專利名稱：：用于改善腸神經(jīng)系統(tǒng)的益生菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包含用于改善腸神經(jīng)系統(tǒng)的乳酸菌菌株的組合物。所述組合物尤其適于治療和/或預(yù)防諸如便秘和/或易激性腸病(irritableboweldisease)的腸道疾病。
背景技術(shù)：
：腸易激綜合征(irritablebowelsyndrome,IBS)或疫攣性結(jié)腸(spasticcolon)是功能性腸病，其特征為在沒(méi)有任何可檢測(cè)到的器質(zhì)性病因的情況下的慢性腹部疼痛、不適、脹氣以及腸排便習(xí)慣改變。有些情況下，報(bào)道有低度腸炎。其主要癥狀可以是腹瀉或便秘，或二者交替(分別歸類為IBS-D、IBS-C)。腸易激綜合征可始于感染后(post-1nfectious,IBS-PI)、應(yīng)激性生活事件之后，或在無(wú)任何其他醫(yī)學(xué)指征的情況下成年發(fā)病。在腸易激綜合征中，常規(guī)的臨床檢測(cè)不會(huì)出現(xiàn)異常，但腸對(duì)某些刺激(例如氣球吹入試驗(yàn))更為敏感。腸易激綜合征是一種非常常見(jiàn)的疾病，在任一時(shí)間，其影響大約15%的人群?；荚摷膊〉呐源蠹s為男性的兩倍。腸易激綜合征是慢性疼痛、疲乏以及其他癥狀的起因，并且其增加患者的醫(yī)療費(fèi)用，并導(dǎo)致曠工。研究者已報(bào)道腸易激綜合征的高流行率連同增加的費(fèi)用導(dǎo)致該疾病具有高社會(huì)成本。還認(rèn)為腸易激綜合征是一種慢性疾病，其可顯著影響患者的生活質(zhì)量。關(guān)于腸易激綜合征病因的導(dǎo)向理論涉及腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)。腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)是外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)的一部分，其直接調(diào)節(jié)胃腸道(GI)功能，埋于胃腸系統(tǒng)的內(nèi)膜中。其包含傳出神經(jīng)元、傳入神經(jīng)元以及中間神經(jīng)元。腸神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和生理功能通過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(星形細(xì)胞)而實(shí)施。腸神經(jīng)系統(tǒng)組成具有功能特異性作用的兩個(gè)主要神經(jīng)叢。位于縱肌和環(huán)狀肌之間的腸肌叢含有主要參與調(diào)節(jié)腸運(yùn)動(dòng)的神經(jīng)元。傳出神經(jīng)元或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元通過(guò)腸肌控制蠕動(dòng)和腸內(nèi)容物的攪拌。調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元由如下兩大類組成:-釋放用于收縮的乙酰膽堿(被稱為膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶免疫反應(yīng)性神經(jīng)元(“ChAT-1R”或“ChAT”或“ChAT神經(jīng)元”或“ChAT神經(jīng)”))和/或P物質(zhì)(SP)的興奮性腸肌神經(jīng)元；和-釋放用于松弛的一氧化氮(被鑒定為一氧化氮合酶神經(jīng)元(NOS-1R))和/或血管活性腸肽(VIP)的抑制性腸肌神經(jīng)元。膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶EC2.3.1.6是一種在神經(jīng)元主體內(nèi)合成并轉(zhuǎn)移至神經(jīng)末端的酶。ChAT的作用是將乙酰輔酶A添加至膽堿，導(dǎo)致形成神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿。實(shí)驗(yàn)上，通過(guò)測(cè)定ChAT神經(jīng)元的數(shù)量來(lái)推斷對(duì)于乙酰膽堿產(chǎn)生的影響，通常，ChAT神經(jīng)數(shù)量增加提示乙酰膽堿增加。位于環(huán)狀肌和粘膜之間的粘膜下神經(jīng)叢含有主要參與調(diào)節(jié)腸上皮屏障(IEB)功能(例如細(xì)胞旁滲透性)的神經(jīng)元。具體地，粘膜下神經(jīng)叢中的腸神經(jīng)元激活通過(guò)釋放血管活性腸肽VIP而降低細(xì)胞旁滲透性，而乙酰膽堿(Ach)則提高細(xì)胞旁滲透性，構(gòu)成了由ENS微“調(diào)”腸上皮屏障滲透性的基礎(chǔ)。由此，關(guān)于細(xì)胞旁滲透性的神經(jīng)元調(diào)節(jié)，粘膜下神經(jīng)元釋放血管活性腸肽的增加提高了腸上皮屏障的完整性，而粘膜下神經(jīng)叢ChAT神經(jīng)元的增加則降低了腸上皮屏障IEB的電阻。盡管目前尚無(wú)法治愈腸易激綜合征，但有試圖緩解癥狀的治療方法，包括調(diào)整飲食、藥物治療以及心理干預(yù)。已報(bào)道益生菌、尤其是乳酸菌菌株有益于治療和/或預(yù)防腸易激綜合征。這樣的菌株的實(shí)例公開(kāi)在W02007/036230、W003/010297以及W02009/080800中。然而，這些菌株是根據(jù)其對(duì)免疫系統(tǒng)、對(duì)腸滲透性或?qū)δc微生物群的作用選擇的，而非根據(jù)其改善腸神經(jīng)系統(tǒng)功能的作用對(duì)菌株進(jìn)行篩選。W02008/064489揭示了使用益生菌阻斷中間電導(dǎo)鈣依賴性鉀電流，導(dǎo)致抗炎作用。W02007/132359揭示了乳酸桿菌(Lactobacillus)和大麻素受體激動(dòng)劑和/或阿片類受體拮抗劑在痛覺(jué)方面的應(yīng)用。W02006/032542揭示了乳酸桿菌用于止痛目的的用途。Kamm等(Kammetal,2004,Neurogastrointest.Motill6:53-60)揭不了布拉酵母菌(S.boulardii)對(duì)有降低豬空腸鈣結(jié)合蛋白_28k(CALB)的作用，但對(duì)于豬空腸的其他神經(jīng)兀標(biāo)志物無(wú)作用。Metugriachuk等(Metugriachuketal,2006,RejuvenationRes.9:342-345)揭示了共生菌制備物對(duì)老齡Wistar大鼠的小腸和大腸運(yùn)動(dòng)性的影響，其顯著增加小腸和結(jié)腸的肌電活性，增加血管活性腸肽的mRNA表達(dá)，但對(duì)血管活性腸肽濃度無(wú)顯著作用。因此，需要對(duì)腸神經(jīng)系統(tǒng)具有有益作用而用于腸易激動(dòng)綜合征、便秘和/或其他疾病的各益生菌菌株個(gè)體進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人應(yīng)用了新型模型系統(tǒng)用于篩選和選擇對(duì)于腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)具有改善作用的乳酸桿菌和雙歧桿菌菌株。該模型含有來(lái)自人結(jié)腸癌的腸上皮細(xì)胞(單)層，和位于所述單層的基底側(cè)上包含來(lái)自腸肌層和粘膜下神經(jīng)叢的神經(jīng)元的腸神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)物的混合物。使用該模型，可通過(guò)檢測(cè)在頂面或腔面添加這些組分對(duì)于基底側(cè)的血管活性腸肽(VIP)表達(dá)和/或ChAT釋放神經(jīng)的作用來(lái)評(píng)價(jià)食品級(jí)組分、特別是乳酸菌和雙歧桿菌菌株對(duì)于腸神經(jīng)系統(tǒng)的作用。因此，該模型允許篩選和選擇用于改善腸神經(jīng)系統(tǒng)功能的新型乳酸菌和雙歧桿菌菌株。這樣的菌株改善腸運(yùn)動(dòng)和蠕動(dòng)。使用某些菌株可減少腸運(yùn)輸時(shí)間，這可解決某些疾病，例如便秘。使用某些菌株可增加腸運(yùn)輸時(shí)間，這可解決某些疾病，例如腹瀉。增加血管活性腸肽的菌株還改善腸上皮屏障完整性。