一種評價臭氧破壞魚類神經(jīng)壞死病毒核酸鏈效果的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種評價臭氧破壞魚類神經(jīng)壞死病毒核酸鏈效果的方法，即在魚類神經(jīng)壞死病毒核酸鏈3′末端設(shè)計反轉(zhuǎn)錄引物P，在5′末端設(shè)計PCR引物對F/R。臭氧處理魚類神經(jīng)壞死病毒后，病毒核酸鏈3′端斷裂則不能啟動反轉(zhuǎn)錄，5′端或中間斷裂雖能啟動反轉(zhuǎn)錄但不能進行PCR擴增。因此，斷裂的病毒核酸片段不能被擴增，只有完整的病毒核酸鏈才能得到擴增產(chǎn)物。發(fā)明的LR?RT-PCR方法可以對完整的和斷裂的病毒核酸鏈進行有效區(qū)分，從而可以用于評價臭氧對魚類神經(jīng)壞死病毒的殺滅效果。該LR?RT-PCR方法可以快速、方便、可靠地評價臭氧對魚類神經(jīng)壞死病毒的破壞效果，適用于養(yǎng)殖企業(yè)和各級水生動物疫病防控部門對魚類神經(jīng)壞死病毒的檢測和監(jiān)控，具有很高的實用價值和應(yīng)用前景。
【專利說明】一種評價臭氧破壞魚類神經(jīng)壞死病毒核酸鏈效果的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)病害防治【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種評價臭氧破壞魚類神經(jīng)壞死病毒核酸鏈效果的方法，即使用RT-PCR方法檢測單鏈RNA病毒核酸鏈的完整性，從而評價臭氧對魚類神經(jīng)壞死病毒核酸的破壞效果。
【背景技術(shù)】
[0002]魚類神經(jīng)壞死癥病毒是感染海水養(yǎng)殖魚類主要的病毒性病原之一，其基因組由兩條正義單鏈RNA組成(RNA1和RNA2)，其中RNAl全長約3.lkb, RNA2全長約1.4kb。在病毒分類方面，魚類神經(jīng)壞死病毒歸屬于野田村病毒科(Nodaviridae)，乙型野田村病毒屬(Betanodavirus),共分為4個種，即條斑星鰈神經(jīng)壞死病毒(Barfin floundernervous necrosis virus, BFNNV)、赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒(Redspotted groupernervous necrosis vi rus, RGNNV)、黃帶錄神經(jīng)壞死病毒(Striped jack nervousnecrosis virus, SJNNV)、紅鰭東方純神經(jīng)壞死病毒(Tiger puffer nervous necrosisvirus, TPNNV)。
[0003]魚類神經(jīng)壞死病毒可引起魚類的病毒性神經(jīng)壞死病(viral nervous necrosis),也稱為病毒性腦病和視網(wǎng)膜病(viral encephalopathy and retinopathy);該病呈世界性分布，主要流行于東亞、東南亞等地區(qū)，對我國福建、廣東、海南以及臺灣地區(qū)的養(yǎng)殖石斑魚苗危害尤其嚴重，患病魚苗死亡率達60%~100%。
[0004]到目前為止，由于缺乏有效的疫苗，在魚類神經(jīng)壞死病毒的防治方面，主要利用臭氧對魚卵進行消毒來阻斷病毒的垂直傳播，同時利用臭氧對養(yǎng)殖池以及工具的消毒來阻斷水平傳播。臭氧作為一種強氧化劑，可以迅速破壞病毒核酸鏈并使其斷裂。與完整的有感染能力的病毒核酸鏈相比，斷裂后的病毒核酸鏈不再具有感染能力，這是臭氧處理可以有效殺滅病毒的機制之一。因此，如何有效地分辨完整的和斷裂的病毒核酸鏈，是判斷臭氧消毒效果的關(guān)鍵因素。
[0005]對于魚類神經(jīng)壞死病毒，國內(nèi)外通常使用RT-PCR方法檢測病毒核酸鏈。其原理是先使用隨機引物或特異性引物，將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成互補的cDNA，再通過PCR引物擴增cDNA或其一部分,最后依據(jù)擴增產(chǎn)物的有無、多少判斷病毒RNA的存在情況。但隨機引物可以在任意RNA鏈上引發(fā)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，特異性引物可以在斷裂的RNA鏈上引發(fā)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。因此，被臭氧處理后斷裂的病毒RNA，雖然已失去感染活性，但隨機引物或特異性引物仍可與之結(jié)合并啟動反轉(zhuǎn)錄，然后通過PCR獲得擴增產(chǎn)物，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。因此已有的方法不能有效地分辨完整的和斷裂的病毒核酸鏈，不能用于準確的判斷臭氧的消毒效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種評價臭氧破壞魚類神經(jīng)壞死病毒核酸鏈效果的方法，命名為LR RT-PCR(Left reverse transcript Right amplify RT-PCR),本發(fā)明的方法可以對完整的和斷裂的魚類神經(jīng)壞死病毒核酸鏈進行有效區(qū)分，為評價臭氧對魚類神經(jīng)壞死病毒的殺滅效果提供一種快速、方便、可靠的RT-PCR方法。
