專(zhuān)利名稱(chēng)：內(nèi)生真菌菌株s22及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種野生稻內(nèi)生的真菌菌株的突變體S22，以及其在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和/或促生上的用途，屬于微生物及微生物應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
內(nèi)生真菌(endophytic fungi)即至少生活史的一部分能侵染定殖在健康植物組織中，宿主無(wú)明顯病癥的一類(lèi)真菌(Petrini，1991 ;Wilson，1995)，與菌根真菌只存在于植物根系不同，內(nèi)生真菌在植株的地下和地上部分的任何組織器官都能存在(Faeth &Fagan, 2002)。內(nèi)生真菌通常與寄主植物形成互惠共生關(guān)系，一方面內(nèi)生真菌從寄主植物中獲取生長(zhǎng)所需的養(yǎng)分，另一方面內(nèi)生真菌可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)寄主植物的抗生物和非生物脅迫的能力。目前研究較多的是根瘤共生體和菌根共生體，內(nèi)生真菌與植物的共生體是高等植物與微生物共生關(guān)系的又一種表現(xiàn)形式。內(nèi)生真菌與植物的互作研究已日益受到研究者的關(guān)注，并成為內(nèi)生真菌研究領(lǐng)域的國(guó)際熱點(diǎn)。內(nèi)生真菌一植物共生是雙方相互適應(yīng)的結(jié)果，兩者處在一種動(dòng)態(tài)平衡中。在內(nèi)生真菌一植物共生互作中，內(nèi)生 真菌和植物的基因表達(dá)譜發(fā)生明顯的變化，而且其表達(dá)譜依賴(lài)于所接種的內(nèi)生真菌種類(lèi)；基因表達(dá)的改變表明內(nèi)生真菌和植物之間存在著信息的交流(Bailey et al., 2006)?；钚匝?reactive oxygen species, R0S)是植物和微生物互作中一種非常重要的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。NADPH氧化酶(NADPH oxidase, Nox)將NADPH的電子轉(zhuǎn)移到電子受體上，導(dǎo)致活性氧的形成。隨著Nox家族成員的發(fā)現(xiàn)，認(rèn)識(shí)到活性氧的產(chǎn)生過(guò)程是一個(gè)普遍存在的控制各種分化過(guò)程的信號(hào)途徑，其中包括細(xì)胞的繁殖、凋亡、激素反應(yīng)、程序化死亡、根毛生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)等過(guò)程。在系統(tǒng)性種子垂直傳播的麥角菌類(lèi)內(nèi)生真菌羊茅香柱菌(Epichlogfestucae)和多年生黑麥草(Lolium perenne)的共生關(guān)系中，內(nèi)生真菌菌絲呈高度局限性生長(zhǎng)模式，定殖在寄主植物地上部分的細(xì)胞間隙中，沿平行于葉軸的方向生長(zhǎng)，幾乎不分枝。羊茅香柱菌NoxA突變體與寄主植物形成敵對(duì)互作關(guān)系，突變體在植物體內(nèi)生物量顯著增加，菌絲形態(tài)發(fā)生變化，并呈輻射狀生長(zhǎng)；接種突變體的植株喪失頂端優(yōu)勢(shì)、生長(zhǎng)嚴(yán)重鈍化、早熟衰老，最后死亡。另一個(gè)Nox基因一NoxB對(duì)羊茅香柱菌的定殖和共生關(guān)系的建立沒(méi)有影響。當(dāng)Nox復(fù)合體(包括N0XA、N0XR和RacA)產(chǎn)生的活性氧紊亂時(shí)，共生互作關(guān)系瓦解，植物與內(nèi)生真菌的關(guān)系將會(huì)由互惠共生變?yōu)閿硨?duì)。因此，內(nèi)生真菌NoxA產(chǎn)生的活性氧對(duì)其在植物體內(nèi)的生長(zhǎng)與生物量的變化具有調(diào)節(jié)作用，并對(duì)共生關(guān)系的維持起到至關(guān)重要的作用。(Tanaka et al., 2006; Eaton et al., 2011)。另外，許多微生物能利用非核糖體肽合成酶(Nonribosomal peptidesynthetase, NRPS)合成結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類(lèi)繁多的生物活性肽，被用作抗生素、免疫抑制劑、抗癌和抗病毒因子、鐵載體及生物表面活性劑等。在黑麥草內(nèi)生真菌中克隆到一個(gè)編碼NRPS的基因sidN，該基因參與合成鐵載體；sidN的突變體導(dǎo)致不能正常合成鐵載體，內(nèi)生真菌分泌鐵載體能力的缺失改變了共生體鐵離子的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致細(xì)胞間隙游離鐵離子增加，通過(guò)芬頓反應(yīng)(Fenton reaction)引起活性氧水平的增加,最終共生關(guān)系由互惠性向拮抗性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致植物的病變壞死(Eaton et al.，2011)。另一個(gè)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是由環(huán)境脅迫引起的促分裂素原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinases, MAP 激酶，MAPK)途徑。MAPK 途徑對(duì)許多致病真菌的毒力具有重要的作用。羊茅香柱菌sakA基因編碼MAPK，并在植物-內(nèi)生真菌共生關(guān)系中展現(xiàn)出必不可少的作用。sakA基因的缺失決定真菌與寄主植物之間的互作關(guān)系由共生變?yōu)橹虏　akA缺失突變體接種到植物上，植物表現(xiàn)出頂端優(yōu)勢(shì)的喪失、早熟衰老以及植株發(fā)展過(guò)程中的巨大變化，包括分蘗基部類(lèi)似鱗莖結(jié)構(gòu)的形成與花青素的喪失(Eatonet al., 2008)ο內(nèi)生真菌還通過(guò)誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性，從而提高植物抗生物(病原菌、食草動(dòng)物等)和非生物(鹽、干旱、高溫等)脅迫的能力。病程相關(guān)基因非表達(dá)子UNonexpressorof pathogenesis-related genes I, NPRl)是系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquiredresistance, SAR)途徑中的關(guān)鍵調(diào)控基因,其功能定位在SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的水楊酸(salicylic acid, SA)積累和隨后的SAR基因表達(dá)之間。