳桿菌發(fā)酵后，在這一分子量范圍內(nèi)的物質(zhì)明顯增多，說明了這些多肽并不存在于未經(jīng)發(fā)酵處理的脫脂乳中，而是經(jīng)瑞士乳桿菌發(fā)酵后才產(chǎn)生的。而且我們發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，多肽的豐度明顯增多，進(jìn)一步證實(shí)了通過瑞士乳桿菌的發(fā)酵，脫脂乳中原有的大分子蛋白被分解，從單一的大分子蛋白變?yōu)榱慷嗲覐?fù)雜的小分子多肽。圖2是3000Da未經(jīng)發(fā)酵脫脂乳(空白對(duì)照)粗提物與3000Da瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂乳(實(shí)驗(yàn)樣)粗提物不 同分子量物質(zhì)豐度差異的比較結(jié)果?？v向軸表明在脫脂乳粗提物中所含物質(zhì)對(duì)應(yīng)的分子量，橫向軸表明發(fā)酵乳粗提物中所含物質(zhì)對(duì)應(yīng)的分子量。通過比較，可以得到瑞士乳桿菌發(fā)酵乳和未經(jīng)發(fā)酵脫脂乳中，因?yàn)榘l(fā)酵所帶來的差異較大的物質(zhì)的分子量，從而選擇這些質(zhì)荷比的母離子通過二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行進(jìn)一步的分析。如圖1所示，分子量397.07Da，保留時(shí)間6.72分鐘的物質(zhì)在脫脂乳粗提物中含量較高(圖1-A圖譜中的峰)，而對(duì)照發(fā)酵乳中幾乎沒有。而分子量為232.lOTa，保留時(shí)間為
3.61min的物質(zhì)在發(fā)酵乳和脫脂乳中的含量均比較高。因此，我們選擇了在發(fā)酵乳中含量較高而在未經(jīng)發(fā)酵的脫脂乳中含量較低的組分進(jìn)行了差異比較，比較結(jié)果見表I。根據(jù)MarkerLynx Marker軟件分析,得到具有顯著性差異的(p>0.05)分子量片段如表I所示，根據(jù)豐度和質(zhì)荷比情況，選擇444.24Da，保留時(shí)間為16.20min的多肽進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜的測(cè)序分析。表1:3000Da發(fā)酵乳粗提物與3000Da脫脂乳粗提物差異比較
'~WTKi ,, n 3000Da脫)猶乳Il〖提物3000Da發(fā)酵乳組提物
(Pa)_.歲 ^ _ ~_(unit)_(unit)_
504.23020.0779037.23±2.78三、生物活性多肽的高效液相法分離提純1.實(shí)驗(yàn)儀器和試劑
儀器:tKTA蛋白純化儀purifier 10色譜柱規(guī)格:S0URSE5RPCST4.6/150流速:lmL/min溫度:25°C紫外檢測(cè)波長:215nm流動(dòng)相A:含有2%乙腈和0.05%TFA的ddH20流動(dòng)相B: 100%乙腈進(jìn)樣量:ImL梯度條件:0min-7.5min 保持 100%A 液；7.5min-42.5minB 液從 0% 變?yōu)?50% ；42.5min-45minB 液從 50% 變?yōu)?100% ；45min-50min 保持 100%B 液；50min-72minA 液從 0% 變?yōu)?100%o2.實(shí)驗(yàn)方法樣品前處理:將實(shí)驗(yàn)樣和對(duì)照樣與流動(dòng)相A液對(duì)半稀釋(體積比1:1進(jìn)行稀釋)，作為上樣樣品。上樣樣品進(jìn)行反相高效液相色譜分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖3可見，a曲線是 對(duì)照樣的反相高效液相色譜215nm的洗脫圖譜，洗脫時(shí)間為26min處有一明顯的吸收峰，其余峰高相對(duì)較低，根據(jù)吸收值和肽鍵濃度的正比關(guān)系，可認(rèn)為在12%對(duì)照發(fā)酵乳3000Da上清液(對(duì)照樣)中，其多肽類物質(zhì)較少，且種類單一。b曲線是瑞士乳桿菌發(fā)酵乳3000Da上清液(實(shí)驗(yàn)樣)反相高效液相色譜215nm的洗脫圖譜，與對(duì)照發(fā)酵乳相比，瑞士乳桿菌發(fā)酵乳3000Da上清液的反相圖譜中吸收峰明顯增多，且在洗脫時(shí)間為21min、24min和33min處有三處最為明顯的吸收峰，實(shí)驗(yàn)中對(duì)這三個(gè)峰進(jìn)行了收集，分別記錄為發(fā)酵乳分離物B峰、發(fā)酵乳分離物C峰和發(fā)酵乳分離物D峰。根據(jù)對(duì)各分子量對(duì)應(yīng)的多肽與原發(fā)酵乳分離物B峰、C峰和D峰對(duì)應(yīng)分子量物質(zhì)的保留時(shí)間對(duì)比，發(fā)現(xiàn)444.24Da的物質(zhì)來源于發(fā)酵乳分離物的B峰。通過對(duì)照發(fā)酵乳和瑞士乳桿菌發(fā)酵乳的比較，可發(fā)現(xiàn)經(jīng)過瑞士乳桿菌發(fā)酵得到的發(fā)酵乳，其含有比對(duì)照發(fā)酵乳更為豐富的、分子量小于3000Da的多肽物質(zhì)。這些多肽類物質(zhì)是由于原脫脂乳中的大蛋白被瑞士乳桿菌所分泌的胞內(nèi)酶和胞外酶分解，釋放出一些多肽片段和游離的氨基酸所形成的。乳酸菌所分泌的胞外酶對(duì)乳品中￠-酪蛋白片段具有非特異性或特異性的切割。通常這些由微生物發(fā)酵得到的多肽類物質(zhì)，極有可能具有一定的生物活性。如果使用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌組合生產(chǎn)普通酸奶，由于多肽的產(chǎn)量少，品種單一，生物活性相對(duì)較低。根據(jù)反相高效液相色譜原理，疏水性較差的物質(zhì)由于與分離柱固相結(jié)合力較弱，先從分離柱中洗脫下來，而疏水性較好的物質(zhì)與分離柱固相鍵合作用較大，后從分離柱中被洗脫下來。由此可得，三個(gè)分離物其疏水性按如下順序排列:瑞士乳桿菌發(fā)酵乳分離物B峰>C峰>D峰。經(jīng)過收集操作，得到B峰值的樣品，采用真空冷凍干燥技術(shù)進(jìn)行冷凍干燥，-4°C冷凍保藏，作為后續(xù)質(zhì)譜分析的實(shí)驗(yàn)材料。四、生物活性多肽的質(zhì)譜法純化和氨基酸序列測(cè)定1.實(shí)驗(yàn)方法(I)色譜條件:
儀器:Waters ACQUITY UPLC超高效液相-電噴霧-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)儀色譜柱規(guī)格C18色譜柱流速:0.4mL/min溫度:45°C紫外檢測(cè)波長:2IOnm進(jìn)樣量:7uL梯度條件:0min-3min保持99%A液，1%B液；3min_9minB液從1%變?yōu)?%, A液從99% 變?yōu)?95% ；9min-15minB 液從 5% 變?yōu)?10%，A 液從 95% 變?yōu)?90% ； 15min-21min%B 液從 10%變?yōu)?5%，A液從90%變?yōu)?5% ；21min-24min, B液從25%變?yōu)?0%，A也從75%變?yōu)?0% ；24min-27min,B 液從 40% 變?yōu)?80%，A 液從 60% 變?yōu)?20% ；27min-27.5min 保持 80%B 液，20%A液；27.5min-28min, B 液從 80% 變?yōu)?5%, A 液從 20% 變?yōu)?95% ；28min-28.5min, B 液從 5% 變?yōu)?%, A液從95%變?yōu)?9% ；28.5min-30min,保持99%A液，1%B液。A液:含有2%乙腈和0.05%TFA 的 ddH20 ；B 液:100% 乙腈(2)質(zhì)譜條件:離子方式:ES+質(zhì)量范圍(m/z):100-1500
毛細(xì)管電壓(Capillary)(kV):3.0采樣錐(V):35.0離子源溫度(°C)):100去溶劑溫度(°C ):350去溶劑氣流(L/hr):600.0碰撞能量(eV):6.0掃描時(shí)間(sec):0.3內(nèi)掃描時(shí)間(sec):0.02二級(jí)質(zhì)譜母離子質(zhì)量(m/z):444.24根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)條件，利用超高效液相-電噴霧-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜，得到瑞士乳桿菌發(fā)酵乳分離物B峰中分子量為444.24Da的多肽的一級(jí)質(zhì)譜圖、二級(jí)質(zhì)譜圖，并通過Masslynx軟件計(jì)算氨基酸序列，結(jié)果見圖4_6。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過Masslynx軟件分析計(jì)算，得到分子量為444.25Da的活性多肽片段的氨基酸序列為Ser-Leu-Pro-Gln(SLPQ),記為SEQ ID NO:1。該片段來源于瑞士乳桿菌發(fā)酵乳分離物B峰，與@ -酪蛋白的84 87號(hào)的殘基序列相對(duì)應(yīng)，@ -酪蛋白氨基酸序列的genbank序列號(hào)為AAA30431.1，序列見SEQ ID NO:3。實(shí)施例2生物活性肽的促進(jìn)機(jī)體免疫力活性實(shí)驗(yàn)一、MTT法測(cè)定生物活性多肽SLPQ的體外淋巴細(xì)胞增殖能力實(shí)驗(yàn)I)實(shí)驗(yàn)材料與儀器:試劑與材料:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物balb/c小鼠(雄性6-8周齡，上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)；瑞士乳桿菌發(fā)酵后質(zhì)譜法分離得到的乳源性生物活性多肽SLPQ ;小鼠淋巴細(xì)胞提取液(購自索來寶公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(購自GIBCO公司)；3_(4，5_ 二甲基噻唑-2)-2,5- 二苯基四氮唑溴鹽(MTT,購自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA,購自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA,購自Genebase公司)；胃蛋白酶(購自Sigma公司)；胰酶(CorolasePP,購自 AB 公司)。儀器:LRH_250F生化培養(yǎng)箱，上海恒科技有限公司；GL_22M高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Hera celll50C02培養(yǎng)箱，Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶標(biāo)儀，Labsystems公司；ALPHA1-2_LD真空冷凍干燥機(jī)，Christ公司；超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，waters公司。