這樣的菌株尤其可用于預(yù)防和/或治療腸易激綜合征和/或便秘以及其他與腸神經(jīng)系統(tǒng)功能降低相關(guān)的疾病，并且在這些方面比現(xiàn)有菌株更有效。增加膽堿能表型、特別是ChAT神經(jīng)表達(dá)對(duì)于與結(jié)腸運(yùn)輸抑制相關(guān)的胃腸道病理具有治療意義。使用所選擇增強(qiáng)神經(jīng)元中膽堿能表達(dá)(即ChAT)作用增強(qiáng)的乳酸菌或雙歧桿菌對(duì)于便秘患者和患有IBS-C的患者具有治療意義。因此，本發(fā)明的一組乳酸菌或雙歧桿菌菌株有利地增加了ChAT神經(jīng)的數(shù)量，這標(biāo)志著對(duì)于腸運(yùn)動(dòng)具有改善作用，尤其對(duì)于腸易激綜合征有益，特別是IBS-C患者和患有便秘的患者。該組被稱為組B)。良好的運(yùn)動(dòng)需要大量的ChAT神經(jīng)，該神經(jīng)負(fù)責(zé)收縮并具有促運(yùn)動(dòng)作用。在該組的某些令人感興趣的實(shí)施方式中，由于優(yōu)選腸上皮屏障的功能和松弛肌肉的能力未被破壞，TEER水平未被降低。根據(jù)這些實(shí)施方式的亞組被稱為組B3)。增加的血管活性腸肽有益地改善胃腸道肌肉的松弛并改善腸神經(jīng)系統(tǒng)，這對(duì)于患有腸易激綜合征或炎癥性腸病(IBD)的患者有益，還對(duì)于老年人、嬰兒以及肥胖者有益。對(duì)于這些受試者，良好的腸神經(jīng)系統(tǒng)功能即便不是必要的，也是更好的。盡管患有腸易激綜合征或炎癥性腸病的患者過(guò)量分泌了諸如血管活性腸肽的神經(jīng)肽，但推斷這是腸神經(jīng)系統(tǒng)控制腸炎癥的適應(yīng)性反應(yīng)，以重建腸屏障功能和增加神經(jīng)保護(hù)。本發(fā)明的一組產(chǎn)乳酸菌菌株、特別是雙歧桿菌有利地增加血管活性腸肽。該組被稱為組A)。在一種實(shí)施方式中，ChAT水平未被增加。根據(jù)該實(shí)施方式的組被稱為組A3)。因此，ChAT水平可保持基本上不變或可降低。本文中所提及的所有菌株均根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于國(guó)際保藏單位法國(guó)國(guó)家微生物保藏中心(CNCM,“CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganisms，，，25RueduDocteurRoux,Paris)。使用選擇方法發(fā)現(xiàn)的屬于組B)的菌株為DN_154_0067(CNCM1-4320，2010年5月19日保藏)、DN_116_0047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)以及DN_119_0118(CNCM1-4279，2010年2月25日保藏)。屬于組A)的菌株為DN_173_010(CNCM1-2494,2000^6月20日保藏)、DN_156_0032(CNCM1-4321，2010年5月19日保藏)、DN_156_007(CNCM1-2219，1999年5月31日保藏)以及DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)。菌株DN_173_010(CNCM1-2494，2000年6月20日保藏)公開(kāi)在國(guó)際申請(qǐng)W002/02800中，菌株DN_156_007(CNCM1-2219，1999年5月31日保藏)公開(kāi)在國(guó)際申請(qǐng)W001/01785中。因此，包含這些所選擇的菌株中的至少一種菌株的組合物為本發(fā)明的一部分。優(yōu)選包含屬于組B)的至少一種菌株和屬于組A)的至少一種菌株的混合物的組合物。這樣的混合物有利地通過(guò)改善收縮和松弛而對(duì)于運(yùn)動(dòng)具有改善作用，另外還對(duì)于腸上皮屏障具有有利的作用。因此，根據(jù)一方面，本發(fā)明涉及包含至少一種菌株的組合物，所述菌株優(yōu)選選自乳酸桿菌和雙歧桿菌組成的組，所述組合物用于:A)提高腸神經(jīng)系統(tǒng)的血管活性腸肽(VIP)水平；或B)提高腸神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶免疫活性神經(jīng)元(ChAT)水平；或C)降低腸神經(jīng)系統(tǒng)的ChAT水平。根據(jù)一方面，本發(fā)明涉及包含選自下述菌株組成的組的至少一種菌株的組合物:-DN_156_0032(CNCM1-4321，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；-DN_156_007(CNCM1-2219，1999年5月31日保藏)[A)-A3)]；-DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；-DN_116_0047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)[B)-B3)]；-DN_154_0067(CNCM1-4320，2010年5月19日保藏)[B)-B3)];和-DN_119_0118(CNCM1-4279，2010年2月25日保藏)[B)-B3)]，所述組合物用于:-治療和/或預(yù)防腸道疾病，優(yōu)選治療和/或預(yù)防腸運(yùn)動(dòng)性疾??；或-治療和/或預(yù)防選自便秘和IBS-C組成的組的疾??；-治療和/或預(yù)防選自腹瀉、腸道感染、IBS-D、IBS-PI以及IBD組成的組的疾病；或-治療和/或預(yù)防選自IBS和IBD組成的組的疾病；或-治療和/或預(yù)防見(jiàn)于老年人、嬰兒或肥胖者的疾病。根據(jù)一方面，本發(fā)明涉及包含選自下述菌株組成的組的至少一種菌株的組合物:-DN_156_0032(CNCM1-4321，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；-DN_156_007(CNCM1-2219，1999年5月31日保藏)[A)-A3)]；-DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；-DN_116_0047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)[B)-B3)]；-DN_154_0067(CNCM1-4320，2010年5月19日保藏)[B)-B3)];和-DN_119_0118(CNCM1-4279，2010年2月25日保藏)[B)-B3)]，所述組合物用于施用于患有選自如下疾病組成的組的疾病:-便秘、IBS-C;-腹瀉、腸道感染、IBS-D、IBS-PI,IBD；-1BS,以及-見(jiàn)于老年人、嬰兒或肥胖者的疾病。根據(jù)一方面，本發(fā)明涉及上文所述的組合物，所述組合物用于改善胃腸運(yùn)動(dòng)、改善腸蠕動(dòng)和/或減少腸道滲透性。根據(jù)一方面，本發(fā)明涉及選自下述菌株組成的組的新菌株:-DN_156_0032(CNCM1-4321，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；-DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；-DN_116_0047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)[B)-B3)];和-DN_154_0067(CNCM1-4320，2010年5月19日保藏)[B)-B3)]。根據(jù)一方面，本發(fā)明涉及包含所述新菌株的組合物。根據(jù)一方面，本發(fā)明涉及一種組合物，所述組合物包含:-選自B)提高腸神經(jīng)系統(tǒng)中ChAT水平的乳酸桿菌和雙歧桿菌組成的組的至少一種菌株；和-選自A)提高腸神經(jīng)系統(tǒng)中血管活性腸肽(VIP)水平的乳酸菌和雙歧桿菌組成的組的至少一種菌株。