[0007]本發(fā)明所涉及的方法，包括如下的步驟:
[0008]1)臭氧消毒后的組織樣品RNA的提取
[0009]稱取50~IOOmg消毒水產(chǎn)動物眼部或腦部組織，加入1ml RNAiso Plus試劑研磨，振蕩混勻后室溫靜置5min ;加入200 μ I的氯仿?lián)u勻，室溫靜置5min ;4°C、12000r/min離心15min,取上清液；加入等體積異丙醇,室溫靜置IOmin, 4°C、12000r/min離心10min,棄上清液；沉淀中加入75%乙醇溶液洗滌，4°C、12000r/min離心5min，棄上清液，室溫干燥；加入20 μ I DEPC處理水溶解、定量，備用；
[0010]2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[0011]在20μ1的反轉(zhuǎn)錄體系中，含有0.05~5yg RNA樣品，I~IOOpmol引物P，10 μ 12 X反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.1~5 μ I逆轉(zhuǎn)錄酶，DEPC處理水補齊至20 μ I ;
[0012]將上述反應(yīng)體系直于42 C 30min，然后85 C 5min，最后4 C保存?zhèn)溆茫?br> [0013]3) PCR擴增目標片段
[0014]在25 μ I 的 PCR 反應(yīng)體系中，含:10XPCR Buffer2.5 μ L，4 種 dNTP 混合物 0.5 ~50nmol,Mg2+IO ~1000nmol, Taq 酶 0.1 ~10U,引物 F 和 R各 I ~IOOpmol, cDNA 模板 0.1 ~10 μ L，DEPC處理水補足至25 μ L ;
[0015]將上述反應(yīng)體系置于PCR儀上，運行下述程序:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，52~62°C退火30s，72。。延伸30s, 30個循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存；
[0016]4)擴增結(jié)果的判定
[0017]使用I~2 %瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴增產(chǎn)物。電泳結(jié)果存在352bp的特異性條帶為魚類神經(jīng)壞死病毒陽性，臭氧消毒效果差；無特異性條帶為魚類神經(jīng)壞死病毒陰性，臭氧消毒效果良好。
[0018]其中反轉(zhuǎn)錄引物P 的序列是:5' -CGAGTCAACCCTGGTGCAGACAG-3'；
[0019]PCR 引物 F 的核酸序列是:5' -CGACTGTGACTGGATTTGGAC-3'；
[0020]PCR 引物 R 的核酸序列是:5' -GGTCGGACTGTTCTGCTTTC-3'。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0022]1.現(xiàn)有的RT-PCR方法雖然可以用于檢測魚類神經(jīng)壞死病毒的核酸片段，但是它們對斷裂失活的病毒核酸片段和完整的病毒核酸鏈都可以擴增，不能有效區(qū)分。本發(fā)明設(shè)計的LR RT-PCR方法成功地克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺點，可以對完整的和斷裂的病毒核酸鏈進行有效區(qū)分，解決了這一技術(shù)難題。
[0023]2.現(xiàn)有的RT-PCR方法不能有效區(qū)分完整的和斷裂的病毒核酸鏈，所以不能用于判斷臭氧對魚類神經(jīng)壞死病毒的消毒效果。本發(fā)明的LR RT-PCR方法可以對完整的和斷裂的病毒核酸鏈進行有效區(qū)分，從而可以用于評價臭氧對魚類神經(jīng)壞死病毒的消毒效果。該LR RT-PCR方法可以快速、方便、可靠地評價臭氧對魚類神經(jīng)壞死病毒的破壞效果，適用于養(yǎng)殖企業(yè)和各級水生動物疫病防控部門對魚類神經(jīng)壞死病毒的檢測和監(jiān)控，具有很高的實用價值和應(yīng)用前景。
[0024]說明書附圖
[0025]圖1:本發(fā)明方法的原理示意圖；
[0026]圖2:本發(fā)明實施例1的檢測方法參數(shù)優(yōu)化圖；[0027]其中:A.退火溫度；B.dNTP濃度；C.Mg2+濃度；D.引物濃度