2)實(shí)驗(yàn)方法:無菌條件下取小鼠脾臟，用淋巴細(xì)胞提取液提取小鼠淋巴細(xì)胞，進(jìn)行元代培養(yǎng)。用完全RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為2.5 X IO6個(gè)/mL。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中依次加入:100 u L小鼠淋巴細(xì)胞懸液，100 u L RPMI1640完全培養(yǎng)液，20 U L伴刀豆蛋白，100 y L樣品。另外，設(shè)置空白對(duì)照組(PH7.2 7.4，3mol/L的PBS)和陰性對(duì)照組(500 y g/mL BSA)，研究表明其對(duì)于體外淋巴細(xì)胞增殖沒有影響。每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)樣。在5%C0237°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68h后，無菌條件下每孔加入20 ii L MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心棄去上清液，每孔加入100 u L二甲基亞砜，37°C生化培養(yǎng)箱孵化lOmin，搖勻，用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定吸光值。體外淋巴細(xì)胞增殖能力用刺激指數(shù)來表示，計(jì)算方法如下:
權(quán)利要求
1.一種生物活性多肽，其氨基酸序列為Ser-Leu-Pro-Gln。
2.權(quán)利要求1所述的生物活性多肽，其特征在于，所述生物活性多肽為乳源性。
3.編碼權(quán)利要求1所述生物活性多肽的核苷酸片段。
4.權(quán)利要求3所述的核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸片段的序列如SEQID NO:2所示。
5.權(quán)利要求1-2任一權(quán)利要求所述生物活性多肽的制備方法，步驟如下: 1)發(fā)酵:將瑞士乳桿菌添加到脫脂乳中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，獲得瑞士乳桿菌發(fā)酵乳； 2)多肽的粗提:對(duì)步驟I)的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳進(jìn)行低溫離心分離，取上清液； 3)多肽的純化: a.對(duì)步驟2)的上清液進(jìn)行超濾處理，收集濾液； b.收集的濾液采用反向?qū)游鲋鵖0URSE5RPCST進(jìn)行反相高效液相色譜分離，收集洗脫時(shí)間為2Imin的多肽混合物； c.用超高效液相-電噴霧-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)儀分離獲得多肽SLPQ。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟I)所述厭氧發(fā)酵的條件為:發(fā)酵溫度36 38°C，發(fā)酵時(shí)間15 20h。
7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟3)a中所述超濾法所采用的濾膜的截留分子量分別為IOk Da和3kDa ;所述超濾過程中，壓力范圍為0.1 0.3MPa，濾液流速為 0.8 1.2mL/min。
8.權(quán)利要求1-2任一權(quán)利要求所述生物活性多肽或者權(quán)利要求3-4任一權(quán)利要求所述核苷酸片段在制備增強(qiáng)機(jī)體免疫力的食品、保健品及藥物中的應(yīng)用。
9.一種增強(qiáng)機(jī)體免疫力的藥物,含有權(quán)利要求1-2任一權(quán)利要求所述生物活性多SLPQ和/或生物活性多肽SLPQ的衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白領(lǐng)域，具體涉及一種具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的乳源性生物活性多肽，其氨基酸序列為Ser-Leu-Pro-Gln。經(jīng)過體外免疫功能促進(jìn)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了本發(fā)明的多肽SLPQ能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的體外增殖能力，使巨噬細(xì)胞一氧化氮誘生量增加，提高機(jī)體抵御外界病原體感染的能力，降低機(jī)體發(fā)病率，而且不會(huì)引起機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)在消化道中穩(wěn)定，不會(huì)被分解，表明發(fā)明的生物活性多肽SLPQ可以被機(jī)體直接吸收發(fā)揮其具有的生物活性作用。為開發(fā)含有SLPQ的保健品和功能型乳制品奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12P21/02GK103232527SQ20131004798
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者張少輝, 盧姍姍, 孫冠華, 馬鎏镠, 周婕慧, 郭海濱, 胡迪 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)