根據(jù)一方面，本發(fā)明涉及一種選擇菌株的方法，所述方法包括如下步驟:a)設(shè)置腸上皮細(xì)胞和腸神經(jīng)元細(xì)胞的共培養(yǎng)物，其中所述腸上皮細(xì)胞作為單層存在，其中所述腸神經(jīng)元細(xì)胞存在于所述單層的基底側(cè)；b)將菌株添加至腸上皮細(xì)胞單層的頂面或腔面，優(yōu)選以每個(gè)上皮細(xì)胞約4至400個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的量添加；c)將所述共培養(yǎng)物與乳酸菌菌株一起溫育；d)優(yōu)選分離出神經(jīng)元細(xì)胞；以及e)檢測(cè)由神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生的VIP、ChAT、P物質(zhì)、一氧化氮神經(jīng)、ATP和/或垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(PACAP)的量，任選還檢測(cè)腸上皮細(xì)胞層的跨上皮電阻(TEER)。在該方法中，所述菌株優(yōu)選屬于乳酸桿菌和雙歧桿菌組成的組。具體實(shí)施例方式定義在本申請(qǐng)中，化合物或組合物的用途不僅旨在涵蓋用途自身，任選相關(guān)的意圖，而且還涵蓋具有商業(yè)或法律后果的與化合物或組合物相關(guān)的任何信息，例如廣告，組合物包裝上的說(shuō)明書或建議書，諸如傳單的商業(yè)載體上的說(shuō)明書或建議書，宣傳材料，廣告招貼，出于安全目的、療效目的或消費(fèi)者保護(hù)目的提交(例如，向諸如歐洲EFSA的管理機(jī)構(gòu)提交)以用于監(jiān)管注冊(cè)的文件。在本申請(qǐng)中，菌株的組是指表現(xiàn)特定的一種性質(zhì)或一組性質(zhì)的菌株。特定的菌株可由此屬于數(shù)個(gè)組。在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“或”具有非排他性。在本申請(qǐng)中，如果相對(duì)于對(duì)照的變化不超過(guò)10%、優(yōu)選1%，則認(rèn)為諸如VIP和/或ChAT的性質(zhì)相對(duì)于對(duì)照基本上沒(méi)有改變。優(yōu)選實(shí)施方式在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述組合物用于:A3)在不增加ChAT的前提下增加VIP;或B3)在不增加VIP，不降低腸上皮細(xì)胞層的電阻(TEER)的前提下增加ChAT;或C3)在不減少VIP的前提下減少ChAT;或C2)減少ChAT和減少VIP。例如，本發(fā)明的組合物可用于:-治療和/或預(yù)防腸道疾病，優(yōu)選治療和/或預(yù)防腸運(yùn)動(dòng)性疾??；或-治療和/或預(yù)防選自便秘和IBS-C組成的組的疾病；或-治療和/或預(yù)防選自腹瀉、腸道感染、IBS-D、IBS-PI以及IBD組成的組的疾??；或-治療和/或預(yù)防選自IBS和IBD組成的組的疾病；或-治療和/或預(yù)防見(jiàn)于老年人、嬰兒或肥胖者的疾病。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述組合物可:A)提高腸神經(jīng)系統(tǒng)的VIP水平，可用于治療和/或預(yù)防腸道疾病，優(yōu)選治療和/或預(yù)防腸運(yùn)動(dòng)性疾??；或B)提高腸神經(jīng)系統(tǒng)的ChAT水平，可用于治療和/或預(yù)防選自便秘和IBS-C組成的組的疾??；或C)降低腸神經(jīng)系統(tǒng)的ChAT水平，可用于治療和/或預(yù)防選自腹瀉、IBS-D、IBS-P1、IBD組成的組的疾病。所述菌株可例如選自如下菌株組成的組:-DN_173_010(CNCM1-2494，2000年6月20日保藏)[A)-A3)]；-DN_156_0032(CNCM1-4321，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；-DN_156_007(CNCM1-2219，1999年5月31日保藏)[A)-A3)]；-DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；-DN_116_0047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)[B)-B3)]；-DN_154_0067(CNCM1-4320，2010年5月19日保藏)[B)-B3)];和-DN_119_0118(CNCM1-4279，2010年2月25日保藏)[B)-B3)]。在一種實(shí)施方式中，所述菌株選自如下菌株組成的組:-DN_156_0032(CNCM1-4321，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；-DN_156_007(CNCM1-2219，1999年5月31日保藏)[A)-A3)];和-DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；且所述組合物用于:-治療和/或預(yù)防選自IBS和IBD組成的組的疾??；或-治療和/或預(yù)防見(jiàn)于老年人、嬰兒或肥胖者的疾病。在一種實(shí)施方式中，所述菌株選自如下菌株組成的組:-DN_116_0047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)[B)-B3)]；-DN_154_0067(CNCM1-4320，2010年5月19日保藏)[B)-B3)];和-DN_119_0118(CNCM1-4279，2010年2月25日保藏)[B)-B3)]，且所述組合物用于治療和/或預(yù)防選自便秘和IBS-C組成的組的疾病。在一種實(shí)施方式中，所述菌株選自如下菌株組成的組:-DN_156_0032(CNCM1-4321，2010年5月19日保藏)[A)_A3)]；-DN_156_007(CNCM1-2219，1999年5月31日保藏)[A)-A3)];和-DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]，且所述組合物用于:A)提高腸神經(jīng)系統(tǒng)的血管活性腸肽(VIP)水平，優(yōu)選用于A3)在不增加ChAT的前提下增加VIP。在該實(shí)施方式的特定實(shí)施方式中，所述組合物用于:-治療和/或預(yù)防選自IBS和IBD組成的組的疾??；或-治療和/或預(yù)防見(jiàn)于老年人、嬰兒或肥胖者的疾病。在一種實(shí)施方式中，所述菌株選自如下菌株組成的組:-DN_116_0047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)[B)_B3)]；-DN_154_0067(CNCM1-4320，2010年5月19日保藏)[B)_B3)];和-DN_119_0118(CNCM1-4279，2010年2月25日保藏)[B)-B3)]，且所述組合物用于:B)提高腸神經(jīng)系統(tǒng)的ChAT水平，優(yōu)選用于B3)在不增加VIP的前提下增加ChAT水平。在該實(shí)施方式的一種特定實(shí)施方式中，所述組合物用于治療和/或預(yù)防選自便秘和IBS-C組成的組的疾病。菌株的講一步細(xì)節(jié)如上所述，所述組合物包含至少一種或兩種特定菌株，優(yōu)選乳酸菌。它們優(yōu)選選自乳酸桿菌、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、乳球菌(Lactococcus)和鏈球菌(Streptococcus)屬組成的組。發(fā)現(xiàn)所述特定菌株能夠影響共培養(yǎng)物模型中的VIP水平和/或影響其中的ChAT神經(jīng)水平，所述模型表現(xiàn)腸和腸神經(jīng)系統(tǒng)之間的相互作用。使用下文更詳細(xì)描述的共培養(yǎng)物模型，在體外篩選具有這些性質(zhì)的乳酸菌或雙歧桿菌菌株。篩選了102株屬于乳酸桿菌、鏈球菌或雙歧桿菌屬的菌株。對(duì)ChAT具有增加作用的組B)菌株典型地改善腸運(yùn)動(dòng)。對(duì)ChAT具有增加作用的組B3)表現(xiàn)為特定優(yōu)選的實(shí)施方式，該組菌株排除了其中VIP未被增加(S卩，VIP基本上無(wú)變化或VIP被減少)的菌株。這些組的菌株典型地有益于治療和/或預(yù)防選自便秘和IBS-C組成的組的疾病。這可對(duì)于治療和/或預(yù)防見(jiàn)于老年人的疾病具有進(jìn)一步的特別意義，老年人常常會(huì)受到便秘的困擾。關(guān)于增加運(yùn)動(dòng)，增加ChAT表達(dá)的菌株是有利的。該特性似乎非常罕見(jiàn)。有趣的是，發(fā)現(xiàn)僅三種菌株在統(tǒng)計(jì)學(xué)上增加ChAT。這些被稱為組B)或組B3)菌株。