NPRl基因最早從模式植物擬南芥中克隆得到。NPRl本身沒(méi)有抑菌活性，但它能誘發(fā)植物體內(nèi)的多種防衛(wèi)反應(yīng)，且對(duì)病原菌沒(méi)有嚴(yán)格的種屬專(zhuān)一'I"生。印度梨形孢(Piriformospora indica)誘導(dǎo)擬南芥的系統(tǒng)抗性需要茉莉酸信號(hào)傳遞及在細(xì)胞質(zhì)中的NPRl。植物一內(nèi)生真菌共生體是繼豆科植物一根瘤共生體、菌根共生體后發(fā)現(xiàn)的高等植物與微生物共生關(guān)系的又一種表現(xiàn)形式。但從研究的深度和廣度來(lái)看，與豆科植物一根瘤共生體、菌根共生體相比，植物一內(nèi)生真菌共生體的研究才剛處于基礎(chǔ)探索階段。目前植物一內(nèi)生真菌的互作研究已日益受到研究者的關(guān)注，并成為內(nèi)生真菌研究領(lǐng)域的國(guó)際熱點(diǎn)。內(nèi)生真菌一寄主植物共生是雙方相互適應(yīng)的結(jié)果，兩者處在一種動(dòng)態(tài)平衡中。在印度梨形孢與擬南芥共生體系中，擬南芥根部細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在的葡萄糖苷酶(PYKlO)能限制內(nèi)生真菌印度梨形孢的侵入定殖，從而抑制過(guò)強(qiáng)的防御反應(yīng)，有利于兩者的互惠共生(Sherameti et al.，2008b);在印度梨形孢與大麥共生體系中，內(nèi)生真菌侵染根系后能削弱HvB1-1基因的表達(dá)，HvB1-1基因的過(guò)表達(dá)反而能限制菌絲的侵染強(qiáng)度。HvB1-1基因在真核生物中很保守，能抑制細(xì)胞程序性死亡，這表明內(nèi)生真菌菌絲在寄主體內(nèi)的生長(zhǎng)和繁殖需要植物組織細(xì)胞一定程度的死亡(Deshmukh et al.，2006)，最終兩者達(dá)到平衡狀態(tài)。另外在植物一病原真菌互作研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)病原真菌菌絲的程序性死亡(programmed cell death)或自曬(autophagy)對(duì)于其成功侵染組織是必需的(Veneault-Fourrey et al., 2006),但在內(nèi)生真菌-植物互作中，內(nèi)生真菌中是否也存在著類(lèi)似的反應(yīng)機(jī)制到目前為止還沒(méi)有涉及。植物根瘤菌(RN)與菌根 真菌(AM)共生體系是植物-內(nèi)生菌共生體系中普遍存在且最為突出的模式體系，為研究植物-暗色有隔內(nèi)生真菌互作的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)模型。在豆科植物白脈根和苜蓿共生體中發(fā)現(xiàn)了大量共生必須的基因。目前已從各種共生突變體中克隆得到26個(gè)基因，這些基因參與根瘤菌的識(shí)別、早期的共生信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)、根部侵染與定殖、根瘤的形成以及固氮調(diào)節(jié)。這些發(fā)現(xiàn)為更好地了解植物-暗色有隔內(nèi)生真菌共生的分子機(jī)制和進(jìn)化提供重要的線索(Johnson et al., 2008)。CSP(common symbiosispathway公共共生途徑)普遍存在于共生系統(tǒng)中。Ca離子信號(hào)途徑是建立內(nèi)共生體系的重要途徑。CSP參與Ca離子信號(hào)的編碼與解碼，從而影響AM共生體系的建立。目前，有7個(gè)基因 SYMRK、CAST0R、P0LLUX、NUP133、NUP85、CCaMK 和 CYCLOPS 已經(jīng)被報(bào)道為 CSP 基因。目前已證實(shí)水稻有三個(gè)CSP直系同源基因:0sCAST0R、0sP0LLUX和OsCCaMK。其中，OsPOLLUX和OsCCaMK是水稻AM共生體必不可少的調(diào)控因子。在AM和RN共生系統(tǒng)中，OsCASTOR和OsCCaMK是維持CSP功能的分子基礎(chǔ)。SYMRK和富含亮氨酸的重復(fù)區(qū)域(LRR)共同編碼蛋白激酶(Johnson et al.，2008)。另外，SYMRK還可以通過(guò)激活由磷酸化調(diào)控的蛋白激酶參與Ca離子信號(hào)的形成，調(diào)節(jié)共生系統(tǒng)中的信號(hào)傳導(dǎo)。OsCASTOR與OsPOLLUX是跨膜通道蛋白(Deshmukh et al.，2006)，在共生體中對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也發(fā)揮作用。在信號(hào)途徑初期，許多定位在細(xì)胞核上的蛋白，比如核孔蛋白NUP85、NUP133，參與Ca離子信號(hào)誘導(dǎo)因子的運(yùn)輸與定位。 CCaMK (鈣/鈣調(diào)蛋白依賴(lài)的蛋白激酶)可能是Ca離子信號(hào)的解碼器，影響菌根真菌的侵染。CYCL0PS/IPD3也是Ca離子信號(hào)途徑的下游調(diào)控蛋白，與CCaMK協(xié)同作用。當(dāng)CCaMK引起磷酸化時(shí)，CYCLOPS激活Ca離子信號(hào)途徑下游基因，從而使菌根真菌和根瘤菌成功侵染寄主。研究證明，水稻擁有所有CSP直系同源基因。其中，水稻0sCAST0R、0sCCaMK、OsCYCLOPS、OsPOLLUX和OsCCaMK在水稻AM共生體中也起到至關(guān)重要的調(diào)控作用。用SYMRK/DMI2激酶篩選互作因子，結(jié)果從苜蓿中得到HMGR1，從白脈根中得到SIP。HMGRl編碼甲瓦龍酸酯合成酶，而該酶參與異戊二烯化合物的合成。因此，HMGRl被認(rèn)為參與根瘤菌的侵染與根瘤的形成。SIP是一類(lèi)新的具有ARID(AT-rich domain)的DNA結(jié)合蛋白，專(zhuān)門(mén)結(jié)合NIN的啟動(dòng)子。在GRAS區(qū)域，翻譯因子NSPl和NSP2在豆科植物RN共生體中是必須和專(zhuān)化的。除NSPl和NSP2外，翻譯因子NIN，對(duì)根瘤菌侵染根表皮以及根皮層根瘤的形成有重要作用。在水稻中也找到了與NSP1、NSP2同源的0sNSPl、0sNSP2。在共生表型喪失的白脈根(模式豆科植物)NSP1-2缺失的突變體中，水稻OsNSPl、0sNSP2能夠完全修復(fù)RN共生表型的缺失。CASTOR、POLLUX、CCaMK和CYCLOPS在水稻中仍能找到同源物，在進(jìn)化上相當(dāng)保守并且在共生關(guān)系中具有無(wú)可替代的作用。許多編碼GRAS蛋白的基因在AM共生體中上調(diào)。