專利名稱：具有抗紫外輻射功能的小球藻類金屬硫蛋白的實(shí)驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗紫外輻射功能的小球藻類金屬硫蛋白的實(shí)驗(yàn)方法。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代生活水平的提高，人們越來越關(guān)注紫外輻射的問題。越來越多的抗紫外輻射化妝品也隨之誕生。目前市場上抗紫外輻射的產(chǎn)品其主要成分為多糖類、多酚類、黃酮類、膠原蛋白和植物蛋白(如藻藍(lán)蛋白)等?？棺贤廨椛涞脑囼?yàn)可采用動(dòng)物模型，如文鏡在《營養(yǎng)學(xué)報(bào)》2001，23 (1):44_47報(bào)道的給小白鼠連續(xù)灌胃金屬硫蛋白(MT)30天后分別接受7 Gy、8 Gy 60Co-Y 一次性輻照或每周一次I Gy小劑量連續(xù)8次福照,通過采血測定白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等指標(biāo)以判斷金屬硫蛋白是否具有抗紫外輻射的作用，發(fā)現(xiàn)口服MT具有一定的抗紫外輻射功能。這種直接通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法，準(zhǔn)確性高，但測試過程繁瑣。抗紫外輻射的另一種試驗(yàn)方法是采用活體細(xì)胞模型。例如，Takeshi Saito在 Japanese Journal of Ophthalmology, 54(5):486-493中報(bào)道的通過建立Lens Epithelial細(xì)胞模型來研究金屬硫蛋白的抗紫外福射作用。與此類似的方法如黃敏鈞在《廣東茶業(yè)》，2010，4:30-33中報(bào)道的通過NIH/3T3細(xì)胞模型研究了普洱茶的抗紫外輻射作用。研究表明，用細(xì)胞模型進(jìn)行抗紫外輻射試驗(yàn)具有簡便、準(zhǔn)確和快速等優(yōu)點(diǎn)。迄今已發(fā)現(xiàn)許多藻類多糖具有抗紫外輻射的功能，但是對藻類蛋白的抗紫外輻射研究還較少涉及，特別是藻類類金屬硫蛋白的抗紫外輻射功能還未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗紫外輻射功能的小球藻類金屬硫蛋白的實(shí)驗(yàn)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:
本發(fā)明是一種具有抗紫外輻射功能的小球藻類金屬硫蛋白的實(shí)驗(yàn)方法，它包括以下步
驟:
(1)活體細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化3-8 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞；
(2)在24孔板中各加入0.3 mL細(xì)胞懸浮液，于37°C及5% CO2氣氛的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24
h ；
(3)取出24孔板，此時(shí)細(xì)胞完全貼壁，棄上清液，加入以pH7.4的PBS為介質(zhì)的小球藻類金屬硫蛋白制品0.3 mL,在距離紫外燈管25 cm處福射0_9 J/cm2 ；
(4)棄上清液，加入37°C預(yù)熱的新鮮DMEM培養(yǎng)基并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h ；
(5)棄上清液，往各孔加入2mg/mL的MTT溶液0.1 mL,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，加入0.5 mLDMSO溶液，充分溶解后各取0.2 mL溶液放入96孔板中，用酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度值；(6)以pH 7.4的PBS溶液0.3 mL替代小球藻類金屬硫蛋白制品進(jìn)行對照試驗(yàn),通過比較試驗(yàn)組和對照組的吸光度值說明小球藻類金屬硫蛋白的抗紫外輻射能力。所述的小球藻類金屬硫蛋白的試驗(yàn)濃度范圍為1.25 10 mg/mL。所述的活體細(xì)胞為NIH/3T3細(xì)胞，它包括以下步驟:
(I )NIH/3T3細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化3 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞；
(2)在24孔板中各加入0.3 mL細(xì)胞懸浮液，于37°C及5% CO2氣氛的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24
h ；
(3)取出24孔板，此時(shí)細(xì)胞完全貼壁，棄上清液，加入以pH7.4的PBS為介質(zhì)的小球藻類金屬硫蛋白制品0.3 mL,在距離紫外燈管25 cm處福射6 J/cm2 ；
(4)棄上清液，加入37°C預(yù)熱的新鮮DMEM培養(yǎng)基并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h ；
(5)棄上清液，往各孔加入2mg/mL的MTT溶液0.1 mL,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，加入0.5 mLDMSO溶液，充分溶解后各取0.2 mL溶液放入96孔板中，用酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度值；