組B)或組B3)菌株包括菌株DN_119_0118(CNCM1-4279，2010年2月25日保藏)、DN_154_0067(CNCM1-4320，2010年5月19日保藏)以及DN_116_0047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)。這些菌株有益地改善運(yùn)動(dòng)，尤其是收縮。優(yōu)選地，腸上皮細(xì)胞層的電阻(TEER)不被減少。這樣的性質(zhì)標(biāo)志著合適的屏障功能。菌株DN_119_0118(CNCM1-4279，2010年2月25日保藏)顯著降低了VIP水平，而其他兩種菌株對(duì)于VIP水平?jīng)]有顯著影響。由于VIP減少可對(duì)于IEB具有有害作用，使用具有腸上皮細(xì)胞單層的體外模型檢測(cè)與該菌株溫育是否導(dǎo)致跨上皮電阻(TEER)降低。結(jié)果證明并非如此，表明IEB功能未被破壞。關(guān)于肌肉松弛和IEB功能的再加強(qiáng)(這在IBS和IBD患者中是有益的)，增加VIP表達(dá)的菌株是有利的(所述菌株還具有抗炎作用)。這樣的菌株被稱為組A)菌株。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，組A)菌株不增加ChAT表達(dá)(B卩，ChAT疾病上無(wú)改變或ChAT未被減少)。這樣的菌株被稱為組A3)菌株。這些組的菌株典型地有益于治療和/或預(yù)防選自IBS和IBD組成的組的疾病，或治療和/或預(yù)防見(jiàn)于老年人、嬰兒或肥胖者的疾病。組A)或組A3)菌株包括菌株DN_173_010(CNCM1-2494，2000年6月20日保藏)，DN_156_0032(CNCM1-4321，2010年5月19日保藏)，DN_156_007(CNCM1-2219，1999年5月31日保藏)，DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)。有趣的是，注意到除了一個(gè)菌株DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)以外，所有具有該性質(zhì)的菌株為雙歧桿菌。此外，使用具有T84單層和跨上皮電阻(TEER)的另一種體外模型，發(fā)現(xiàn)特別是菌株DN_173_010(CNCM1-2494,2000年6月20日保藏)、DN_156_007(CNCM1-2219，1999年5月31日保藏)、DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)以及DN_156_0032(CNCM1-4321，2010年5月19日保藏)在LPS的存在下對(duì)IEB具有保護(hù)作用。因此，這些特定菌株尤其為優(yōu)選的。根據(jù)一種實(shí)施方式，所述菌株可降低腸神經(jīng)系統(tǒng)的ChAT水平。相應(yīng)組的菌株被稱為組C)。在一種特定的實(shí)施方式中，所述菌株使得減少ChAT，前提是VIP不被減少(即，VIP基本上不改變或VIP被增加)。該組被稱為組C3)。在一種特定的實(shí)施方式中，所述菌株使得在減少VIP的同時(shí)減少ChAT。這些菌株被稱為組C2)。組C3)的菌株典型地對(duì)于治療和/或預(yù)防選自腹瀉、IBS-D組成的組的疾病。這可對(duì)于治療和/或預(yù)防見(jiàn)于常會(huì)受到便秘困擾的老年人的疾病具有進(jìn)一步的特別意義。組C2)的菌株典型地有益于治療和/或預(yù)防選自腹瀉、IBS-D、IBS-PI以及IBD組成的組的疾病。這可對(duì)于治療和/或預(yù)防見(jiàn)于常會(huì)受到這些疾病，尤其是腹瀉困擾的老年人的疾病具有進(jìn)一步的特別意義。本發(fā)明還包括上述菌株的用途，以及衍生自任一親本菌株且仍對(duì)VIP具有活性和影響ChAT神經(jīng)的突變菌株或基因轉(zhuǎn)化菌株。這些突變菌株或基因轉(zhuǎn)化菌株可為其中親本菌株的一種或多種內(nèi)源性基因已被突變以例如修飾其某些代謝特性(即，其發(fā)酵糖的能力，其對(duì)于酸的抗性，其經(jīng)胃腸道運(yùn)輸?shù)拇婊盍Γ浜笏峄蚱浯x物產(chǎn)生)的菌株。它們還可為這樣的菌株，即，通過(guò)一種或多種感興趣的基因?qū)τH本菌株進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化以例如賦予所述菌株另外的生理特征，或使得其表達(dá)期望通過(guò)所述菌株而施用的具有治療或免疫意義的蛋白的菌株。優(yōu)選地，使用屬于組B)、優(yōu)選組B3)的至少一種菌株和屬于組A)、優(yōu)選組A3)的至少一種菌株的混合物。這樣的混合物有利地對(duì)于運(yùn)動(dòng)以及IEB具有改善作用。共培養(yǎng)模型和篩選測(cè)定在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種篩選乳酸菌菌株的方法，所述方法包括如下步驟:a)使用腸上皮細(xì)胞和腸神經(jīng)元細(xì)胞的共培養(yǎng)物，其中所述腸上皮細(xì)胞作為單層存在，其中所述腸神經(jīng)元細(xì)胞存在于所述單層的基底側(cè)；b)將乳酸菌添加至腸上皮細(xì)胞單層的頂面或腔面，優(yōu)選以每個(gè)上皮細(xì)胞約4至400個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的量添加；c)將所述共培養(yǎng)物與乳酸菌菌株一起溫育；d)優(yōu)選分離出所述神經(jīng)元細(xì)胞；以及e)檢測(cè)由所述神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生的VIP、ChAT,P物質(zhì)和一氧化氮、ATP、PACAP組成的組的至少一種神經(jīng)遞質(zhì)的量，任選還檢測(cè)腸上皮細(xì)胞層的跨上皮電阻(TEER)。與蠕動(dòng)反射一致，ENS含有由上升興奮性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和下降抑制性神經(jīng)元組成的固定回路(hardwiredcircuit),其中，所述上升興奮性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元釋放通過(guò)毒蕈堿性受體收縮平滑肌的乙酰膽堿和P物質(zhì)，所述下降抑制性神經(jīng)元釋放遞質(zhì)混合物，例如NO、ATP、VIP以及PACAP，所有這些遞質(zhì)都抑制環(huán)狀肌。細(xì)朐培養(yǎng)建立具有極化腸上皮細(xì)胞的單層的共培養(yǎng)物的合適方法在實(shí)施例1中有描述，且在J.Chevalieretal,2008，J.Physiol.5861963-1975中也有描述。所有形成單層的腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)物均是合適的，例如Caco-2、T84、HT29、以及TC7。優(yōu)選地，使用T84細(xì)胞。作為原代腸神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞，優(yōu)選細(xì)胞分離自非人的哺乳動(dòng)物胎兒、優(yōu)選嚙齒動(dòng)物、更優(yōu)選大鼠。優(yōu)選地，將所試驗(yàn)的菌株在合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至晚期指數(shù)期，并進(jìn)行洗滌。優(yōu)選地，以4至400個(gè)細(xì)菌/上皮細(xì)胞的量、更優(yōu)選以10至100個(gè)細(xì)菌/上皮細(xì)胞、甚至更優(yōu)選以30至50個(gè)細(xì)菌/上皮細(xì)胞的量將細(xì)菌添加至共培養(yǎng)物的頂面。優(yōu)選地，不添加細(xì)菌作為對(duì)照。優(yōu)選地，使用ImM丁酸或40mMKCl作為陽(yáng)性對(duì)照。優(yōu)選地，在約37°C下進(jìn)行溫育步驟。優(yōu)選地，溫育步驟耗時(shí)I至72h，更優(yōu)選2至36h,甚至更優(yōu)選4至12h。優(yōu)選地，在共溫育之后，移去含有上皮細(xì)胞和細(xì)菌的隔室(compartment)，并將原代神經(jīng)元細(xì)胞在含5%C02的濕度培養(yǎng)箱中溫育12至48h，更優(yōu)選20至28h。