專利名稱：獲取miRNA候選靶基因的方法及其專用反轉(zhuǎn)錄引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獲取miRNA候選靶基因的方法及其專用反轉(zhuǎn)錄弓I物。
背景技術(shù)：
微小RNA (microRNA, miRNA)是一類小分子非編碼RNA，約為22堿基大小。其通過結(jié)合靶基因的3’非翻譯區(qū)(3’ UTR)造成靶基因mRNA的降解或靶蛋白翻譯的抑制。研究表明miRNA的生物功能是通過調(diào)控靶基因而實(shí)現(xiàn)的，miRNA通過作用于相應(yīng)靶mRNA，參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝、發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程?？刂浦▌?dòng)、植物器官形成、發(fā)育、代謝以及某些疾病的發(fā)生。miRNA以不完全配對(duì)方式與靶基因相結(jié)合，這種不完全配對(duì)模式使得miRNA及其靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，即一條miRNA可以同時(shí)作用若干甚至上百個(gè)功能基因，一個(gè)功能基因也可能受高達(dá)數(shù)十條miRNA所調(diào)控。很難通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)加以一一驗(yàn)證。Bartel 等(Friedman, R.C., K.K.Farh, C.B.Burge, and D.P.Bartel.2009.Most mammalianmRNAs are conserved targets of microRNAs.Genome Resl9:92-105)研究發(fā)現(xiàn) miRNA 的5’端第2-8個(gè)堿基的種子序列與靶基因序列精確配對(duì)，基于這一結(jié)合特性相續(xù)開發(fā)出了一系列miRNA靶基因生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件。尋找miRNA 的靶基因的方法主要分為生物信息學(xué)方法和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法獲得數(shù)據(jù)較為準(zhǔn)確，其缺點(diǎn)是一次只能證明一條靶基因，通量不夠。生物信息方法獲得數(shù)據(jù)通量較大，但準(zhǔn)確率較低。兩種方法各有特點(diǎn)但都必須有一個(gè)硬性前提，即所分析物種的基因組信息需較為完整。綿羊基因組雖已發(fā)布第二版(V2.0)，第四版至今沒有公布，參見官方測(cè)序網(wǎng)站(http://www.animalgenome.0rg/sheep/),由于版本較低,測(cè)序質(zhì)量不高，存在很多沒有測(cè)通的片段(gap)，基因組數(shù)據(jù)不夠完整，大量基因的3’UTR序列未知。因此利用以上兩種方法很難批量獲得綿羊骨骼肌miRNA及其靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的完整信息。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種獲取miRNA候選靶基因的方法、獲取miRNA與mRNA的候選結(jié)合位點(diǎn)的方法及其專用反轉(zhuǎn)錄引物。本發(fā)明所提供的獲取miRNA候選靶基因的方法，包括:I)以名稱為反轉(zhuǎn)錄引物A的帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)和目的miRNA種子序列的DNA為反轉(zhuǎn)錄引物，對(duì)真核生物目的組織的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，該反轉(zhuǎn)錄記為反轉(zhuǎn)錄A，獲取與所述目的miRNA種子序列互補(bǔ)的mRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一條鏈,得到A庫；所述反轉(zhuǎn)錄引物A的結(jié)構(gòu)是莖環(huán)結(jié)構(gòu)-miR-X，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)滿足如下條件:所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部序列完全配對(duì)，且CG含量為57-62%，環(huán)部不配對(duì)堿基數(shù)< 6個(gè)，且能值低于-30.0Okcal/mol ;所述miR-X是所述目的miRNA種子序列，是由10個(gè)脫氧核糖核苷酸組成的單鏈DNA,所述miR-X的5'至3'方向是Y至Y方向單鏈DNA序列的反向序列:所述:V至Y方向單鏈DNA序列是將所述目的miRNA從3'至5'方向的倒數(shù)10個(gè)核糖核苷酸均替換為所述核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧腺嘌呤核苷酸，鳥嘌呤核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧鳥嘌呤核苷酸，胞嘧啶核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧胸腺嘧啶核苷酸；2)以名稱為反轉(zhuǎn)錄引物B的帶特異接頭和14-20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA為反轉(zhuǎn)錄引物，對(duì)所述真核生物目的組織的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲取所述真核生物目的組織的mRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一條鏈,得到B庫；所述反轉(zhuǎn)錄引物B的結(jié)構(gòu)是特異接頭-T14_2(l,所述特異接頭滿足如下條件:所述特異接頭的CG含量為50% 60%，所述特異接頭和所述反轉(zhuǎn)錄引物A的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列最大配對(duì)堿基數(shù)< 5個(gè)，最大串聯(lián)配對(duì)堿基數(shù)目小于< 4個(gè)；3)合成所述A庫的cDNA第二條鏈得到雙鏈cDNA，記為Ai庫；合成所述B庫的cDNA第二條鏈得到B'庫；將所述A'庫和所述B'庫進(jìn)行雜交得到雜交DNA分子，以所述雜交DNA分子為模板用引物Al和引物BI擴(kuò)增所述雜交DNA分子上所述引物Al和所述引物BI之間的DNA片段，收集所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)所述擴(kuò)增產(chǎn)物得到所述目的miRNA的候選靶基因；所述引物Al是選自所述反轉(zhuǎn)錄引物A的單鏈DNA，所述引物Al的序列由所述反轉(zhuǎn)錄引物A的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)部序列和緊靠所述目的miRNA種子序列的一個(gè)莖部序列組成；所述引物BI的序列是所述反轉(zhuǎn)錄引物B的部分或全部特異接頭序列的同向互補(bǔ)序列。本發(fā)明所提供的獲取miRNA與mRNA的候選結(jié)合位點(diǎn)(候選結(jié)合區(qū))的方法，包括:I)以名稱為反轉(zhuǎn)錄引物A的帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)和目的miRNA種子序列的DNA為反轉(zhuǎn)錄引物，對(duì)真核生物目的組織的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，該反轉(zhuǎn)錄記為反轉(zhuǎn)錄A，獲取與所述目的miRNA種子序列互補(bǔ)的mRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一條鏈,得到A庫；所述反轉(zhuǎn)錄引物A的結(jié)構(gòu)是莖環(huán)結(jié)構(gòu)-miR-X，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)滿足如下條件:所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部序列完全配對(duì)，且CG含量為57-62%，環(huán)部不配對(duì)堿基數(shù)< 6個(gè)，且能值低于-30.0Okcal/mol ;所述miR-X是所述目的miRNA種子序列，是由10個(gè)脫氧核糖核苷酸組成的單鏈DNA,所述miR-X的5'至3'方向是Y至Y方向單鏈DNA序列的反向序列:所述:V至Y方向單鏈DNA序列是將所述目的miRNA從3'至5'方 向的倒數(shù)10個(gè)核糖核苷酸均替換為所述核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧腺嘌呤核苷酸，鳥嘌呤核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧鳥嘌呤核苷酸，胞嘧啶核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧胸腺嘧啶核苷酸；2)以名稱為反轉(zhuǎn)錄引物B的帶特異接頭和14-20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA為反轉(zhuǎn)錄引物，對(duì)所述真核生物目的組織的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲取所述真核生物目的組織的mRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一條鏈,得到B庫；所述反轉(zhuǎn)錄引物B的結(jié)構(gòu)是特異接頭-T14_2(l,所述特異接頭滿足如下條件:所述特異接頭的CG含量為50% 60%，所述特異接頭和所述反轉(zhuǎn)錄引物A的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列最大配對(duì)堿基數(shù)< 