(6)以pH7.4的PBS溶液0.3 mL替代小球藻類金屬硫蛋白制品進(jìn)行對照試驗(yàn)。通過比較試驗(yàn)組和對照組的吸光度值說明小球藻類金屬硫蛋白的抗紫外輻射能力。所述的活體細(xì)胞為HaCaT細(xì)胞，它包括以下步驟:
(I )HaCaT細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化8 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞；`
(2)在24孔板中各加入0.3 mL的細(xì)胞懸浮液，于37°C及5% CO2氣氛的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞完全貼壁；
(3)取出24孔板，棄上清液，加入以pH7.4的PBS為介質(zhì)的小球藻類金屬硫蛋白制品
0.3 mL,在距離紫外燈管25 cm處福射3 J/cm2;
(4)棄上清液，加入37°C預(yù)熱的新鮮DMEM培養(yǎng)基并放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12h ；
(5)棄上清液，各加入2mg/mL的MTT溶液0.1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，加入0.5 mL DMSO,充分溶解后各取0.2 mL溶液放入96孔板中，用酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度值；
(6)以pH7.4的PBS溶液0.3 mL替代小球藻類金屬硫蛋白制品進(jìn)行對照試驗(yàn),通過比較試驗(yàn)組和對照組的吸光度值說明小球藻類金屬硫蛋白的抗紫外輻射能力。步驟(3)中紫外燈輻射劑量是通過以下方法計(jì)算得出:
稿刪量_ -)=歷舊O采用上述方案后，由于本發(fā)明采用普通海洋小球藻(C vulgaris)為原材料，通過鋅誘導(dǎo)制備鋅結(jié)合類金屬硫蛋白，并通過NIH/3T3和HaCaT活體細(xì)胞模型進(jìn)行抗紫外輻射試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)NIH/3T3和HaCaT細(xì)胞經(jīng)紫外輻射后，細(xì)胞活性下降，細(xì)胞形態(tài)改變甚至出現(xiàn)裂解的現(xiàn)象。而分別在NIH/3T3和HaCaT細(xì)胞介質(zhì)中加入小球藻類金屬硫蛋白制品后再經(jīng)紫外輻射，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)變化小，細(xì)胞活性得到保持，說明小球藻類金屬硫蛋白具有一定的抗紫外輻射功能。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
圖1為不同劑量紫外輻射對NIH/3T3細(xì)胞活性的影響 圖2為不同濃度小球藻類金屬硫蛋白保護(hù)下NIH/3T3細(xì)胞經(jīng)紫外輻射(6 J/cm2)的活性 圖3為不同劑量紫外輻射對HaCaT細(xì)胞活性的影響 圖4為不同濃度小球藻類金屬硫蛋白保護(hù)下HaCaT細(xì)胞經(jīng)紫外輻射(3 J/cm2)的活性圖。
具體實(shí)施例方式一、提取方法
本發(fā)明是一種具有抗紫外輻射功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法，它包括以下步
驟:
1.收集藻細(xì)胞:在處于對數(shù)生長期的小球藻培養(yǎng)液中加入0.05 mmol/L氯化鋅，通氣連續(xù)培養(yǎng)72 h。取小球藻懸浮液，經(jīng)5000 r/min離心，收集藻細(xì)胞。2.收集上清液:將收集的藻細(xì)胞分別用5 mmol/L EDTA-2Na和超純水依次清洗2次，按藻泥重量與提取液(含1% 二硫蘇糖醇的10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.8)體積比以1:10(w/v)的比例分散懸浮藻細(xì)胞，在冰浴下超聲波細(xì)胞破碎，然后經(jīng)12000 r/min離心10 min,收集上清液。3.制取金屬硫蛋白: 將上清液注入葡聚糖凝膠(G-75)層析柱(Φ3.0X80 cm),以10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.8)為洗脫液，經(jīng)430 min后收集富含鋅的類金屬硫蛋白組分60 min。收集過程可通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，以防止樣品被氧化。將收集的組分經(jīng)真空冷凍干燥后，復(fù)溶于超純水中，用葡聚糖凝膠(G-25)層析柱(Φ 1.5X30 cm)脫鹽純化，收集類金屬蛋白質(zhì)組分并經(jīng)真空冷凍干燥后即得到小球藻類金屬硫蛋白制品。二、實(shí)驗(yàn)方法
本發(fā)明是一種具有抗紫外輻射功能的小球藻類金屬硫蛋白的實(shí)驗(yàn)方法的四個(gè)實(shí)施例，它包括以下步驟:
實(shí)施例1:
NIH/3T3細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化3 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。在24孔板中各加入0.3 mL細(xì)胞懸浮液，于37°C及5% CO2氣氛的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出24孔板，此時(shí)細(xì)胞完全貼壁，棄上清液，于各孔中加入0.3 mL PBS (pH 7.4)，分別在距離紫外燈管25 cm處輻射0、3、6、7.5、9 J/cm2。然后，棄上清液，加入37°C預(yù)熱的新鮮DMEM培養(yǎng)基并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，觀測細(xì)胞形態(tài)。棄上清液，各孔加入2 mg/mL的MTT溶液0.1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，加入0.5 mL DMSO溶液，充分溶解后各取0.2 mL溶液放入96孔板中，用酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度值，結(jié)果如圖1所示。實(shí)施例2