優(yōu)選地，使用免疫組織染色、使用抗神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)抗體對(duì)神經(jīng)元總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)和使用抗膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶抗體對(duì)ChAT神經(jīng)進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而檢測(cè)ChAT神經(jīng)和總神經(jīng)的數(shù)量。優(yōu)選地，在收集神經(jīng)元細(xì)胞和在蛋白酶抑制劑混合物存在下提取蛋白之后，通過(guò)ELISA檢測(cè)VIP。關(guān)于組合物的進(jìn)一步細(xì)節(jié)本發(fā)明包括允許上述用途或特性的菌株的組合物。本發(fā)明還包括包含一種或多種如下菌株(包括由其衍生的突變菌株或基因轉(zhuǎn)化菌株)的組合物:-DN_156_0032(CNCM1-4321,2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；-DN_156_007(CNCM1-2219，1999年5月31日保藏)[A)-A3)]；-DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)[A)_A3)]；-DN_116_0047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)[B)_B3)]；-DN_154_0067(CNCM1-4320，2010年5月19日保藏)[B)-B3)];和-DN_119_0118(CNCM1-4279，2010年2月25日保藏)[B)-B3)]，通常，當(dāng)將所述組合物體內(nèi)施用于受試者時(shí)，所述組合物用于:-治療和/或預(yù)防腸道疾病，優(yōu)選治療和/或預(yù)防腸運(yùn)動(dòng)性疾??；或-治療和/或預(yù)防選自便秘和IBS-C組成的組的疾病；或-治療和/或預(yù)防選自腹瀉、腸道感染、IBS-D、IBS-PI以及IBD組成的組的疾?。换騚-治療和/或預(yù)防選自IBS和IBD組成的組的疾?。换?治療和/或預(yù)防見(jiàn)于老年人、嬰兒或肥胖者的疾病。在本發(fā)明的組合物中，所述菌株可以以活菌或非活菌的完整細(xì)菌形式使用?？蛇x地，它們可以以細(xì)菌裂解物或以細(xì)菌級(jí)分(bacterialfraction)的形式使用；可通過(guò)例如檢測(cè)其緩解對(duì)本發(fā)明描述的共培養(yǎng)物模型的VIP水平和ChAT水平的作用的特性而選擇適于該應(yīng)用的細(xì)菌級(jí)分。優(yōu)選地，所述細(xì)菌細(xì)胞作為有活力的活細(xì)胞存在。本發(fā)明的組合物可為適于施用、特別是口服施用的任何形式。這包括例如固體、半固體、液體以及粉末。由于較易于施用，例如作為飲料施用，通常優(yōu)選液體組合物。所述組合物可包含例如每克干重至少IO5Cfu、優(yōu)選至少IxlO6Cfu的至少一種菌株，優(yōu)選上述菌株。這些菌株優(yōu)選選自乳酸桿菌和雙歧桿菌組成的組。當(dāng)細(xì)菌為活菌形式時(shí)，所述組合物通?？砂靠烁芍亟M合物IO5至IO13菌落形成單位(cfu),優(yōu)選至少106cfu,更優(yōu)選至少107cfu,還更優(yōu)選至少108cfu,最優(yōu)選至少109cfu。在液體組合物的情況下，這通常對(duì)應(yīng)于每ml為IO4至IO12菌落形成單位(cfu)，優(yōu)選至少105cfu,更優(yōu)選至少106cfu,還更優(yōu)選至少107cfu,最優(yōu)選至少109cfu/ml。本發(fā)明的組合物的實(shí)例為營(yíng)養(yǎng)組合物，包括食品，特別是乳制品。所述組合物可為例如乳制品，優(yōu)選發(fā)酵乳制品。以發(fā)酵乳制品形式的施用具有低乳糖水平的額外優(yōu)點(diǎn)，這對(duì)于腸易激綜合征具有進(jìn)一步的益處。任選地，可存在其他乳酸菌菌株。所述發(fā)酵制品可以以液體存在，或以通過(guò)干燥發(fā)酵液體而獲得的干粉形式存在。優(yōu)選地，所述發(fā)酵制品為新鮮制品。未經(jīng)嚴(yán)格熱處理步驟的新鮮制品的優(yōu)點(diǎn)是所存在的菌株為活體形式。優(yōu)選地，所述發(fā)酵制品為乳制品，更優(yōu)選地，為發(fā)酵乳和/或發(fā)酵乳清。優(yōu)選地，所述營(yíng)養(yǎng)組合物為固定、攪拌或可飲用形式的酸乳或發(fā)酵乳。優(yōu)選地，所述發(fā)酵制品為乳酪。優(yōu)選地，所述發(fā)酵制品為發(fā)酵的植物產(chǎn)品，例如固定、攪拌或可飲用形式的發(fā)酵大豆、谷物和/或水果。優(yōu)選地，本發(fā)明的營(yíng)養(yǎng)組合物為嬰兒食品，嬰兒配方乳或較大嬰兒配方乳。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物為營(yíng)養(yǎng)食品或藥品、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑或醫(yī)用食品。本發(fā)明的營(yíng)養(yǎng)組合物還包括食物補(bǔ)充劑以及功能性食物?！笆澄镅a(bǔ)充劑”是指由通常用于食品的化合物制成，但為片劑、粉末、膠囊、飲劑或通常與食物無(wú)關(guān)的任何其他形式，且對(duì)健康具有益處的產(chǎn)品?！肮δ苄允澄铩币彩菍?duì)健康有益處的食物。特別地，食物補(bǔ)充劑和功能性食物可具有對(duì)抗疾病(例如慢性疾病)保護(hù)性或治愈性的生理作用。優(yōu)選包含增加ChAT神經(jīng)的至少一種乳酸菌或雙歧桿菌菌株和提高VIP水平的至少一種乳酸菌或雙歧桿菌菌株的混合物的組合物。這樣的混合物有利地對(duì)運(yùn)動(dòng)及IEB具有改善作用。優(yōu)選屬于組B)、優(yōu)選B3)的至少一種菌株和屬于組A)、優(yōu)選A3)的至少一種菌株的混合物。這樣的混合物有利地對(duì)運(yùn)動(dòng)及IEB具有改善作用。因此，本發(fā)明還涉及包含如下的組合物:選自如下菌株組成的組的至少一種菌株:-DN_116_0047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)[B)-B3)]；-DN_154_0067(CNCM1-4320，2010年5月19日保藏)[B)-B3)];和-DN_119_0118(CNCM1-4279，2010年2月25日保藏)[B)-B3)]，以及選自如下菌株組成的組的至少一種菌株:-DN_173_010(CNCM1-2494，2000年6月20日保藏)[A)-A3)]；-DN_156_0032(CNCM1-4321，2010年5月19日保藏)[A)_A3)]；-DN_156_007(CNCM1-2219，1999年5月31日保藏)[A)-A3)];和-DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]。本發(fā)明的組合物還可包含一種或多種益生或非益生性的其他乳酸菌菌株，例如選自乳酸桿菌、乳球菌、鏈球菌以及雙歧桿菌屬的一種或多種菌株。特別地，所述其他菌株可包括一種或多種嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)菌株和/或一種或多種保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillusbulgaricus)菌株。在一種實(shí)施方式中，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的菌株增加ChAT神經(jīng)的數(shù)量。膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶EC2.3.1.6是一種在神經(jīng)元主體內(nèi)合成并轉(zhuǎn)移至神經(jīng)末端的酶。ChAT的作用是將乙酰輔酶A添加至膽堿，導(dǎo)致形成神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿。其用作運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的免疫組織化學(xué)標(biāo)志物。