90年代初期，根瘤菌共生信號(hào)分子(NFs，Nod facters)的發(fā)現(xiàn)具有重大突破性，為隨后更好地闡述Nod基因功能提供基礎(chǔ)。NF受體擁有相同的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是由胞外賴(lài)氨酸感應(yīng)區(qū)域(LysM)的單通道跨膜區(qū)和胞內(nèi)激酶區(qū)域共同組成。LysM參與肽聚糖或類(lèi)似結(jié)構(gòu)分子的綁定，例如幾丁質(zhì)低聚糖。在LysM功能缺失的突變體中，植物對(duì)根瘤菌和NFs的侵入不產(chǎn)生任何反應(yīng)(Hiroshi et al.，2010)。在白脈根中，NFRl和NFR5形成受體復(fù)合體，對(duì)根瘤菌分泌的NFs具有專(zhuān)化識(shí)別性。由于NFR5胞內(nèi)區(qū)域缺少激酶活性，所以在將胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)給信號(hào)途徑下游的過(guò)程中NFRl起到至關(guān)重要的作用。而且NFRl的激酶活性在激活下游共生信號(hào)途徑中必不可少(T.Nakagawa,unpublished result)。全基因組序列分析表明:LysM_RK( LysM receptor-like kinases)基因家族可以通過(guò)基因串聯(lián)和部分復(fù)制呈現(xiàn)多元化。這樣就增加了由多個(gè)LysM-RK基因組成的復(fù)合體調(diào)節(jié)NF的感應(yīng)和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的可能性，而不僅僅局限于NFRl和NFR5復(fù)合體。所以寄主植物識(shí)別NFs的確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。目前，在水稻基因組中發(fā)現(xiàn)了 6個(gè)LysM-RK基因。擬南芥中存在的幾丁質(zhì)受體CERK1，能夠引起植物先天免疫力對(duì)抗真菌病原菌。CERKl也屬于LysM-RK，尤其是在胞內(nèi)激酶區(qū)域方面，CERKl與NFRl有高度相似性?；诮Y(jié)構(gòu)上的相似性，NFRl也具有短暫激活抗性相關(guān)基因的作用(T.Nakagawa, unpublishedresults)。白脈根中來(lái)自根瘤菌的共生信號(hào)分子的感應(yīng)是由兩個(gè)LysM激酶NFRl和NFR5調(diào)節(jié)的。這兩個(gè)激酶在根瘤菌的侵染與根瘤的形成過(guò)程中必不可少。在內(nèi)生羊茅香柱菌與寄主植物多年生黑麥草共生體中，菌絲呈高度局限性生長(zhǎng)模式，定殖在寄主植物地上部分的細(xì)胞間隙中，沿平行于葉軸的方向生長(zhǎng)，幾乎不分枝。這種嚴(yán)格控制內(nèi)生菌生長(zhǎng)的現(xiàn)象說(shuō)明寄主與共生體之間存在信號(hào)傳導(dǎo)。在共生體中，內(nèi)生真菌在促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和生物量提高的過(guò)程中，激素類(lèi)物質(zhì)起到非常重要的作用。其中，一類(lèi)由植物根部分泌的新型內(nèi)源植物激素-獨(dú)角金萌發(fā)素內(nèi)酯(Strigolactones),可以促進(jìn)真菌的代謝、分枝和孢子的萌發(fā),改變真菌的生理機(jī)能和線粒體活性。同樣地，真菌也釋放信號(hào)分子，引起植物根部的共生專(zhuān)化型反應(yīng)。植物根部的β-葡萄糖苷酸酶報(bào)告基因在真菌菌絲接近時(shí)被激活。微生物(例如內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌、根瘤菌等)通過(guò)誘導(dǎo)植物激素的產(chǎn)·生或干擾植物激素合成途徑，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和生物量的增加。尤其是細(xì)菌ACC脫羧酶通過(guò)調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的乙烯水平從而干涉寄主植物的生理功能。TAKAKAZU(2010)等從栽培稻莖部分離得到內(nèi)生細(xì)菌，固氮螺菌Azospirillum sp.。通過(guò)對(duì)該細(xì)菌全基因組核苷酸序列分析，發(fā)現(xiàn)了 2個(gè)激素相關(guān)基因。acdS基因，編碼ACC脫羧酶。acdR基因，調(diào)節(jié)acdS的表達(dá)。固氮螺菌產(chǎn)生ACC脫羧酶，降低植物體內(nèi)的乙烯含量，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，減弱環(huán)境脅迫的信號(hào)。acdS在以前的研究中從未報(bào)道過(guò)。通過(guò)研究?jī)?nèi)生真菌突變體的功能，從而尋找相關(guān)關(guān)鍵基因，對(duì)研究?jī)?nèi)生真菌與植物的共生體系具有重大意義。水稻是我國(guó)最重要的糧食植物，內(nèi)生真菌與水稻的共生體系，內(nèi)生真菌突變體對(duì)水稻的致病力的研究，能夠開(kāi)發(fā)具有相應(yīng)抗病性防御機(jī)制生物制劑，對(duì)提高栽培水稻生長(zhǎng)，增加生物量，提高其在逆境中的生存能力方面的研究與利用具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種內(nèi)生真菌的突變體菌株S22及其用途。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種內(nèi)生真菌菌株S22，為稻鏈狀瓶霉(Harpophora oryzae) R5-6-1-S22，其保藏號(hào)為:CCTCC NO: M 2012315。本發(fā)明還同時(shí)提供了上述內(nèi)生真菌菌株S22的用途:用于促進(jìn)植物生長(zhǎng)(對(duì)植物有促生作用)。作為本發(fā)明的內(nèi)生真菌菌株S22的用途的改進(jìn):植物為水稻或大麥。本發(fā)明的內(nèi)生真菌菌株S22為Harpophora oryzae R5-6-1-S22,保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào):CCTCC Ν0:Μ 2012315，保藏時(shí)間2012年8月27日。菌株Harpophora oryzae R5-6-1-S22來(lái)源于水稻的內(nèi)生真菌稻鐮狀瓶霉的突變體，屬于真菌界，子囊菌門(mén)，糞殼綱，有絲分裂真菌巨座殼科，瓶霉屬。該菌株對(duì)植物有促生作用。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