NIH/3T3細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化3 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。在24孔板中各加入0.3 mL的細(xì)胞懸浮液，于37°C及5% CO2氣氛的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出24孔板，此時(shí)細(xì)胞完全貼壁，棄上清液，于各孔中加入0.3 mL小球藻類金屬硫蛋白制品(溶于pH 7.4的PBS中)。在距離紫外燈管25 cm處輻射，劑量為6 J/cm2。然后按實(shí)施例1中的方法測定各吸光度值，并觀測細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例3
HaCaT細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化8 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。在24孔板中各加入0.3 mL的細(xì)胞懸浮液，于37°C及5% CO2氣氛的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞完全貼壁。取出24孔板，棄上清液，加入0.3 mL PBS (pH 7.4)，分別在距離燈管25 cm處輻射0、3、6、7.5、9 J/cm2后，棄上清液，加入37°C預(yù)熱的新鮮DMEM培養(yǎng)基并放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。然后，棄上清液，各加入2 mg/mL的MTT溶液0.1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，加入0.5 mL DMS0，充分溶解后各取0.2 mL溶液放入96孔板中，用酶標(biāo)儀測定吸光度值，結(jié)果如圖3所示。 實(shí)施例4
HaCaT細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化8 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。在24孔板中各加入0.3 mL的細(xì)胞液，于37°C及5% CO2氣氛的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞完全貼壁。取出24孔板,棄上清液,加入0.3 mL小球藻類金屬硫蛋白(溶于pH
7.4的PBS中)，在距離紫外燈管25 cm處輻射，劑量為3 J/cm2。然后按實(shí)施例1中的方法測定各吸光度值，結(jié)果如圖4所示。需要說明的是:
(I)所述的小球藻類金屬硫蛋白的試驗(yàn)濃度范圍為1.25 10 mg/mL。隨著小球藻類金屬硫蛋白的濃度增大，NIH/3T3細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞的活性增強(qiáng)，說明小球藻類金屬硫蛋白對這兩種細(xì)胞的保護(hù)作用增強(qiáng)，即抗紫外輻射能力增強(qiáng)。(2)上述各實(shí)施例中紫外燈輻射劑量是通過以下方法計(jì)算得出:
權(quán)利要求
1.一種具有抗紫外輻射功能的小球藻類金屬硫蛋白的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于:它包括以下步驟: (1)活體細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化3-8 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞； (2)在24孔板中各加入0.3 mL細(xì)胞懸浮液，于37°C及5% CO2氣氛的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ； (3)取出24孔板，此時(shí)細(xì)胞完全貼壁，棄上清液，加入以pH7.4的PBS為介質(zhì)的小球藻類金屬硫蛋白制品0.3 mL,在距離紫外燈管25 cm處福射0_9 J/cm2 ； (4)棄上清液，加入37°C預(yù)熱的新鮮DMEM培養(yǎng)基并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h ； (5)棄上清液，往各孔加入2mg/mL的MTT溶液0.1 mL,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，加入0.5 mLDMSO溶液，充分溶解后各取0.2 mL溶液放入96孔板中，用酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度值； (6)以pH7.4的PBS溶液0.3 