對(duì)于ChAT神經(jīng)的作用導(dǎo)致收縮改善，從而導(dǎo)致蠕動(dòng)改善。因此，有利地施用本發(fā)明能夠增加ChAT神經(jīng)的菌株和組合物，以改善ENS，改善或增強(qiáng)蠕動(dòng)，改善腸運(yùn)動(dòng)和/或減少胃腸道運(yùn)輸時(shí)間。增加膽堿能表型在與抑制結(jié)腸運(yùn)輸相關(guān)的胃腸病理中具有治療意義。特別地，多種研究已經(jīng)顯示緩慢的運(yùn)輸可與ChAT神經(jīng)元的表達(dá)減少相關(guān)。特別地，(i)嚴(yán)重便秘患者通常具有較低的ChAT神經(jīng)數(shù)量，(ii)在感染和感染后(PI)的過(guò)程中，腸肌層ACh的產(chǎn)生顯著減少，(iii)已報(bào)道在衰老過(guò)程中，膽堿能神經(jīng)元的比例降低。在本文中，使用菌株、優(yōu)選乳酸菌或雙歧桿菌菌株以增強(qiáng)神經(jīng)元中的膽堿能表達(dá)可以在未來(lái)對(duì)于嚴(yán)重便秘患者和IBS-C具有治療意義。因此，有利地將本發(fā)明的菌株和組合物施用于患有IBS-C和/或便秘的患者。最有用的菌株為上述的組B)或B3)菌株。在一種特定的實(shí)施方式中，由老年人或?yàn)槔夏耆耸褂帽景l(fā)明的菌株和組合物。本發(fā)明所述的老年人被定義為年齡超過(guò)65歲、優(yōu)選超過(guò)70歲、優(yōu)選超過(guò)75歲、優(yōu)選超過(guò)80歲、優(yōu)選超過(guò)85歲的人。通常老年人位于結(jié)腸、最優(yōu)選橫結(jié)腸的腸神經(jīng)系統(tǒng)中的ChAT神經(jīng)元的數(shù)量減少。因此，有利地，施用本發(fā)明的菌株和組合物以治療和/或預(yù)防老年人的IBS、優(yōu)選IBS-C和/或便秘。能夠增加ChAT神經(jīng)的菌株為組B)，例如DN_154_0067(CNCM1-4320,2010年5月19日保藏)，DN_116_0047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)，以及DN_119_0118(CNCM1-4279，2010年2月25日保藏)。優(yōu)選地，它們不減少VIP，原因是VIP是良好的IEB功能和胃腸道松弛(諸如蠕動(dòng)的胃腸運(yùn)動(dòng)的另一重要部分)所必需的。符合該標(biāo)準(zhǔn)的菌株為DN_154_0067(CNCM1-4320，2010年5月19日保藏)和DN_116_0047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)。然而，如TEER試驗(yàn)所確定的，由于TEER并未降低，因此，菌株DN_119_0118(CNCM1-4279，2010年2月25日保藏)對(duì)IEB功能沒(méi)有負(fù)面影響。在一種實(shí)施方式中，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的菌株提高VIP水平。對(duì)于消化系統(tǒng)，VIP誘導(dǎo)平滑肌松弛(低位食管括約肌、胃、膽囊)，刺激水分泌至胰液和膽汁中，并導(dǎo)致胃酸分泌和腸腔吸收的抑制。其在腸中的作用是大大刺激水和電解質(zhì)分泌，擴(kuò)張腸平滑肌，擴(kuò)張外周血管，刺激胰腺碳酸氫鹽分泌，以及抑制胃泌素刺激的胃酸分泌。這些作用一起發(fā)揮以增加運(yùn)動(dòng)性。因此，該發(fā)現(xiàn)標(biāo)志著這些菌株對(duì)于腸運(yùn)動(dòng)、尤其是運(yùn)動(dòng)的松弛部分具有改善作用。VIP還有益地增加IEB功能。因此，有利地，施用本發(fā)明的菌株和組合物以改善ENS，改善或增強(qiáng)蠕動(dòng)，減少滲透性，改善腸運(yùn)動(dòng)和/或減少胃腸道運(yùn)輸時(shí)間。因此，有利地，施用本發(fā)明的菌株和組合物以用于如下疾病或患有如下疾病的患者:-治療和/或預(yù)防腸道疾病，優(yōu)選治療和/或預(yù)防腸運(yùn)動(dòng)性疾??；或-治療和/或預(yù)防選自便秘和IBS-C組成的組的疾?。换?治療和/或預(yù)防選自腹瀉、腸道感染、IBS-D、IBS-PI以及IBD組成的組的疾病；或-治療和/或預(yù)防選自IBS和IBD組成的組的疾病；或-治療和/或預(yù)防見(jiàn)于老年人、嬰兒或肥胖者的疾病。最有用的菌株為上述組A)或A3)的菌株。本發(fā)明的細(xì)節(jié)或優(yōu)點(diǎn)可見(jiàn)于下文的非限制性實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)施例1:在包含上皮細(xì)胞和腸神經(jīng)元細(xì)胞的共培養(yǎng)物模型中篩選益生菌細(xì)胞培養(yǎng)物購(gòu)買懷孕Sprague-Dawley大鼠(CERJ,LeGenestStIsle,FranceandJanvier-BreedingCenter,Belgium),通過(guò)過(guò)量CO2之后割斷頸動(dòng)脈處死。取出胚胎(每次從3只懷孕大鼠分離35-45個(gè))并通過(guò)斷頭處死。取出胚胎的小腸，在HBSS(Sigma,France)中細(xì)切。將組織切片收集在5ml培養(yǎng)基(DMEM-F12I=I培養(yǎng)基)并在0.1%胰蛋白酶(Sigma)中于37°C消化15min。通過(guò)添加含有10%胎牛血清的IOml培養(yǎng)基終止胰蛋白酶反應(yīng)，然后通過(guò)DNA酶1(0.01%，Sigma)于37°C處理lOmin。使用IOml吸液管打碎之后，在750r.p.m.離心細(xì)胞lOmin。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后以2.4xl05個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于預(yù)先使用于無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中的明膠溶液(0.5%，Sigma)包被6h的24孔板上。24h之后，將培養(yǎng)基替換為無(wú)血清培養(yǎng)基(DMEM-F12(1:1)，含有1%N_2添加劑(Lifetechnologies，F(xiàn)rance))。將細(xì)胞在培養(yǎng)物中培養(yǎng)14天，以獲得腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)的原代培養(yǎng)物。每隔一天更換一半培養(yǎng)基。在第14天，原代神經(jīng)元細(xì)胞即可用于建立共培養(yǎng)物模型。在補(bǔ)充有10%熱滅活FBS和50IU/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的DMEM-F12(1:1,GIBC0)中培養(yǎng)T84細(xì)胞系(EATCC)。在12孔TransweHφ過(guò)濾器(Corning,NYUSA)中以2xl05個(gè)細(xì)胞/插入片接種細(xì)胞，并培養(yǎng)以達(dá)到匯合。在上皮細(xì)胞達(dá)到匯合之后I天，將Transweir'過(guò)濾器轉(zhuǎn)移至底部接種有腸神經(jīng)元細(xì)胞的12孔培養(yǎng)板中。在上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)上皮細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞。菌株培養(yǎng)對(duì)于雙歧桿菌和乳酸桿菌，在TGYH中培養(yǎng)細(xì)菌16小時(shí)(但菌株DN_173_010(CNCM1-2494，2000年6月20日保藏)在MRS+半胱氨酸培養(yǎng)基中培養(yǎng))，在PBS洗滌兩次，調(diào)整至4.108cfu/ml,以恒定地將相同體積的細(xì)菌懸浮液添加至過(guò)濾器。以40個(gè)細(xì)菌/上皮細(xì)胞的MOI將菌株添加至過(guò)濾器隔室。將不添加細(xì)菌作為對(duì)照。在共溫育8小時(shí)之后，去除含有上皮細(xì)胞和細(xì)菌的過(guò)濾器隔室，在含有5%C02的濕度培養(yǎng)箱中溫育原代神經(jīng)元細(xì)胞24h。在對(duì)照孔中，當(dāng)進(jìn)行ChAT和VIP檢測(cè)時(shí)，分別使用ImM丁酸和40mMKCl刺激神經(jīng)元細(xì)胞。