圖1:菌株(稻鐮狀瓶霉突變體菌株)Harpophora oryzae R5-6-1-SS1在CM培養(yǎng)基上25°C暗培養(yǎng)5d后的菌落形態(tài)；與野生型R5-6-1相比，R5-6-1-SS1氣生菌絲更為稠密，菌落深灰色，菌落邊緣不整齊并呈輻射狀延伸，黑色素沉淀也明顯增加。圖2:菌株Harpophora oryzae R5-6-1-SS1對(duì)水稻的致死作用:對(duì)照組I為空白對(duì)照，即沒(méi)有接種的水稻苗，對(duì)照組2為接種R5-6-1的水稻苗，處理組為接種Harpophoraoryzae R5-6_1_SS1的水稻苗。接種R5-6-1-SS1的處理組植株地上部組織枯萎死亡，而對(duì)照組I和2的植株長(zhǎng)勢(shì)良好；圖3:突光顯微鏡下觀察Harpophora oryzae R5-6-1-SS1在根部的定殖情況及對(duì)根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響；A代表根毛區(qū)熒光顯微鏡圖，B代表根毛區(qū)光學(xué)顯微鏡圖，C代表根毛區(qū)橫切面；圖4:Harpophora oryzae R5-6-1-SS1 侵染大麥致病性實(shí)驗(yàn)；圖5:顯微鏡下觀察接種Harpophora oryzae R5-6-1-SS1的大麥葉片的侵染定殖情況；圖6:顯微鏡下觀察接種Harpophora oryzae R5-6-1-SS1的大麥葉片橫切面的侵染定殖情況；圖7:菌株Harpophora oryzae R5-6-1-S22在CM培養(yǎng)基上25°C暗培養(yǎng)5d后的菌落形態(tài)；與野生型菌株R5-6-1相比，氣生菌絲更為稀少，菌落白色，菌落邊緣整齊并呈輻射狀延伸，黑色素沉淀也明顯減少，幾乎沒(méi)有；圖8:稻鐮狀瓶霉突變體菌株Harpophora oryzae R5-6-1-S22對(duì)水稻的促生作用:對(duì)照組I為空白對(duì)照，即沒(méi)有接種的水稻苗，對(duì)照組2為接種R5-6-1的水稻苗，處理組為接種Harpophora oryzae R5-6_1_S22的水稻苗,結(jié)果顯示處理組植株地上部組織生長(zhǎng)旺盛，葉片寬度增加，葉綠素含量增加，比對(duì)照組I和2的植株長(zhǎng)勢(shì)好。圖9:突光顯微鏡下觀察Harpophora oryzae R5-6-1-S22在根部的定殖情況及對(duì)根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響；A代表根毛區(qū)突光顯微鏡圖，B代表根毛區(qū)光學(xué)顯微鏡圖，C代表根毛區(qū)橫切面；圖10:菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR19在CM培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。圖11:稻鐮狀瓶霉突變體菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR19對(duì)水稻的致死作用:對(duì)照組I為空白對(duì)照，即沒(méi)有接種的水稻苗，對(duì)照組2為接種R5-6-1的水稻苗，處理組為接種 Harpophora oryzae R5-6-1-RR19 的水稻苗。圖12:突光顯微鏡下觀察Harpophora oryzae R5-6-1-RR19在根部的定殖情況及對(duì)根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響；A代表根毛區(qū)突光顯微鏡圖，B代表根毛區(qū)光學(xué)顯微鏡圖，C代表根毛區(qū)橫切面；圖13: Harpophora oryzae R5-6-1-RR19 侵染大麥致病性實(shí)驗(yàn)；
圖14:顯微鏡下觀察Harpophora oryzae R5-6-1-RR19的侵染定殖情況；A代表大麥葉片橫切面的熒光顯微鏡圖，B代表侵染大麥葉片后的突光顯微鏡圖；圖15 ;菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR21在CM培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；圖16:稻鐮狀瓶霉突變體菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR21對(duì)水稻的致死作用:對(duì)照組I為空白對(duì)照，即沒(méi)有接種的水稻苗，對(duì)照組2為接種R5-6-1的水稻苗，處理組為接種 Harpophora oryzae R5-6-1-RR21 的水稻苗。圖17:突光顯微鏡下觀察Harpophora oryzae R5-6-1-RR21在根部的定殖情況及對(duì)根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響；圖18:Harpophora oryzae R5-6-1-RR21 侵染大麥致病性實(shí)驗(yàn)；圖19:顯微鏡下觀察Harpophora oryzae R5-6-1-RR21的侵染定殖情況。A代表大麥葉片橫切面的熒光顯微鏡圖，B代表侵染大麥葉片后的突光顯微鏡圖。
具體實(shí)施例方式參照上述附圖，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。備注說(shuō)明:下述 所有的培養(yǎng)基使用前均需要按照常規(guī)方式進(jìn)行高溫高壓的滅菌處理(121°C、0.24 MPa、20 分鐘)。實(shí)施例1、內(nèi)生真菌突變體菌株的獲得:野生型稻鐮狀瓶霉菌株編號(hào)為R5-6-1，分離自2007年野生稻根系。R5_6_l菌株保存在荷蘭國(guó)際真菌保藏中心(編號(hào):CBS125863)和中國(guó)普通微生物保藏中心(編號(hào):CGMCC 2737)。農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株 AGLl 及質(zhì)粒 pCAMBIA1300 等常規(guī)物均為本實(shí)驗(yàn)室保存。農(nóng)桿菌一般在28°C黑暗培養(yǎng)，生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基，在4%的甘油中-70°C下保存。CM(Complete Medium)培養(yǎng)基:20 X Nitrate salts 50ml, IOOOXTrace Elementslml, D-glucose (葡萄糖)IOg, Peptone (蛋白胨)2g, Yeast extract (酵母提取物)lg,Casamino acid (酪蛋白氨基酸)lg, IOOOXVitamin solution lml,用 lmol/L NaOH 調(diào) pH值至6.5,加蒸懼水至1L。