5個(gè)，最大串聯(lián)配對(duì)堿基數(shù)目小于< 4個(gè)；3)合成所述A庫的cDNA第二條鏈得到雙鏈cDNA，記為A'庫；合成所述B庫的cDNA第二條鏈得到B'庫；將所述A'庫和所述B'庫進(jìn)行雜交得到雜交DNA分子，以所述雜交DNA分子為模板用引物Al和引物BI擴(kuò)增所述雜交DNA分子上所述引物Al和所述引物BI之間的DNA片段，收集所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)所述擴(kuò)增產(chǎn)物得到所述目的miRNA與mRNA的候選結(jié)合位點(diǎn)；所述引物Al是選自所述反轉(zhuǎn)錄引物A的單鏈DNA,所述引物Al的序列由所述反轉(zhuǎn)錄引物A的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)部序列和緊靠所述目的miRNA種子序列的一個(gè)莖部序列組成；所述引物BI的序列是所述反轉(zhuǎn)錄引物B的部分或全部特異接頭序列的同向互補(bǔ)序列。上述方法中，所述mRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一條鏈?zhǔn)侵赣伤鰉RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一條鏈。所述引物Al和所述所述引物BI均為單鏈DNA。上述方法中，所述真核生物目的組織具體可為羊、豬或牛骨骼肌，所述目的miRNA可為在骨骼肌中表達(dá)的miRNA。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述真核生物目的組織為羊骨骼肌，所述反轉(zhuǎn)錄引物A的核苷酸序列是 CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAGmiR-X,其中 miR-X 是所述目的miRNA種子序列，是由10個(gè)脫氧核糖核苷酸組成的單鏈DNA,所述miR-X的5'至3'方向是3'至5'方向單鏈DNA序列的反向序列:所述3'至5'方向單鏈DNA序列是將所述目的miRNA從3'至5'方向的倒數(shù)10個(gè)核糖核苷酸均替換為所述核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸得到的序列；所述引物Al的核苷酸序列是TGAGTCGGCAACTCAGTCGAG ;和/或，所述反轉(zhuǎn)錄引物B 的核苷酸序列是 AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTATTTTTTTTTTTTTTT，其中AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTA為特異接頭的核苷酸序列，所述引物BI的核苷酸序列是AGCGCAGCTCATCATCTGCAT (其與特異接頭序列中的黑體部序列同向互補(bǔ))。生物信息學(xué)比對(duì)結(jié)果表明所述反轉(zhuǎn)錄引物A、所述引物Al、所述反轉(zhuǎn)錄引物B、所述引物BI也可用于構(gòu)建牛和豬骨骼肌中的miRNA的候選靶基因文庫。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述目的miRNA是mir-133，其:V至Y方向的核苷酸序列為⑶CGACCAACUUCCCCUGGUUU,所沭反轉(zhuǎn)錄弓I物A的5'至3'方向的核苷酸序列是CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAGCCCCTGGTTT。上述方法中，當(dāng)所述反轉(zhuǎn)錄引物A的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的核苷酸序列是CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAG,所述反轉(zhuǎn)錄A可在37-42 °C (如42 °C )進(jìn)行，此溫度下，莖環(huán)處序列呈二級(jí)結(jié)構(gòu)狀態(tài)，只有種子序列成單鏈狀態(tài)，可以特異性進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最大程度保證了目的基因反轉(zhuǎn)錄的保真性；所述合成所述A庫的cDNA第二條鏈在15°C 25°C (如16°C )進(jìn)行。上述方法中，當(dāng)所述引物Al的核苷酸序列是TGAGTCGGCAACTCAGTCGAG,所沭引物BI的核苷酸序列是AGCGCAGCTCATCATCTGCAT,所沭步驟3中，所沭擴(kuò)增為PCR擴(kuò)增，所沭PCR擴(kuò)增采用的引物退火條件為65°C退火30s。進(jìn)一步，所述PCR擴(kuò)增中采用的PCR反應(yīng)溫度程序可為:94°C預(yù)變性Imin ;94°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸2_3min,30個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin0上述獲取miRNA的候選靶基因的方法可用于構(gòu)建獲取miRNA候選靶基因的文庫。