[0028]M:DL500? DNA Marker ；A1 ~A6:退火溫度分別為 62、60、58、56、54、52°C，A7:陰性對照;B1 ~B6:dNTPs 分別為 0.3,0.25,0.2,0.15,0.1,0.05mmol/L,B7:陰性對照。Cl ~C6:Mg2+終濃度分別為6、5、4、3、2、lmmol/L，C7:陰性對照;D1~D6:引物終濃度分別為0.8、
0.6,0.4,0.2,0.1,0.05ymol/L, D7:陰性對照。
[0029]圖3:本發(fā)明實施例2的常規(guī)RT-PCR和LR RT-PCR對臭氧破壞RGNNVRNA效果的對比分析，其中:a.常規(guī)RT-PCR ；b.LR RT-PCR ；P:病毒陽性對照；N:病毒陰性對照。
【具體實施方式】
[0030]本發(fā)明在RNA病毒核酸鏈:V末端設(shè)計反轉(zhuǎn)錄引物P，在Y末端設(shè)計PCR引物對F/R。臭氧消毒病毒核酸后，病毒核酸鏈3'末端斷裂則不能啟動反轉(zhuǎn)錄，5'末端或中間斷裂雖能啟動反轉(zhuǎn)錄但不能進行PCR擴增。因此，斷裂的病毒核酸片段不能被擴增，只有完整的病毒核酸鏈才能得到擴增產(chǎn)物(圖1)。[0031]為了通過LR RT-PCR方法區(qū)分完整的和斷裂的魚類神經(jīng)壞死病毒核酸鏈，本發(fā)明依據(jù)魚類神經(jīng)壞死病毒基因組序列的保守區(qū)設(shè)計反轉(zhuǎn)錄引物P和PCR引物對F/R。設(shè)計引物的原則是既要保證其特異性，又要保證其可靠性。其中反轉(zhuǎn)錄引物P盡可能位于病毒核酸鏈的3'末端，并與其互補；PCR引物對F/R盡可能位于病毒核酸鏈的5'末端，并與病毒cDNA序列相同或互補。經(jīng)過反復(fù)嘗試和條件優(yōu)化，在200余條候選引物中，最終確定了下述引物:
[0032]反轉(zhuǎn)錄引物P的核酸序列(SEQ ID NO:1):
[0033]5' -CGAGTCAACCCTGGTGCAGACAG-3'；
[0034]PCR引物F的核酸序列是(SEQ ID NO:2):
[0035]5' -CGACTGTGACTGGATTTGGAC-3'；
[0036]PCR引物R的核酸序列是(SEQ ID NO:3):
[0037]5' -GGTCGGACTGTTCTGCTTTC-3'。
[0038]上述LR RT-PCR的目標產(chǎn)物大小為352bp。
[0039]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的方法進行詳細的描述。
[0040]實施例1:LR RT-PCR檢測方法參數(shù)的優(yōu)化
[0041]赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒(RGNNV)為單鏈RNA病毒，是海水養(yǎng)殖魚類主要的病毒性病原之一，對我國福建、廣東、海南以及臺灣地區(qū)的養(yǎng)殖石斑魚苗危害尤其嚴重，患病魚苗死亡率達60%~100%。依據(jù)RGNNV的RNA2基因序列設(shè)計LR RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄引物(P)以及PCR引物對(F/R)，引物序列:
[0042]P:5/ -CGAGTCAACCCTGGTGCAGACAG-3'；
[0043]F:5/ -CGACTGTGACTGGATTTGGAC-3'；
[0044]R:5/ -GGTCGGACTGTTCTGCTTTC-3'。
[0045]取患病毒性神經(jīng)壞死病的青石斑魚頭部組織50mg，提取組織RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0046]為了提高檢測方法的特異性和靈敏度，取得更好的檢測效果，本發(fā)明人對LRRT-PCR的PCR步驟進行了引物濃度、退火溫度、Mg2+濃度、dNTPs濃度四個反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化。其中引物終濃度分別為0.8,0.6,0.4,0.2,0.1,0.05 μ mol/L,退火溫度分別為62、60、58、56、54、52°C ,Mg2+終濃度分別為:6、5、4、3、2、lmmol/L，dNTPs 終濃度分別為 0.05,0.1,0.15、
0.2,0.25,0.3mmol/L，通過不同條件的比較，確定最佳反應(yīng)參數(shù)。
[0047]依據(jù)實驗結(jié)果，確定最佳的PCR反應(yīng)體系為:在25yL的反應(yīng)體積中，dNTPs各
0.5nmol,Mg2+ 終濃度 4mmol/L,引物終濃度為 0.2 μ mol/L,Ex Taq0.5U, cDNA 模板 I μ I。最佳退火溫度為60°C。
[0048]實施例2:評價臭氧對赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒的破壞效果