CM固體培養(yǎng)基為上述CM (Complete Medium)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入瓊脂粉12g。20 X Nitrate salts (1000ml)的配置:NaN03 120g, KCl 10.4g, MgSO4.7H2010.4g，KH2PO4 30.4g，水定容至 IL0IOOOXTrace Elements (100ml)的配置:ZnS04.7H20 2.2g, H3BO3 1.lg, MnCl2.4H20 0.5g, FeSO4.7H20 0.5g, CoCl2.6H20 0.17g, CuSO4.5H20 0.16g, Na2MoO4.5H200.15g, Na4EDTA 5g，水定容至 100ml。IOOOXVitamin solution (100ml)的配置:Biotin 0.0lg, Pyridoxin 0.0lg,Thiamine 0.0lg, Riboflavin 0.0lg, PABA (p-aminobenzonic acid) 0.0lg, Nicotinicacid 0.0lg,水定容至 100ml。水瓊脂培養(yǎng)基:蒸餾水加1.5%瓊脂粉(即瓊脂粉與蒸餾水的質(zhì)量比為1.5:98.5)，高壓滅菌，用于單孢分離。DCM (Defined Complex Medium)培養(yǎng)基:用于轉(zhuǎn)化子 SUR 抗性篩選，Yeastnitrogen base without amino acids (Difco) 1.7g,Asparagines 2g,NH4NO3 Ig , Glucose10g，定容至 1L，用 Na2HPO4 調(diào) pH 至 6.0。LB 液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani):Tryptone (膜蛋白腺)10g、Yeast extract (酵母提取物)5g、NaCl (氯化鈉)IOg,加去離子水至1000ml,用NaOH溶液調(diào)至pH7.5,高壓滅菌。LB 固體培養(yǎng)基:Tryptone (胰蛋白胨)10g、Yeast extract (酵母提取物)5g、NaCl(氯化鈉)10g、瓊脂粉12g，加去離子水至1000ml，用NaOH溶液調(diào)至pH7.5，高壓滅菌。農(nóng)桿菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基AIM 配方:0.8 ml 1.25 K-Phosphate-buffer pH 4.8 (用KH2PO4 和 K2HPO4 配制)，20 ml MN-buffer (30 g/1 MgSO4*7H20, 15 g/1 NaCl, IL H2O2),I ml 1% CaCl2*2H20 (w/v) , 10 ml 0.01 % FeSO4 (w/v), 5 ml spore elements (100 mg/1ZnSO4*7H20, 100 mg/1 CuSO4.5Η20, 100 mg/1 H3BO3, 100 mg/1 Na2MoO4.2Η20，IL H2O2)(過(guò)濾滅菌)，2.5 ml 20% NH4NO3 (w/v), 10 ml 50% glycerol (v/v), 40 ml I M MES pH 5.5(用NaOH溶液調(diào)pH值)，20% glucose (w/v):液體培養(yǎng)基中加10 ml，固體培養(yǎng)基加5 ml,加水至1L，固體培養(yǎng)基加1.5 %瓊脂粉，(200 mM AS-用二甲基亞砜DMSO配制)。上述所有的培養(yǎng)基均需要進(jìn)行高溫高壓的滅菌處理(121°C、0.24 MPa、20分鐘)。在實(shí)驗(yàn)室條件下，按照農(nóng)桿菌AGLl的凍融法轉(zhuǎn)化方法即可獲得本發(fā)明的內(nèi)生真菌突變體菌株，即稻鐮狀瓶霉突變體菌株。具體如下:首先，農(nóng)桿菌感受態(tài)制備:將構(gòu)建好的熒光融合蛋白表達(dá)載體PKD6-GFP以及PKD5-RED (Li et al.2012)通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株AGLl。將農(nóng)桿菌菌株在LB平板上活化，然后轉(zhuǎn)到5mL LB液體培養(yǎng)基中28°C振蕩過(guò)夜培養(yǎng)；轉(zhuǎn)移2mL此培養(yǎng)液到裝有50mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中28°C振蕩培養(yǎng)至0D6000.5 1.0 ;冰上放置停止生長(zhǎng)，4°C 3000g離心5min ;沉淀用ImL預(yù)冷的20 mM CaCl2溶液懸浮，分裝到預(yù)冷卻的Eppendorf離心管中，每管0.1mL ；Wlyg的載體(熒光融合蛋白表達(dá)載體PKD6-GFP或pKD5_RED)質(zhì)粒DNA到上述離心管中，液氮中冷凍；37°C水浴5min解凍；加入ImLLB液體培養(yǎng)基，28°C輕搖培養(yǎng)2_4h ；將培養(yǎng)好的菌液涂于含有卡那霉素(含50 μ g/ml)的LB平板上，正面放置30min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，28 0C培養(yǎng)2-4d。其次，稻鐮狀瓶霉的T-DNA轉(zhuǎn)化:從上述培養(yǎng)的LB平板(含50 μ g/ml卡那霉素)上挑選農(nóng)桿菌單菌落接種于5ml LB液體培養(yǎng)基(含50 μ g/ml卡那霉素)，200rpm/min，28°C過(guò)夜培養(yǎng)；第二天將200-400 μ I培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到5ml含50 μ g/ml卡那霉素的誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基(AM)中，OD值約0.15，28°C培養(yǎng)5 6個(gè)小時(shí)使0D600達(dá)到0.5 0.6 ;用IOml滅菌蒸餾水從培養(yǎng)大約10天的CM平板上洗下稻鐮狀瓶霉野生型分生孢子，三層擦鏡紙過(guò)濾后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并用無(wú)菌水稀釋孢子濃度為IO6個(gè)/ml ;取100 μ I培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌AGL-1 (含載體)菌液和100 μ I稀釋好的稻鐮狀瓶霉分生孢子懸浮液混合，混合液(200μ I)均勻涂于AM平板上的硝酸纖維素膜表面，AM平板含200 μ M乙酰丁香酮(AS，acetosyringone)或不含AS作為對(duì)照,22°C共培養(yǎng)48小時(shí)；然后將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移到含氯嘧磺隆與抗生素的DCM選擇平板上，選擇性培養(yǎng)基中含300 μ g/ml氯嘧磺隆(SUR)、400μ g/ml 頭孢霉素(cefotaxime)、60 μ g/ml 鏈霉素(streptomycin),將平皿置于 28°C下培養(yǎng)到轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。