免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)ChAT神經(jīng)在溫育之后，進(jìn)行免疫組織化學(xué)以檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞群。在細(xì)胞固定之后(在室溫下于含有4%甲醛的0.1MPBS中Ih)，于PBS中洗滌細(xì)胞3次，然后于含有0.5%TritonX-100和4%馬血清的PBS/NaN3中透化30分鐘。初級(jí)抗體:將兔抗神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)抗體(1:2000;Biovalley,France)和兔抗膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶抗體稀釋于含有0.5%TritonX-100以及4%馬血清的PBS/NaN3中，室溫下過(guò)夜溫育。在使用初級(jí)抗血清溫育之后，使用PBS洗滌細(xì)胞3次，使用分別偶聯(lián)有熒光素異硫氰酸酯(FITC)(l:200Immunotech,France)和7-氨基-4-甲基-香豆素-3-乙酸酯的驢抗兔IgG溫育3h。在通過(guò)幀接收器卡(ScionImage,SLMicrotest),在連接于macintosh計(jì)算機(jī)的配備有黑白攝影機(jī)(Mod.4910,CohuInc,Germany)的Olympus1X50突光顯微鏡下觀察樣品。VIP檢測(cè)對(duì)于VIP檢測(cè)，從12孔培養(yǎng)板收集神經(jīng)元細(xì)胞，使用含有蛋白酶抑制劑混合物(RocheDiagnostics,France)的RIPA裂解緩沖液(MiIlipore,France)提取蛋白，通過(guò)ELISA(Bachem,Germany)檢測(cè)VIP水平。結(jié)果表I顯示了在包括乳酸菌和雙歧桿菌的102種益生菌菌株中的某些菌株相互作用后原代腸神經(jīng)對(duì)于VIP和ChAT標(biāo)志物的差異反應(yīng)。僅顯示了屬于組A3)或B3)或C3)的某些菌株。另外，還注意到，26種菌株對(duì)于VIP和ChAT無(wú)顯著作用(包括長(zhǎng)雙歧桿菌菌株NCC2705(BifidobacteriumlongumNCC2705,CNCM1-2618)，鼠李糖乳酸桿菌GG(LactobacillusrhamnosusGG,ATCC53103)以及干釀乳酸桿菌代田株(LactobacilluscaseiShirota)),屬于組C2)的11種菌株顯示減少VIP和ChAT(包括Alfa-Wass的長(zhǎng)雙歧桿菌Wll(LMGP-21586))，10種菌株減少VIP且對(duì)ChAT無(wú)作用(包括基準(zhǔn)菌株嬰兒雙歧桿菌UCC3564(BifidobacteriuminfantisUCC3564)、長(zhǎng)雙歧桿菌Bb536、動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種Bbl2(BifidobacteriumanimalisspplactisBbl2,DSM15954)以及動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種B1-07(ATCCSD5220)，屬于組C3)的41種菌株減少ChAT且對(duì)VIP無(wú)作用，包括菌株約氏乳酸桿菌Lal(LactobacillusjohnsoniiLai,CNCM1-1225)、植物乳酸桿菌299v(Lactobacillusplantarum299v,DSM9843),羅伊氏乳酸桿菌SD2122(LactobacillusreuteriSD2122,ATCC55730)。表1:與乳酸桿菌和雙歧桿菌溫育對(duì)具有上皮細(xì)胞單層和原代ENS細(xì)胞的共培養(yǎng)物模型中的VIP和ChAT水平的影響權(quán)利要求1.包含至少一種菌株的組合物，所述菌株優(yōu)選選自乳酸桿菌(Iactobacilli)和雙歧桿菌(bifidobacteria),所述組合物用于:A)提高腸神經(jīng)系統(tǒng)的血管活性腸肽(VIP)水平；或B)提高腸神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶免疫活性神經(jīng)元(ChAT)水平；或C)降低腸神經(jīng)系統(tǒng)的ChAT水平。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其用于:A3)在不增加ChAT的前提下增加VIP;或B3)在不增加VIP，優(yōu)選也不增加腸上皮細(xì)胞層的電阻(TEER)的前提下增加ChAT;或C3)在不減少VIP的前提下減少ChAT;或C2)減少ChAT和減少VIP。3.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其進(jìn)一步用于:-治療和/或預(yù)防腸道疾病，優(yōu)選治療和/或預(yù)防腸運(yùn)動(dòng)性疾??；或-治療和/或預(yù)防選自便秘和IBS-C的疾?。换?治療和/或預(yù)防選自腹瀉、腸道感染、IBS-D、IBS-PI和IBD的疾??；或-治療和/或預(yù)防選自IBS和IBD的疾??；或-治療和/或預(yù)防見(jiàn)于老年人、嬰兒和肥胖者的疾病。4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物:A)提高腸神經(jīng)系統(tǒng)的VIP水平，用于治療和/或預(yù)防腸道疾病，優(yōu)選治療和/或預(yù)防腸運(yùn)動(dòng)性疾??；或B)提高腸神經(jīng)系統(tǒng)的ChAT水平，用于治療和/或預(yù)防選自便秘和IBS-C的疾?。换駽)降低腸神經(jīng)系統(tǒng)的ChAT水平，用于治療和/或預(yù)防選自腹瀉、IBS-D、IBS-P1、IBD的疾病。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物:A3)在不增加ChAT的前提下增加VIP，且所述組合物用于:-治療和/或預(yù)防選自IBS和IBD的疾??；或-治療和/或預(yù)防見(jiàn)于老年人、嬰兒或肥胖者的疾病。6.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物:B3)在不增加VIP，優(yōu)選也不減少腸上皮細(xì)胞層的電阻(TEER)的前提下增加ChAT，且所述組合物用于治療和/或預(yù)防選自便秘和IBS-C的疾病。7.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物:C3)在不減少VIP的前提下減少ChAT，且所述組合物用于治療和/或預(yù)防選自便秘和IBS-C的疾病。8.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物:C2)減少ChAT和減少VIP，且所述組合物用于治療和/或預(yù)防選自腹瀉、腸道感染、IBS-D、IBS-PI以及IBD的疾病。9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述菌株選自如下菌株組成的組:-DN_173_010(CNCM1-2494，2000年6月20日保藏)；-DN_156_0032(CNCM1-4321，2010年5月19日保藏)；-DN_156_007(CNCM1-2219，1999年5月31日保藏)；-DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)；-DN_116_047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)；-DN_154_0067(CNCM1-4320，2010年5月19日保藏)；以及-DN_119_0118(CNCM1-4279，2010年2月25日保藏)。10.組合物，其包含選自如下菌株中至少一種菌株:-DN_156_0032(CNCM1-4321，2010年5月19日保藏)；-DN_156_007(CNCM1-2219，1999年5月31日保藏)；-DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)；-DN_116_047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)；-DN_154_0067(CNCM1-4320，2010年5月19日保藏)；以及-DN_119_0118(CNCM1-4279，2010年2月25日保藏)，所述組合物用于:-治療和/或預(yù)防腸道疾病，優(yōu)選治療和/或預(yù)防腸運(yùn)動(dòng)性疾病；或-治療和/或預(yù)防選自便秘和IBS-C的疾?。