mL替代小球藻類金屬硫蛋白制品進(jìn)行對照試驗(yàn),通過比較試驗(yàn)組和對照組的吸光度值說明小球藻類金屬硫蛋白的抗紫外輻射能力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗紫外輻射功能的小球藻類金屬硫蛋白的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于:所述的小球藻類金屬硫蛋白的試驗(yàn)濃度范圍為1.25" 0 mg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗紫外輻射功能的小球藻類金屬硫蛋白的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于:所述的活體細(xì)胞為NIH/3T3細(xì)胞，它包括以下步驟: (I )NIH/3T3細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化3 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞； (2)在24孔板中各加入0.3 mL細(xì)胞懸浮液，于37°C及5% CO2氣氛的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ； (3)取出24孔板，此時(shí)細(xì)胞完全貼壁，棄上清液，加入以pH7.4的PBS為介質(zhì)的小球藻類金屬硫蛋白制品0.3 mL,在距離紫外燈管25 cm處福射6 J/cm2 ； (4)棄上清液，加入37°C預(yù)熱的新鮮DMEM培養(yǎng)基并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h ； (5)棄上清液，往各孔加入2mg/mL的MTT溶液0.1 mL,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，加入0.5 mLDMSO溶液，充分溶解后各取0.2 mL溶液放入96孔板中，用酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度值； (5)以pH 7.4的PBS溶液0.3 mL替代小球藻類金屬硫蛋白制品進(jìn)行對照試驗(yàn)；通過比較試驗(yàn)組和對照組的吸光度值說明小球藻類金屬硫蛋白的抗紫外輻射能力。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗紫外輻射功能的小球藻類金屬硫蛋白的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于:所述的活體細(xì)胞為HaCaT細(xì)胞，它包括以下步驟: (I )HaCaT細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化8 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞； (2)在24孔板中各加入0.3 mL的細(xì)胞懸浮液，于37°C及5% CO2氣氛的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h至細(xì)胞完全貼壁； (3)取出24孔板，棄上清液，加入以pH7.4的PBS為介質(zhì)的小球藻類金屬硫蛋白制品，0.3 mL,在距離紫外燈管25 cm處福射3 J/cm2; (4)棄上清液，加入37°C預(yù)熱的新鮮DMEM培養(yǎng)基并放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12h ；(5)棄上清液，各加入2mg/mL的MTT溶液0.1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，加入0.5 mL DMSO,充分溶解后各取0.2 mL溶液放入96孔板中，用酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度值； (6)以pH7.4的PBS溶液0.3 mL替代小球藻類金屬硫蛋白制品進(jìn)行對照試驗(yàn),通過比較試驗(yàn)組和對照組的吸光度值說明小球藻類金屬硫蛋白的抗紫外輻射能力。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗紫外輻射功能的小球藻類金屬硫蛋白的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于:步驟(3)中紫外燈輻射劑量是通過以下方法計(jì)算得出:
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有抗紫外輻射功能的小球藻類金屬硫蛋白的實(shí)驗(yàn)方法，它包括小球藻類金屬硫蛋白的制備和活體細(xì)胞試驗(yàn)等步驟。由于本發(fā)明采用普通海洋小球藻(C.vulgaris)為原材料，通過鋅誘導(dǎo)制備鋅結(jié)合類金屬硫蛋白。通過NIH/3T3和HaCaT活體細(xì)胞模型進(jìn)行抗紫外輻射試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)NIH/3T3和HaCaT細(xì)胞經(jīng)紫外輻射后，細(xì)胞活性下降，細(xì)胞形態(tài)改變甚至出現(xiàn)裂解的現(xiàn)象。而分別在NIH/3T3和HaCaT細(xì)胞介質(zhì)中加入小球藻類金屬硫蛋白制品后再經(jīng)紫外輻射，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)變化小，細(xì)胞活性得到保持，說明小球藻類金屬硫蛋白具有抗紫外輻射功能。
文檔編號C12Q1/02GK103114123SQ20131004769
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者黃志勇, 楊洪 申請人:集美大學(xué)