本發(fā)明一共獲得轉(zhuǎn)化子87個(gè)，將其中4個(gè)(與野生型稻鐮狀瓶霉菌株編號(hào)為R5-6-1明顯不同)進(jìn)行保藏，具體如下:菌株編號(hào)為Harpophora oryzae R5-6-1-SS1,保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào):CCTCC Ν0:Μ 2012314，保藏時(shí)間2012年8月27日。菌株編號(hào)為Harpophora oryzae R5-6-1-S22,保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào):CCTCC Ν0:Μ 2012315，保藏時(shí)間2012年8月27日。菌株編號(hào)為Harpophora oryzae R5-6-1-RR19,保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào):CCTCC Ν0:Μ 2012312，保藏時(shí)間2012年8月27日。菌株編號(hào)為Harpophora oryzae R5-6-1-RR21,保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào):CCTCC Ν0:Μ 2012313，保藏時(shí)間2012年8月27日。實(shí)施例2、稻鍵狀瓶霉突變體菌株 Harpophora oryzae R5-6_1_SS1 (CCTCC NO:M
2012314)的形態(tài)觀察:在CM培養(yǎng)基上觀察該突變體菌株的菌落形態(tài)、顏色、生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量和黑色素沉淀。 觀察結(jié)果(圖1)顯不:突變體菌株Harpophora oryzae R5-6-1-SS1在CM培養(yǎng)基上25°C暗培養(yǎng)5d后，菌落直徑分別為5.8cm、5.5cm。與野生型菌株相比，氣生菌絲更為稠密，菌落深灰色，菌落邊緣不整齊并呈輻射狀延伸，產(chǎn)孢量極顯著提高，為3.92 X IO9/皿，黑色素沉淀也明顯增加。實(shí)施例3、稻鍵狀瓶霉突變體菌株 Harpophora oryzae R5-6_1_SS1 (CCTCC NO:M
2012314)對(duì)水稻的致死作用:MS培養(yǎng)基(IL):硝酸鉀1900mg/L，硝酸銨1650 mg/L，硫酸鎂370 mg/L，磷酸二氫鉀 170 mg/L,氯化I丐 440 mg/L,硫酸猛 22.3 mg/L,硫酸鋅 8.6 mg/L,硼酸 6.2 mg/L,碘化鉀0.83 mg/L，鑰酸鈉0.25 mg/L，硫酸銅0.025 mg/L，氯化鈷0.025 mg/L，硫酸亞鐵27.8 mg/L, Na2EDTA37.3 mg/L,甘氨酸 2.0 mg/L,鹽酸硫胺素 0.1 mg/L,鹽酸吡哆醇 0.5mg/L,煙酸 0.5 mg/L,肌醇 100 mg/L，30g 鹿糖，瓊脂粉 8g，H2O 定容至 IL ;pH 值 5.8。水稻種子(C039)去殼，用75%乙醇浸泡5 min,隨后將種子放置在三角瓶中用1%的NaClO溶液表面消毒8-10 min (充分搖勻)，最后用無(wú)菌水清洗多次后備用。將上述種子均勻平鋪在預(yù)先準(zhǔn)備的MS平板上，完畢后用Parafi Im封口膜封住平皿，在25°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)(16h光照/8h黑暗)。5天后將相對(duì)生長(zhǎng)一致的無(wú)菌萌發(fā)種子移入1/2 MSCMurashigeand Skoog基本培養(yǎng)基)培養(yǎng)基的平板中(13cmX 13cm),每板5棵苗，同時(shí)接入3塊預(yù)先培養(yǎng)的R5-6-1-SS1菌餅(直徑:0.5cm)。對(duì)照組I為不含菌株的CM瓊脂塊，對(duì)照組2為含R5-6-1菌株的CM瓊脂塊。設(shè)5個(gè)重復(fù)。共培養(yǎng)30天后，觀察水稻苗的長(zhǎng)勢(shì)。肉眼觀察水稻苗的長(zhǎng)勢(shì)(圖2),發(fā)現(xiàn):接種Harpophora oryzae R5-6-1-SS1的處理組植株地上部組織枯萎死亡，而對(duì)照組I和2的植株長(zhǎng)勢(shì)良好。突光顯微鏡下觀察Harpophora oryzae R5-6-1-SS1在根部的定殖情況及對(duì)根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響:觀察結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn):突變體菌絲集中分布于根毛區(qū)，尤其是根毛基部，菌絲密集，菌絲生物量多，且菌絲由皮層進(jìn)入內(nèi)皮層，最終侵染定殖于根系中柱細(xì)胞及維管組織。同時(shí)，被定殖的根部根毛彎曲變形，發(fā)育受限，長(zhǎng)度變短，并出現(xiàn)暗褐色的病斑。與野生型菌株只定殖于表皮與皮層的空間限制性定殖模式相比，致病型菌株能夠侵染定殖根部的維管組織，呈非限制性的激增型生長(zhǎng)。實(shí)施例4、稻鍵狀瓶霉突變體菌株 Harpophora oryzaeR5-6-l_SSl (CCTCC NO:M
2012314)對(duì)大麥葉片的侵染致病性:大麥(ZJ-8)光/暗育苗6d，剪取表面無(wú)損的第一片葉，用于接種試驗(yàn)。25°C，在CM固體培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)稻鐮狀瓶霉野生型R5-6-1及突變體菌株R5-6-1-SS1，10天后用0.8cm 口徑的打孔器打取菌餅，將菌餅接種于離體的大麥葉片上，每片葉3個(gè)菌餅，3個(gè)重復(fù)，250C，12/12h光/暗保濕培養(yǎng)，4d后觀察并記錄發(fā)病情況，試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn):R5-6-l_SSl對(duì)大麥葉片造成嚴(yán)重的危害，具有非常強(qiáng)的致病性，接種處產(chǎn)生面積較大的擴(kuò)散性黑色病斑，而且病斑會(huì)快速沿著葉脈擴(kuò)散至周?chē)慕】祬^(qū)域，病斑中央?yún)^(qū)域逐漸腐爛，并存在著大量的菌絲；相比之下，野生型菌株并未形成病斑，無(wú)侵染致病性。用顯微鏡檢測(cè)接種過(guò)的大麥葉片，觀察菌株的侵染定殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):R5-6-1-SS1可以在葉片表面形成大量的深褐色的附著胞(圖5)，附著胞繼而形成侵染菌絲直接侵染寄主的表皮及皮下細(xì)胞，最終定殖在葉脈的維管組織中，通過(guò)葉脈擴(kuò)散至周邊部位，被定殖的葉片細(xì)胞及維管束細(xì)胞死亡(圖6)。實(shí)施例5、稻鍵狀瓶霉突變體菌株 Harpophora oryzaeR5-6-l_S22 ( CCTCC NO:M
