專利名稱：早期肺腺癌miRNA特異表達(dá)譜及其反轉(zhuǎn)錄引物和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及一種腫瘤生物標(biāo)志物，具體涉及一種早期肺腺癌miRNA特異表達(dá)譜及其反轉(zhuǎn)錄引物和用途。
背景技術(shù)：
由于肺腺癌發(fā)病隱匿，缺乏特異的臨床表現(xiàn)，目前又沒有行之有效的早期診斷方法，盡管I期肺腺癌術(shù)后5年生存率可達(dá)70%，但是僅10%的患者能在早期階段(ΤΙΝ0Μ0/T2N0M0)被發(fā)現(xiàn)，40%的肺腺癌患者在確診時(shí)已進(jìn)入中晚期而失去手術(shù)機(jī)會，5年生存率〈15%。因此，肺腺癌的早期診斷對提高肺腺癌患者的生存質(zhì)量、延長生命具有非常重要的意義?，F(xiàn)階段公認(rèn)的肺腺癌早期診斷的方法有:痰脫落細(xì)胞學(xué)檢查，但檢出率僅有209Γ30% ;低劑量螺旋CT，僅能檢出周圍型肺腺癌，且費(fèi)用昂貴；纖維支氣管鏡，屬有創(chuàng)性檢查，患者不宜接受；ΡΕΤ及PET/CT雖能鑒別出肺內(nèi)0.5mm以上的代謝增高病灶，但炎癥病灶易出現(xiàn)假陽性，而一些代謝率低的肺腺癌如肺泡癌可出現(xiàn)假陰性。隨著分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的不斷深化，篩查與肺腺癌發(fā)生相關(guān)的早期分子事件有望成為肺腺癌早期診斷的一條 新途徑。目前已有多種腫瘤標(biāo)志物用于肺腺癌的檢測，如癌胚抗原(CEA)用于肺腺癌的檢測；細(xì)胞角蛋白21-1片斷(CYFRA21-1)用于肺鱗癌的診斷；神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)用于小細(xì)胞肺腺癌的診斷等，但因敏感性和特異性的問題，很難將它們作為肺腺癌診斷的硬性指標(biāo)。微小核糖酸(miRNA，miRNA)是一類長約22個核苷酸的非編碼單鏈小核糖核酸分子，通過對多種癌組織中miRNA表達(dá)譜與正常組織對比分析，發(fā)現(xiàn)miRNA在不同腫瘤中具有特定的表達(dá)譜，miRNA表達(dá)譜具有顯著的腫瘤相關(guān)性、組織特異性和表達(dá)穩(wěn)定性。因此確定早期肺腺癌miRNA特異表達(dá)譜將有助于早期肺腺癌的診斷。近年來，肺腺癌的發(fā)病率在我國更是保持著持續(xù)增長的趨勢，特別是在女性和非吸煙者史群體中。因此，針對肺腺癌這一特定類型的NSCLC，進(jìn)行無創(chuàng)傷性早期診斷的研究尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是早期肺腺癌診斷的敏感性、特異性低，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種早期肺腺癌miRNA特異表達(dá)譜及其反轉(zhuǎn)錄引物和用途。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:所述早期肺腺癌miRNA特異表達(dá)譜包括上調(diào)表達(dá)的 miR-103、miR-146a、miR-151、miR-221、miR-222 和 miR-223 中的一種以上。進(jìn)一步，所述早期肺腺癌miRNA特異表達(dá)譜包括上調(diào)表達(dá)的miR-146a、miR_222和miR-223中的一種以上。進(jìn)一步，所述早期肺腺癌miRNA特異表達(dá)譜包括上調(diào)表達(dá)的miR-146a、miR_222和miR-223ο進(jìn)一步,所述miRNA來自外周靜脈血的血清。本發(fā)明還提供了上述早期肺腺癌miRNA特異表達(dá)譜中特異表達(dá)miRNA的反轉(zhuǎn)錄引物，具體為對應(yīng) miR-103 的 probe-miR-103、對應(yīng) miR_146a 的 probe_miR-146a、對應(yīng) miR-151 的 probe-miR-151、對應(yīng) miR-221 的 probe-miR-221、對應(yīng) miR-222 的probe-miR-222 和對應(yīng) miR-223 的 probe-miR-223。本發(fā)明還提供了上述特異表達(dá)miRNA的反轉(zhuǎn)錄引物的用途，用于早期肺腺癌診斷用試劑盒或生物芯片。進(jìn)一步，所述試劑盒或生物芯片包括probe-miR-103、probe_miR-146a、probe-miR-151、probe-miR-221、probe-miR-222 和 probe-miR-223 的一種以上。進(jìn)一步，所述試劑盒或生物芯片包括probe-miR_146a、probe-miR-222和probe-miR-223 的一種以上。進(jìn)一步，所述試劑盒或生物芯片包括probe-miR_146a、probe-miR-222和probe-miR-223ο本發(fā)明提供的技術(shù)方案通過對少量miRNA的檢測即可實(shí)現(xiàn)對早期肺腺癌的準(zhǔn)確診斷，為生產(chǎn)出準(zhǔn)確、高效和經(jīng)濟(jì)的檢測產(chǎn)品提供了可能。建立的肺腺癌預(yù)測模型能較好的區(qū)分肺腺癌和健康個體的能力，具有較強(qiáng)的臨床實(shí)際意義。