上述方法中所述的反轉(zhuǎn)錄引物A也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還要求保護(hù)用于獲取miRNA候選靶基因的成套反轉(zhuǎn)錄引物。該用于構(gòu)建miRNA的候選靶基因文庫的成套反轉(zhuǎn)錄引物，由獨(dú)立包裝的上述方法中所述的反轉(zhuǎn)錄引物A和上述方法中所述的反轉(zhuǎn)錄引物 B組成。本發(fā)明還要求保護(hù)如下用于獲取miRNA候選靶基因的成套引物:由獨(dú)立包裝的上述方法中所述的反轉(zhuǎn)錄引物A、上述方法中所述的引物A1、上述方法中所述的反轉(zhuǎn)錄引物B和上述方法中所述的引物BI組成。
本發(fā)明可用于大批量獲取真核生物目的組織中所表達(dá)的miRNA的候選靶基因，采用核苷酸序列是CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAGmiR-X的反轉(zhuǎn)錄引物A、核苷酸序列是AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTATTTTTTTTTTTTTTT的反轉(zhuǎn)錄引物B可以獲得綿羊、豬、牛所表達(dá)的miRNA的候選靶基因，為家畜骨骼肌功能基因相關(guān)研究提供基因信息，所獲得的關(guān)鍵靶標(biāo)基因?qū)⒖芍苯舆\(yùn)用于肉羊、肉豬和肉牛分子育種。本發(fā)明的方法特別適合于構(gòu)建哺乳動(dòng)物各組織miRNA候選靶基因文庫。


圖1為反轉(zhuǎn)錄引物A的結(jié)構(gòu)。圖2為本發(fā)明的原理圖。圖3為陽性PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果。圖4為mir-133的候選靶基因序列。圖5為Myogl的序列。圖6為Myog2的序列。圖7為雙熒光檢測(cè)mir-133的候選靶基因結(jié)果。圖8為Myog基因全靶標(biāo)序列。圖9 為 Big-pr1-miR-133b 的 DNA 序列。圖10 為 pr1-miR_133b 的 DNA 序列。

圖11 為 pr1-miR-133a_l 的 DNA 序列。圖12 為 pr1-miR-122 的 DNA 序列。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到?？刹捎脠D1所示的反轉(zhuǎn)錄引物A、核苷酸序列是AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTATTTTTTTTTTTTTTT的反轉(zhuǎn)錄引物B (帶下劃線的序列為特異接頭)、核苷酸序列是TGAGTCGGCAACTCAGTCGAG 的引物 Al、核苷酸序列是 AGCGCAGCTCATCATCTGCAT 的引物 BI 構(gòu)建于羊、牛、和豬的骨骼肌miRNA的候選靶基因文庫。反轉(zhuǎn)錄引物A的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖頸部完全配對(duì)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠保證在反轉(zhuǎn)錄時(shí)莖頸部呈雙鏈狀態(tài)，只允許10堿基的種子序列區(qū)可以特異性地捕獲靶標(biāo)基因序列。反轉(zhuǎn)錄引物A的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(核苷酸序列是CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAG)是發(fā)明人經(jīng)歷數(shù)次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證證明效果最佳，優(yōu)于同類莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其序列不同于任何報(bào)道文獻(xiàn)，能值較低，結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定。其效果見表I。表1.莖環(huán)結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.獲取miRNA候選靶基因的方法，包括: 1)以名稱為反轉(zhuǎn)錄引物A的帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)和目的miRNA種子序列的DNA為反轉(zhuǎn)錄引物，對(duì)真核生物目的組織的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，該反轉(zhuǎn)錄記為反轉(zhuǎn)錄A，獲取與所述目的miRNA種子序列互補(bǔ)的mRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一條鏈，得到A庫；所述反轉(zhuǎn)錄引物A的結(jié)構(gòu)是莖環(huán)結(jié)構(gòu)-miR-X，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)滿足如下條件:所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部序列完全配對(duì)，且CG含量為57%-62%，環(huán)部不配對(duì)堿基數(shù)彡6個(gè)，且能值低于-30.0Okcal/mol ;所述miR-X是所述目的miRNA種子序列，是由10個(gè)脫氧核糖核苷酸組成的單鏈DNA,所述miR-X的5'至3'方向是3'至5'方向單鏈DNA序列的反向序列:所述3'至5'方向單鏈DNA序列是將所述目的miRNA從3'至5'方向的倒數(shù)10個(gè)核糖核苷酸均替換為所述核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧腺嘌呤核苷酸，鳥嘌呤核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧鳥嘌呤核苷酸，胞嘧啶核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧胸腺嘧啶核苷酸； 2)以名稱為反轉(zhuǎn)錄引物B的帶特異接頭和14-20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA為反轉(zhuǎn)錄引物，對(duì)所述真核生物目的組織的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲取所述真核生物目的組織的mRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一條鏈，得到B庫；所述反轉(zhuǎn)錄引物B的結(jié)構(gòu)是特異接頭-T14_2(l，所述特異接頭滿足如下條件:所述特異接頭的CG含量為50% 60%，所述特異接頭和所述反轉(zhuǎn)錄引物A的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列最大配對(duì)堿基數(shù)< 5個(gè)，最大串聯(lián)配對(duì)堿基數(shù)目小于< 4個(gè)； 3)合成所述A庫的cDNA第二條鏈得到雙鏈cDNA，記為A,庫；合成所述B庫的cDNA第二條鏈得到B'庫；將所述A'庫和所述B'庫進(jìn)行雜交得到雜交DNA分子，以所述雜交DNA分子為模板用引物Al和引物BI擴(kuò)增所述雜交DNA分子上所述引物Al和所述引物BI之間的DNA片段，收集所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)所述擴(kuò)增產(chǎn)物得到所述目的miRNA的候選靶基因；所述引物Al是選自所 述反轉(zhuǎn)錄引物A的單鏈DNA，所述引物Al的序列由所述反轉(zhuǎn)錄引物A的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)部序列和緊靠所述目的miRNA種子序列的一個(gè)莖部序列組成；所述引物BI的序列是所述反轉(zhuǎn)錄引物B的部分或全部特異接頭序列的同向互補(bǔ)序列。
2.獲取miRNA與mRNA的候選結(jié)合位點(diǎn)的方法，包括: 1)以名稱為反轉(zhuǎn)錄引物A的帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)和目的miRNA種子序列的DNA為反轉(zhuǎn)錄引物，對(duì)真核生物目的組織的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，該反轉(zhuǎn)錄記為反轉(zhuǎn)錄A，獲取與所述目的miRNA種子序列互補(bǔ)的mRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一條鏈，得到A庫；所述反轉(zhuǎn)錄引物A的結(jié)構(gòu)是莖環(huán)結(jié)構(gòu)-miR-X，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)滿足如下條件:所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部序列完全配對(duì)，且CG含量為57%-62%，環(huán)部不配對(duì)堿基數(shù)彡6個(gè)，且能值低于-30.0Okcal/mol ;所述miR-X是所述目的miRNA種子序列，是由10個(gè)脫氧核糖核苷酸組成的單鏈DNA,所述miR-X的5'至3'方向是3'至5'方向單鏈DNA序列的反向序列:所述3'至5'方向單鏈DNA序列是將所述目的miRNA從3'至5'方向的倒數(shù)10個(gè)核糖核苷酸均替換為所述核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧腺嘌呤核苷酸，鳥嘌呤核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧鳥嘌呤核苷酸，胞嘧啶核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧胸腺嘧啶核苷酸； 