2012315)的形態(tài)觀察:在CM培養(yǎng)基上觀察突變體菌株的菌落形態(tài)、顏色、生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量和黑色素沉淀。觀察結(jié)果(圖7)顯示:突變體菌株在CM培養(yǎng)基上25°C暗培養(yǎng)5d后，菌落直徑分別為
2.8cm、2.5cm。與野生型菌株相比，氣生菌絲更為稀少，菌落白色，菌落邊緣整齊并呈輻射狀延伸，產(chǎn)孢量極顯著提高，為3.34 X IO9/皿，黑色素沉淀也明顯減少，幾乎沒(méi)有。實(shí)施例6、稻鍵狀瓶霉突變體菌株 Harpophora oryzaeR5-6-l_S22 ( CCTCC NO:M
2012315)對(duì)水稻的促生作用:方法參照實(shí)施例3。5天后將相對(duì)生長(zhǎng)一致的無(wú)菌萌發(fā)種子移入1/2 MS (Murashige and Skoog基本培養(yǎng)基)培養(yǎng)基的平板中(13cmX 13cm)，每板5棵苗，同時(shí)接入3塊預(yù)先培養(yǎng)的R5-6-1-S22菌餅(直徑:0.5cm)，對(duì)照組I為不含菌株的CM瓊脂塊，對(duì)照組2為含野生型R5-6-1菌株的CM瓊脂塊。設(shè)5個(gè)重復(fù)。共培養(yǎng)30天后，觀察水稻苗的長(zhǎng)勢(shì)。肉眼觀察水稻苗的長(zhǎng)勢(shì)(圖8),發(fā)現(xiàn):接種Harpophora oryzaeR5-6-l_S22的處理組植株地上部組織生長(zhǎng)旺盛，相對(duì)于對(duì)照組1，葉片寬度增加了 39.7%，葉綠素含量增加了88.2%，相比于對(duì)照組2，葉片寬度增加了 10.5%，葉綠素含量增加了 28%。說(shuō)明:HarpophoraoryzaeR5-6-l-S22比野生型菌株的促生作用更為顯著。突光顯微鏡下觀察Harpophora oryzaeR5-6-l_S22在根部的定殖情況及對(duì)根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響:觀察結(jié)果(圖9)發(fā)現(xiàn):菌絲主要均勻地分布定殖在根系表面，根毛區(qū)略多，促進(jìn)根毛的生長(zhǎng)，無(wú)致病性。絕大部分的菌絲聚集在根圍附近，只定殖于表皮層及外皮層，不侵染內(nèi)皮層和中柱細(xì)胞。Harpophora oryzaeR5-6-l_S22只限于根際周?chē)案砥ず屯獗砥拥亩ㄖ衬Ｊ?，以及促進(jìn)寄主生長(zhǎng)的特性，其更類(lèi)似于土壤中的菌根真菌和豆科植物的固氮類(lèi)真菌，圍繞在根際周?chē)龠M(jìn)根系的營(yíng)養(yǎng)吸收，增加吸收面積，從而利于植物的生長(zhǎng)。實(shí)施例7、稻鍵狀瓶霉突變體菌株Harpophoraoryzae R5_6_1-RR19( CCTCC NO:M2012312)的形態(tài)觀察:在CM培養(yǎng)基上觀察突變體菌株的菌落形態(tài)、顏色、生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量和黑色素沉淀。觀察結(jié)果(圖10)顯不:突變體菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR19在CM培養(yǎng)基上25°C暗培養(yǎng)5d后，菌落直徑分別為4.5cm、4.3cm。與野生型菌株相比，氣生菌絲更為稠密，菌落深灰色，菌落邊緣不整齊并呈輻射狀延伸，產(chǎn)孢量極顯著提高，為3.94X IO9/皿，黑色素沉淀也明顯增加。實(shí)施例8、稻鍵狀瓶霉突變體菌株 Harpophora oryzaeR5-6_l-RR19 ( CCTCC NO:M2012312)對(duì)水稻的致死作用:方法參照實(shí)施例3。5天后將相對(duì)生長(zhǎng)一致的無(wú)菌萌發(fā)種子移入1/2 MS (Murashige and Skoog基本培養(yǎng)基)培養(yǎng)基的平板中(13cmX 13cm)，每板5棵苗，同時(shí)接入3塊預(yù)先培養(yǎng)的R5-6-1-RR19菌餅(直徑:0.5cm)，對(duì)照組I為不含菌株的CM瓊脂塊，對(duì)照組2為含R5-6-1菌株的CM瓊脂塊。設(shè)5個(gè)重復(fù)。共培養(yǎng)30天后，觀察水稻苗的長(zhǎng)勢(shì)。肉眼觀察水稻苗的長(zhǎng)勢(shì)(圖 11),發(fā)現(xiàn):接種Harpophora oryzae R5-6-1-RR19的處理組植株地上部組織枯萎死亡，而對(duì)照組I和2的植株長(zhǎng)勢(shì)良好。突光顯微鏡下觀察Harpophora oryzae R5-6-1-RR19在根部的定殖情況及對(duì)根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響:觀察結(jié)果(圖12)發(fā)現(xiàn):突變體菌絲集中分布于根毛區(qū)，尤其是根毛基部，菌絲密集，菌絲生物量多，且菌絲由皮層進(jìn)入內(nèi)皮層，最終侵染定殖于根系中柱細(xì)胞及維管組織。同時(shí)，被定殖的根部根毛彎曲變形，發(fā)育受限，長(zhǎng)度變短，并出現(xiàn)暗褐色的病斑。與野生型菌株只定殖于表皮與皮層的空間限制性定殖模式相比，致病型菌株能夠侵染定殖根部的維管組織，呈非限制性的激增型生長(zhǎng)。實(shí)施例9、稻鍵狀瓶霉突變體菌株Harpophoraoryzae R5_6_1-RR19( CCTCC NO:M2012312)對(duì)大麥葉片的侵染致病性:大麥(ZJ-8)光/暗育苗6d，剪取表面磨損的第一片葉，用于接種試驗(yàn)。25 V,在CM固體培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)稻鐮狀瓶霉野生型R5-6-1及突變體菌株Harpophora oryzaeR5-6-1-RR19，10天后用0.8cm 口徑的打孔器打取菌餅，將菌餅接種于離體的大麥葉片上，每片葉3個(gè)菌餅，3個(gè)重復(fù)，25°C，12/12h光/暗保濕培養(yǎng)，4d后觀察并記錄發(fā)病情況，試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果(圖13)發(fā)現(xiàn):Harpophora oryzae R5-6-1-RR19對(duì)大麥葉片造成嚴(yán)重的危害，具有非常強(qiáng)的致病性，接種處產(chǎn)生面積較大的擴(kuò)散性黑色病斑，而且病斑會(huì)快速沿著葉脈擴(kuò)散至周?chē)慕】祬^(qū)域，病斑中央?yún)^(qū)域逐漸腐爛，并存在著大量的菌絲；相比之下，野生型菌株并未形成病斑，無(wú)侵染致病性。