圖1是本發(fā)明所述表達(dá)譜中肺腺癌差異表達(dá)循環(huán)miRNA的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作詳細(xì)描述:一、血清標(biāo)本的采集:肺腺癌患者(AD)術(shù)前外周靜脈血內(nèi)的血清和年齡、性別與實(shí)驗(yàn)組相匹配的健康體檢者(control)的外周靜脈血的血清。二、血清總RNA的抽提與純化:1.將350ul血清標(biāo)本與等體積2xDenaturing Solution室溫混合,冰上孵育5min。2.加入酸苯酹:氯仿,體積=樣本體積+2xDenaturing Solution體積,振蕩混勻30 60s, 12000rpm離心5min,收集水相于干凈的EP管中。3.加入1.25倍體積的室溫100%乙醇于收集的水相中，立即混勻。4.將混合物加入過濾器中，一次最多700ul,若體積大于700ul,可重復(fù)使用同一過濾器。離心30s后棄濾液，重復(fù)直到所有混合物都通過過濾器。5.用 700ul miRNA Wash Solution I 洗漆，離心 30s,棄濾液。6.用 500ul Wash Solution2/3 洗漆兩次，棄濾液。7.空離lmin，去除殘留液。8.預(yù)熱 Elution Solution 至 95°C,將預(yù)熱的 Elution Solution50ul 加入濾膜中心，靜置2 3min，離心30s，將濾液重新加入過濾器中再重復(fù)洗脫一次，收集洗脫液，儲存在-80°C中。三、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):
6個上調(diào)表達(dá)的miRNA的反轉(zhuǎn)錄引物序列如表一所示，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。miRNA標(biāo)準(zhǔn)品購買于廣州市銳博生物科技有限公司。表一`
權(quán)利要求
1.一種早期腺肺腺癌m i RNA特異表達(dá)譜，其特征在于，包括上調(diào)表達(dá)的m i R-10 3、miR-146a、miR-151、miR-221、miR-222 和 miR-223 中的一種以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種早期肺腺癌miRNA特異表達(dá)譜，其特征在于，所述早期肺腺癌miRNA特異表達(dá)譜包括上調(diào)表達(dá)的miR-146a、miR-222和miR-223中的一種以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種早期肺腺癌miRNA特異表達(dá)譜，其特征在于，所述早期肺腺癌miRNA特異表達(dá)譜包括上調(diào)表達(dá)的miR-146a、miR-222和miR-223。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種早期肺腺癌miRNA特異表達(dá)譜，其特征在于，所述miRNA來自外周靜脈血的血清。
5.權(quán)利要求1所述早期肺腺癌miRNA特異表達(dá)譜中特異表達(dá)miRNA的反轉(zhuǎn)錄引物，其特征在于，分別為對應(yīng) miR-103 的 probe-miR-103、對應(yīng) miR_146a 的 probe_miR-146a、對應(yīng) miR-151 的 probe-miR-151、對應(yīng) miR-221 的 probe-miR-221、對應(yīng) miR-222 的probe-miR-222 和對應(yīng) miR-223 的 probe-miR-223。
6.一種用于早期肺腺癌診斷用試劑盒或生物芯片，其特征在于，所述試劑盒或生物芯片包括 probe-miR-103、probe_miR-146a、probe-miR-151 > probe-miR-221 > probe-miR-222和probe-miR-223的一種以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種用于早期肺腺癌診斷用試劑盒或生物芯片，其特征在于，所述試劑盒或生物芯片包括probe_miR-146a、probe-miR-222和probe-miR-223的一種以上。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種用于早期肺腺癌診斷用試劑盒或生物芯片，其特征在于，所述試劑盒或生物芯片包括 probe_miR-146a、probe-miR-222 和 probe-miR-223。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及一種腫瘤生物標(biāo)志物，具體涉及一種早期肺腺癌miRNA特異表達(dá)譜及其反轉(zhuǎn)錄引物和用途。所述早期肺腺癌miRNA特異表達(dá)譜包括上調(diào)表達(dá)的miR-103、miR-146a、miR-151、miR-221、miR-222和miR-223中的一種以上?；谝陨咸禺惐磉_(dá)譜提供了早期肺腺癌診斷模型、特異表達(dá)miRNA的反轉(zhuǎn)錄引物和用于早期肺腺癌診斷用試劑盒或生物芯片。本發(fā)明提供的技術(shù)方案通過對少量miRNA的檢測即可實(shí)現(xiàn)對早期肺腺癌的準(zhǔn)確診斷，為生產(chǎn)出準(zhǔn)確、高效和經(jīng)濟(jì)的檢測產(chǎn)品提供了可能。建立的肺腺癌預(yù)測模型能較好的區(qū)分肺腺癌和健康個體的能力，具有較強(qiáng)的臨床實(shí)際意義。
文檔編號C12N15/11GK103173448SQ20131004926
公開日2013年6月26日 申請日期2013年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月7日
發(fā)明者婁加陶, 薛劍, 王琳, 吳傳勇 申請人:上海市胸科醫(yī)院