專利名稱：哲羅鮭c型溶菌酶HtLysC基因及其編碼蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及哲羅鮭c型溶菌酶HtLysC基因及其編碼蛋白。
背景技術(shù)：
溶菌酶是一種能水解粘多糖的堿性酶，它能催化細菌細胞壁中粘多糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的P _1，4糖苷鍵的水解，導(dǎo)致細菌細胞壁破裂、內(nèi)容物逸出而使細菌死亡。目前，一般將溶菌酶分為六類:(1)雞型溶菌酶，又稱c型溶菌酶(c-type)，包括來自于胃的溶菌酶和結(jié)合鈣離子的溶菌酶；(2)鵝型溶菌酶，又稱g型溶菌酶(g-type) ； (3)植物溶菌酶；(4)細菌溶菌酶；(5)T4噬菌體溶菌酶；(6)無脊椎動物溶菌酶。此外溶菌酶還可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)機體其他免疫因子的合成與分泌、協(xié)同其它免疫因子進行防御免疫。哲羅鮭，Huchotaimen (pallas),屬鮭形目 Samoniformes、鮭科 Salmonidea、哲羅魚屬Hucho，是冷水性的兇猛肉食性魚類，也是鮭科魚類中個體最大、生長速度最快的魚類。目前哲羅魚的野生資源基本枯竭，1998年被我國列入中國瀕危動物紅皮書，屬于易危物種，2004年被列入中國物種紅色名錄 ，受到全世界的關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供哲羅鮭c型溶菌酶HtLysC基因及其編碼蛋白。本發(fā)明的哲羅鮭c型溶菌酶HtLysC基因的基因序列如序列表Seq ID No:l所示。本發(fā)明的哲羅鮭c型溶菌酶HtLysC基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表SeqID No:2 所示。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明通過RT-PCR和RACE技術(shù)從哲羅鮭中克隆到一種c型溶菌酶基因，命名為HtLysC，并對其結(jié)構(gòu)、同源性、進化以及編碼蛋白特性進行分析。鑒于該基因在哲羅鮭非特異性免疫防御方面具有重要功能，可用于溶菌酶的重組表達和基因轉(zhuǎn)移，并為哲羅鮭的病害防治、基因輔助選育及進一步開發(fā)為醫(yī)藥產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為哲羅鮭c型溶菌酶HtLysC基因序列及其演繹的氨基酸序列分析圖；圖2為哲羅鮭溶菌酶氨基酸序列比對結(jié)果；圖3為基于NJ法構(gòu)建的不同生物c型溶菌酶系統(tǒng)進化樹。
具體實施例方式具體實施方式
一:本實施方式的哲羅鮭c型溶菌酶HtLysc基因的基因序列如序列表 Seq ID No:1 所示。本實施方式的有益效果:
本實施方式通過RT-PCR和RACE技術(shù)從哲羅鮭中克隆到一種c型溶菌酶基因，命名為HtLysC，并對其結(jié)構(gòu)、同源性、進化以及編碼蛋白特性進行分析。鑒于該基因在哲羅鮭非特異性免疫防御方面具有重要功能，可用于溶菌酶的重組表達和基因轉(zhuǎn)移，并為哲羅鮭的病害防治、基因輔助選育及進一步開發(fā)為醫(yī)藥產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實施方式
二:本實施方式的哲羅鮭c型溶菌酶HtLysC基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No:2所不。通過以下試驗驗證本發(fā)明的效果:UHtLysc基因序列的獲得一、取哲羅鮭脾臟并用Trizol(Invitrogen)試劑提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；二、以獲得的cDNA為模板通過F與R引物擴增哲羅鮭溶菌酶基因，PCR反應(yīng)條件如下:95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，58。。退火30s，72。。