[0049]將IOng/ μ I的RGNNV核酸樣品分別用0.3,0.5、l、2mg/L的臭氧水處理IOmin后，再進行RT-PCR擴增，分析臭氧對RGNNV RNA的破壞效果。對同樣的樣品，分別使用本專利發(fā)明的LR RT-PCR方法和Mu等報道的常規(guī)RT-PCR進行擴增(Mu Y，Lin K, Chen X，etal.Diagnosis of nervous necrosis virus in orange-spotted grouper, Epinepheluscoioides, by a rapid and convenient RT-PCR method[J].Acta OceanologicaSinica, 2013，32(10):88-92.)。
[0050]本專利發(fā)明的LR RT-PCR方法的引物為:反轉(zhuǎn)錄引物P (5' -CGA GTC AAC CCTGGT GCA GAC AG-3' ) ;PCR 引物 F(5' -CGA CTG TGA CTG GAT TTG GAC-3' )，PCR 引物R(5' -GGT CGG ACT GTT CTG CTT TC-3')。反轉(zhuǎn)錄體系為:2 μ I RNA 模板，IOpmol 引物P，10 μ 12 X反轉(zhuǎn)錄緩沖液，I μ I逆轉(zhuǎn)錄酶，DEPC處理水補齊至20 μ I。反轉(zhuǎn)錄程序為:420C 30min，85°C 5min，最后 4°C保存?zhèn)溆谩CR 體系為:10 XPCR Buffer2.5 μ L，4 種 dNTP混合物 0.5nmol, Mg2+IOOnmol, Ex Taq 酶 0.5U，引物 F 和 R 各 5pmol, cDNA 模板 I μ L, DEPC處理水補足至25 μ L ;PCR反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存。
[0051]常規(guī)RT-PCR 的引物為:反轉(zhuǎn)錄引物 NNV-Pl (5' -CGA GTC AAC ACG GGTGAA GACAG-3/ ) ;PCR引物P2(5' -ACC GCT CCC ATC ATG ACA CAA-3' )，ΡΟ^|*Ρ3(5' -AACAGGCAG CAG AAT TTG ACG-3')。反轉(zhuǎn)錄體系為:2μ I RNA 模板，I μ I Pl, I μ I dNTPs (lOmmol/L)，2y 15X反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.25 μ I RNase酶抑制劑，0.25 μ I逆轉(zhuǎn)錄酶，無RNase的水補齊至 10 μ I。反轉(zhuǎn)錄程序為:42°C反應(yīng) lh。PCR體系為:10mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 50mmol/LKCl, 1.5mmol/LMgCl2,0.5% Tween-20,0.2mmol/L dNTPs,0.5 μ mol/L P2和P3，1U Taq DNA聚合酶，2μ1 cDNA，無RNase的水補齊至25 μ I。PCR反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性Imin ;94°C變性20s, 55°C退火20s, 72°C延伸20s, 30個循環(huán)；72°C延伸IOmin。
[0052]上述LR RT-PCR和常規(guī)RT-PCR擴增的電泳結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，RGNNV核酸樣品經(jīng)各濃度的臭氧處理后，LR RT-PCR的擴增產(chǎn)物均明顯少于常規(guī)RT-PCR的擴增產(chǎn)物。且隨著臭氧濃度的升高，即斷裂RNA逐漸增加，完整的RNA逐漸減少時，LR RT-PCR的擴增產(chǎn)物也逐漸減少；當臭氧濃度達到2mg/L時，LR RT-PCR不能得到擴增產(chǎn)物。與此相反，隨著臭氧濃度的升高，常規(guī)RT-PCR的擴增產(chǎn)物雖然也總體上呈減少趨勢，但兩者的相關(guān)性并不明顯；尤其是當臭氧濃度由lmg/L增加到2mg/L時，常規(guī)RT-PCR的擴增產(chǎn)物不僅未減少，反而有所增加。