换?治療和/或預(yù)防選自腹瀉、腸道感染、IBS-D、IBS-PI以及IBD的疾?。换?治療和/或預(yù)防選自IBS和IBD的疾??；或-治療和/或預(yù)防見(jiàn)于老年人、嬰兒或肥胖者的疾病。11.組合物，其包含選自如下菌株中的至少一種菌株:-DN_156_0032(CNCM1-4321，2010年5月19日保藏)；-DN_156_007(CNCM1-2219，1999年5月31日保藏)；-DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)；-DN_116_047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)；-DN_154_0067(CNCM1-4320，2010年5月19日保藏)；以及-DN_119_0118(CNCM1-4279，2010年2月25日保藏)，所述組合物用于施用于患有選自如下疾病的受試者:-便秘，IBS-C；-腹瀉、腸道感染、IBS-D、IBS-PI以及IBD；-1BS，以及-見(jiàn)于老年人、嬰兒或肥胖者的疾病。12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的組合物，其中所述菌株選自如下菌株組成的組:-DN_156_0032(CNCM1-4321，2010年5月19日保藏)；-DN_156_007(CNCM1-2219，1999年5月31日保藏)；以及-DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)，所述組合物用于:-治療和/或預(yù)防選自IBS和IBD的疾??；或-治療和/或預(yù)防見(jiàn)于老年人、嬰兒或肥胖者的疾病。13.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的組合物，其中所述菌株選自如下菌株組成的組:-DN_116_047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)；-DN_154_0067(CNCM1-4320，2010年5月19日保藏)；以及-DN_119_0118(CNCM1-4279，2010年2月25日保藏)，所述組合物用于治療和/或預(yù)防選自便秘和IBS-C的疾病。14.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的組合物，所述組合物包含選自如下菌株中的至少一種菌株:-DN_156_0032(CNCM1-4321，2010年5月19日保藏)；-DN_156_007(CNCM1-2219，1999年5月31日保藏)；以及-DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)，所述組合物用于:A)提高腸神經(jīng)系統(tǒng)的血管活性腸肽(VIP)水平，優(yōu)選用于A3)在不增加ChAT的前提下增加VIP。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其用于:-治療和/或預(yù)防選自IBS和IBD的疾?。换?治療和/或預(yù)防見(jiàn)于老年人、嬰兒或肥胖者的疾病。16.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的組合物，其包含選自如下菌株中的至少一種菌株:-DN_116_047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)；-DN_154_0067(CNCM1-4320，2010年5月19日保藏)；以及-DN_119_0118(CNCM1-4279，2010年2月25日保藏)，所述組合物用于:B)提高腸神經(jīng)系統(tǒng)的ChAT水平，優(yōu)選B3)在不提高VIP的前提下提高ChAT水平。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其用于治療和/或預(yù)防選自便秘和IBS-C的疾病。18.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其用于改善胃腸運(yùn)動(dòng)性、改善腸蠕動(dòng)和/或減少腸道滲透性。19.選自如下菌株:-DN_156_0032(CNCM1-4321，2010年5月19日保藏)；-DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)；-DN_116_047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)；以及-DN_154_0067(CNCM1-4320，2010年5月19日保藏)。20.組合物，其包含權(quán)利要求19所述的至少一種菌株。21.組合物，其包含:-選自B)提高腸神經(jīng)系統(tǒng)ChAT水平的乳酸桿菌和雙歧桿菌中的至少一種菌株；和-選自A)提高腸神經(jīng)系統(tǒng)血管活性腸肽(VIP)水平的乳酸桿菌和雙歧桿菌中的至少一種菌株。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其包含:-選自如下菌株中的至少一種菌株:-DN_116_047(CNCM1-4317，2010年5月19日保藏)；-DN_154_0067(CNCM1-4320，2010年5月19日保藏)；以及-DN_119_0118(CNCM1-4279，2010年2月25日保藏)，和-選自如下菌株中的至少一種菌株:-DN_173_010(CNCM1-2494，2000年6月20日保藏)；-DN_156_0032(CNCM1-4321，2010年5月19日保藏)；-DN_156_007(CNCM1-2219，1999年5月31日保藏)；以及-DN_121_0304(CNCM1-4318，2010年5月19日保藏)。23.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物為乳制品，優(yōu)選為發(fā)酵乳制品。24.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物每克干重包含至少105cfu、優(yōu)選至少IxlO6Cfu的選自乳酸桿菌和雙歧桿菌的至少一種菌株。25.一種選擇菌株的方法，所述方法包括如下步驟:a)設(shè)置腸上皮細(xì)胞和腸神經(jīng)元細(xì)胞的共培養(yǎng)物，其中所述腸上皮細(xì)胞作為單層存在，其中所述腸神經(jīng)元細(xì)胞存在于所述單層的基底側(cè)；b)將菌株添加至腸上皮細(xì)胞單層的頂面或腔面，優(yōu)選以每個(gè)上皮細(xì)胞約4至400個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的量添加；c)將所述共培養(yǎng)物與乳酸菌菌株一起溫育；d)優(yōu)選分離出神經(jīng)元細(xì)胞；以及e)檢測(cè)由神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生的VIP、ChAT、P物質(zhì)、一氧化氮神經(jīng)、PACAP和/或ATP的量，任選還檢測(cè)腸上皮細(xì)胞層的跨上皮電阻(TEER)。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法,其中所述菌株屬于乳酸桿菌和雙歧桿菌。全文摘要本發(fā)明涉及乳酸菌的用途，其用于改善腸神經(jīng)系統(tǒng)，更特別地用于治療和/或預(yù)防諸如便秘和/或易激性腸病的腸道疾病。文檔編號(hào)A61P1/12GK103209698SQ201180036975公開(kāi)日2013年7月17日申請(qǐng)日期2011年5月27日優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日發(fā)明者索菲·勒格蘭-拉斯波,詹弗蘭科·格龍波內(nèi),桑德蘭·卡普羅尼耶,伊莎貝爾·尚博,塔瑪拉·什莫克維納,瑪麗-克里斯蒂娜·德吉弗里,比里亞納·萊西奇,米歇爾·伊諾恩利斯特申請(qǐng)人:熱爾韋·達(dá)諾尼公司