用顯微鏡檢測(cè)接種過(guò)的大麥葉片，觀察菌株的侵染定殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):Harpophora oryzae R5-6-1-RR19菌絲直接從葉片傷口處侵染表皮及皮下細(xì)胞,最終定殖在葉脈的維管組織中，通過(guò)葉脈擴(kuò)散至周邊部位，被定殖的葉片細(xì)胞及維管束細(xì)胞死亡(圖14)。實(shí)施例10、稻鍵狀瓶霉突變體菌株 Harpophora oryzae R5-6-1-RR21 ( CCTCCΝ0:Μ 2012313)的形態(tài)觀察:在CM培養(yǎng)基上觀察突變體菌株的菌落形態(tài)、顏色、生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量和黑色素沉淀。觀察結(jié)果(圖15)顯不:Harpophora oryzae R5-6-1-RR21突變體菌株在CM培養(yǎng)基上25°C暗培養(yǎng)5d后，菌落直徑分別為5.4cm、5.4cm。與野生型菌株相比，氣生菌絲略微稠密，菌落灰白色，菌落邊緣整齊并呈輻射狀匍匐狀延伸，產(chǎn)孢量為3.25X 109/皿，黑色素沉淀也明顯減少。實(shí)施例11、稻鍵狀瓶霉突變體菌株 Harpophora oryzae R5-6-1-RR21 ( CCTCCΝ0:Μ 2012313)對(duì)水稻的致死作用:方法參照實(shí)施例3。

5天后將相對(duì)生長(zhǎng)一致的無(wú)菌萌發(fā)種子移入1/2 MS (Murashige and Skoog基本培養(yǎng)基)培養(yǎng)基的平板中(13cmX 13cm)，每板5棵苗，同時(shí)接入3塊預(yù)先培養(yǎng)的R5-6-1-RR21菌餅(直徑:0.5cm)，對(duì)照組I為不含菌株的CM瓊脂塊，對(duì)照組2為含R5-6-1菌株的CM瓊脂塊。設(shè)5個(gè)重復(fù)。共培養(yǎng)30天后，觀察水稻苗的長(zhǎng)勢(shì)。肉眼觀察水稻苗的長(zhǎng)勢(shì)(圖16),發(fā)現(xiàn):接種Harpophora oryzaeR5-6_l-RR21的處理組植株地上部組織枯萎死亡，而對(duì)照組I和2的植株長(zhǎng)勢(shì)良好。突光顯微鏡下觀察Harpophora oryzaeR5-6_l-RR21在根部的定殖情況及對(duì)根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響:觀察結(jié)果(圖17)發(fā)現(xiàn):突變體菌絲由皮層進(jìn)入內(nèi)皮層，最終侵染定殖于根系中柱細(xì)胞及維管組織。與野生型菌株只定殖于表皮與皮層的空間限制性定殖模式相t匕，致病型菌株能夠侵染定殖根部的維管組織，呈非限制性的激增型生長(zhǎng)。實(shí)施例12、稻鍵狀瓶霉突變體菌株 Harpophora oryzae R5-6-1-RR21 ( CCTCCΝ0:Μ 2012313)對(duì)大麥葉片的侵染致病性:大麥(ZJ-8)光/暗育苗6d，剪取表面磨損的第一片葉，用于接種試驗(yàn)。25°C，在CM固體培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)稻鐮狀瓶霉野生型R5-6-1及突變體菌株R5-6-1-RR21，10天后用
0.8cm 口徑的打孔器打取菌餅，將菌餅接種于離體的大麥葉片上，每片葉3個(gè)菌餅，3個(gè)重復(fù)，250C，12/12h光/暗保濕培養(yǎng)，4d后觀察并記錄發(fā)病情況，試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果(圖18)發(fā)現(xiàn):Harpophora oryzae R5-6-1-RR21對(duì)大麥葉片造成較為嚴(yán)重的危害，具有較強(qiáng)的致病性，接種處產(chǎn)生面積較大的擴(kuò)散性黑色病斑，而且病斑會(huì)快速沿著葉脈擴(kuò)散至周?chē)慕】祬^(qū)域，病斑中央?yún)^(qū)域逐漸腐爛，并存在著大量的菌絲；相比之下，野生型菌株并未形成病斑，無(wú)侵染致病性。用顯微鏡檢測(cè)接種過(guò)的大麥葉片，觀察菌株的侵染定殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):Harpophora oryzae R5-6-1-RR21菌絲直接侵染寄主的表皮及皮下細(xì)胞,最終定殖在葉脈的維管組織中，通過(guò)葉脈擴(kuò)散至周邊部位，被定殖的葉片細(xì)胞及維管束細(xì)胞死亡(圖19)。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變 形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.生真菌菌株S22，其特征在于:為稻鏈狀瓶霉(Harpophoraoryzae) R5-6-1-S22，其保藏號(hào)為:CCTCC NO: M 2012315。
2.按權(quán)利要求1所述的內(nèi)生真菌菌株S22的用途，其特征在于:用于促進(jìn)植物生長(zhǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求 2所述的內(nèi)生真菌菌株S22的用途，其特征在于:所述植物為水稻或大麥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種野生稻內(nèi)生的真菌菌株的突變體S22，以及突變體S22在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和/或促生上的用途，屬于微生物及微生物應(yīng)用領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明公開(kāi)了一種內(nèi)生真菌菌株S22，為稻鏈狀瓶霉(Harpophora oryzae)R5-6-1-S22，其保藏號(hào)為CCTCC NO: M 2012315。該內(nèi)生真菌菌株S22的用途為用于促進(jìn)植物生長(zhǎng)；植物包括水稻或大麥。
文檔編號(hào)C12R1/645GK103087929SQ201310047818
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者蘇珍珠, 林福呈, 章初龍, 馮曉曉 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)