[0053] 將LR RT-PCR檢測結(jié)果為陰性的魚受精卵勻漿液，依照常規(guī)技術(shù)接種到培養(yǎng)好的SSN-1單層細胞中，進行病毒擴大培養(yǎng)，2周內(nèi)未觀察到細胞病變，且病毒檢測結(jié)果仍為陰性，由此證明本發(fā)明對魚類神經(jīng)壞死病毒感染性的判斷是可靠的。[0054]上述結(jié)果還表明，用臭氧消毒神經(jīng)壞死病毒樣品，當臭氧濃度不足時，本發(fā)明的LRRT-PCR方法與可供對比的常規(guī)RT-PCR方法都能檢測到陽性片段；而臭氧濃度適當或過高的時候，對比的RT-PCR方法還存在錯誤的檢測結(jié)果，而本發(fā)明完全檢測不到病毒。就是說，本發(fā)明的準確率能達到100%，而對比的方法只有95%，可能出現(xiàn)錯誤的檢測結(jié)果。此外，在生產(chǎn)實踐中對魚受精卵進行消毒時，臭氧濃度過高，會使魚卵孵化率大大降低、魚苗畸形率大大提聞，給育苗生廣造成很大的損害。 [0055]由此證明，本發(fā)明設(shè)計的LR RT-PCR引物準確可靠，不能擴增斷裂的RGNNV核酸鏈，從而能可靠地判斷RGNNV核酸鏈的完整性，既不會產(chǎn)生假陽性，更不會產(chǎn)生假陰性。而常規(guī)RT-PCR不能區(qū)分斷裂的和完整的RGNNV核酸鏈，不能用于評價臭氧對RGNNV的殺滅效果O
【權(quán)利要求】
1.一種評價臭氧破壞魚類神經(jīng)壞死病毒核酸鏈效果的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟: 1)臭氧消毒后的組織樣品RNA的提取 稱取50~IOOmg消毒后的水產(chǎn)動物眼部或腦部組織，加入1ml RNAiso Plus試劑研磨，振蕩混勻后室溫靜置5min ;加入200 μ I的氯仿?lián)u勻，室溫靜置5min ;4°C、12000r/min離心15min,取上清液；加入等體積異丙醇，室溫靜置IOmin, 4°C、12000r/min離心10min,棄上清液；沉淀中加入75%乙醇溶液洗滌，4°C、12000r/min離心5min，棄上清液，室溫干燥；加入20 μ I DEPC處理水溶解、定量，備用； 2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 在20 μ I的反轉(zhuǎn)錄體系中，含有0.05~5μ g RNA樣品，I~IOOpmol引物Ρ，10μ 12X反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.1~5 μ I逆轉(zhuǎn)錄酶，DEPC處理水補齊至20 μ I ; 將上述反應(yīng)體系置于42V 30min，然后85°C 5min，最后4°C保存?zhèn)溆茫? 3)PCR擴增目標片段 在25μ I的PCR反應(yīng)體系中，含:10XPCR Buffer2.5 μ L，4種dNTP混合物0.5~50nmol,Mg2+IO ~1000nmol, Taq 酶 0.1 ~10U,引物 F 和 R各 I ~IOOpmol, cDNA 模板 0.1 ~10 μ L，DEPC處理水補足至25 μ L ; 將上述反應(yīng)體系置于PCR儀上，運行下述程序:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，52~62°C退火30s，72。。 延伸30s, 30個循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存； 4)擴增結(jié)果的判定 使用I~2%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴增產(chǎn)物；其中電泳結(jié)果存在352bp的特異性條帶為魚類神經(jīng)壞死病毒陽性，臭氧消毒效果差；無特異性條帶為魚類神經(jīng)壞死病毒陰性，臭氧消毒效果良好。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA中所使用的反轉(zhuǎn)錄引物P的序列為SEQ ID NO:1。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟3)PCR擴增目標片段中引物F的核酸序列為SEQ ID NO:2o
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟3)PCR擴增目標片段中引物R的核酸序列為SEQ ID NO:3ο
5.一種用于評價臭氧破壞魚類神經(jīng)壞死病毒核酸鏈效果的引物組，其特征在于，所述的引物組包含有反轉(zhuǎn)錄引物和PCR擴增引物對，其中反轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為SEQ IDNO:1 ;PCR擴增引物對的核苷酸序列為SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
6.一種用于評價臭氧破壞魚類神經(jīng)壞死病毒核酸鏈效果的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含有權(quán)利要求5所述的引物組。
【文檔編號】C12N15/11GK103937911SQ201410181936
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】史成銀, 黃倢, 李晉, 張慶利, 楊冰, 劉莉 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所