延伸lmin，共30循環(huán)，再72°C延伸IOmin,瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果后將PCR產(chǎn)物回收，并將其連接到載體pMD18-T (TAKARA)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5 a )，PCR鑒定后送至上海生工測序；其中，引物F的序列為ACTGGATCCATGAGAGCTGT TGTT ;引物R的序列為ATTGAATTCTTAGACCCCGC AGCCA ;哲羅鮭為黑龍江水產(chǎn)研究所渤海試驗站冷水魚養(yǎng)殖基地提供。測序結(jié)果表明哲羅鮭c型溶菌酶HtLysC基因具有序列表中Seq ID No:1的核苷酸序列，序列表中的Seq ID No:1由792個堿基組成，并編碼具有序列表中Seq ID No:2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。2、HtLysC基因序列的分析將獲得的哲羅鮭溶菌酶的全長cDNA用ORF Finder確定正確的開放閱讀框，并翻譯成氨基酸序列；用B LAST程序與GenBank、EMBL、DDBJ及PDB數(shù)據(jù)庫中的序列進行比較；用CDD軟件來分析哲羅鮭溶菌酶結(jié)構(gòu)域；用PSORT II軟件預(yù)測溶菌酶亞細胞定位情況；用Signal P4.0來分析哲羅鮭溶菌酶的信號肽及切割位點；用ProtParam來預(yù)測序列的分子式、分子量和理論等電點；將獲得的哲羅鮭溶菌酶氨基酸序列和其它動物c型溶菌酶序列進行Clustal W比對，然后用MEGA4.0構(gòu)建不同生物基于c型溶菌酶序列的分子系統(tǒng)發(fā)育樹。序列分析的結(jié)果如下:(I)利用RT-PCR和RACE技術(shù)得到的哲羅鮭c型溶菌酶基因序列及其演繹的氨基酸序列分析圖如圖1所示，從圖1可以得出，從哲羅鮭中擴增到c型溶菌酶的全長cDNA序列792bp，其中完整開放閱讀框435bp，5’非編碼區(qū)129bp，3’非編碼區(qū)228bp，在3’端的非編碼區(qū)中有真核基因PolyA加尾信號序列AATAA的出現(xiàn)，其編碼蛋白含有144個氨基酸，成熟肽包括129個氨基酸，其中含有c型溶菌酶特有的兩個活性中心Glu50和Asp67，以及8個保守結(jié)構(gòu)Cys殘基。成熟肽分子式為C617H961N185O191S9,分子量為14.3kDa，理論等電點為
8.66。經(jīng)SMART分析，該基因具有I個溶菌酶(LYZl)結(jié)構(gòu)域(16_140aa)。(2)經(jīng)Clustal W比對分析，哲羅鮭溶菌酶氨基酸序列比對結(jié)果如圖2所示，從圖2可以看出，哲羅鮭溶菌酶氨基酸序列與大西洋鮭、虹鱒的溶菌酶具有高度同源性，其序列一致性分別為93%和96.5% ;與美洲紅點鮭溶菌酶一致性為71.5% ;與斑馬魚溶菌酶一致性僅為37.4%。(3)基于NJ法構(gòu)建的不同生物c型溶菌酶系統(tǒng)進化樹如圖3所示，圖3表明HtLysC與虹鱒和大西洋鮭單獨聚成一支，與大西洋鯛遺傳距離最遠。
權(quán)利要求
1.哲羅鮭C型溶菌酶HtLysC基因，其特征在于哲羅鮭c型溶菌酶HtLysC基因的基因序列如序列表Seq ID No: I所不。
2.如權(quán)利要求1所述的哲羅鮭c型溶菌酶HtLysC基因的編碼蛋白，其特征在于哲羅鮭c型溶菌酶HtLysC基因編 碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No:2所示。
全文摘要
哲羅鮭c型溶菌酶HtLysC基因及其編碼蛋白，它涉及哲羅鮭c型溶菌酶HtLysC基因及其編碼蛋白。本發(fā)明提供了哲羅鮭c型溶菌酶HtLysC基因及其編碼蛋白。本發(fā)明的哲羅鮭c型溶菌酶HtLysC基因的基因序列如序列表Seq ID No1所示。本發(fā)明的哲羅鮭c型溶菌酶HtLysC基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No2所示。本發(fā)明哲羅鮭c型溶菌酶HtLysC基因在哲羅鮭非特異性免疫防御方面具有重要功能，可用于溶菌酶的重組表達和基因轉(zhuǎn)移，并為哲羅鮭的病害防治、基因輔助選育及進一步開發(fā)為醫(yī)藥產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N9/36GK103074352SQ20131004787
公開日2013年5月1日 申請日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者李紹戊, 王荻, 劉紅柏, 盧彤巖, 佟廣香, 尹家勝 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所