2)以名稱為反轉(zhuǎn)錄引物B的帶特異接頭和14-20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA為反轉(zhuǎn)錄引物，對(duì)所述真核生物目的組織的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲取所述真核生物目的組織的mRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一條鏈，得到B庫；所述反轉(zhuǎn)錄引物B的結(jié)構(gòu)是特異接頭-T14-20，所述特異接頭滿足如下條件:所述特異接頭的CG含量為50% 60%，所述特異接頭和所述反轉(zhuǎn)錄引物A的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列最大配對(duì)堿基數(shù)< 5個(gè)，最大串聯(lián)配對(duì)堿基數(shù)目小于< 4個(gè)； 3)合成所述A庫的cDNA第二條鏈得到雙鏈cDNA，記為A,庫；合成所述B庫的cDNA第二條鏈得到B'庫；將所述A'庫和所述B'庫進(jìn)行雜交得到雜交DNA分子，以所述雜交DNA分子為模板用引物Al和引物BI擴(kuò)增所述雜交DNA分子上所述引物Al和所述引物BI之間的DNA片段，收集所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)所述擴(kuò)增產(chǎn)物得到所述目的miRNA與mRNA的候選結(jié)合位點(diǎn)；所述引物Al是選自所述反轉(zhuǎn)錄引物A的單鏈DNA，所述引物Al的序列由所述反轉(zhuǎn)錄引物A的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)部序列和緊靠所述目的miRNA種子序列的一個(gè)莖部序列組成；所述引物BI的序列是所述反轉(zhuǎn)錄引物B的部分或全部特異接頭序列的同向互補(bǔ)序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述真核生物目的組織為羊、豬或牛骨骼肌，所述目的miRNA為在骨骼肌中表達(dá)的miRNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于:所述反轉(zhuǎn)錄引物A的核苷酸序列是 CTCGACTGAGTTGCCGTGAGTCGGCAACTCAGTCGAGmiR-X,所述 miR-X 是所述目的 miRNA 種子序列，是由10個(gè)脫氧核糖核苷酸組成的單鏈DNA，所述miR-X的5'至3'方向是3'至5'方向單鏈DNA序列的反向序列:所述3'至5'方向單鏈DNA序列是將所述目的miRNA從3'至5'方向的倒數(shù)10個(gè)核糖核苷酸均替換為所述核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧腺嘌呤核苷酸，鳥嘌呤核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧鳥嘌呤核苷酸，胞 嘧啶核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸是脫氧胸腺嘧啶核苷酸；所述引物Al的核苷酸序列是TGAGTCGGCAACTCAGTCGAG ;和 / 或， 所述反轉(zhuǎn)錄引物 B 的核苷酸序列是 AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTATTTTTTTTTTTTTTT,其中AACGCGTCGCGTCGAGTAGTAGACGTA為特異接頭的核苷酸序列，所述引物BI的核苷酸序列是 AGCGCAGCTCATCATCTGCAT。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述反轉(zhuǎn)錄A在42°C或37-42°C進(jìn)行；所述合成所述A庫的cDNA第二條鏈在16°C或15 25°C進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述步驟3)中，所述擴(kuò)增為PCR擴(kuò)增，所述PCR擴(kuò)增采用的引物退火條件為65°C退火30s。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增中采用的PCR反應(yīng)溫度程序:94°C預(yù)變性Imin ;94°C變性30s，65。。退火30s，72。。延伸2_3min,30個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin0
8.權(quán)利要求1-3中任一所述的反轉(zhuǎn)錄引物A。
9.用于獲取miRNA的候選靶基因的成套反轉(zhuǎn)錄引物，由獨(dú)立包裝的權(quán)利要求1-4中任一所述的反轉(zhuǎn)錄引物A和權(quán)利要求1-4中任一所述的反轉(zhuǎn)錄引物B組成。
10.用于獲取miRNA的候選靶基因的成套引物，由獨(dú)立包裝的權(quán)利要求1-4中任一所述的反轉(zhuǎn)錄引物A、權(quán)利要求1-4中任一所述的引物Al、權(quán)利要求1-4中任一所述的反轉(zhuǎn)錄引物B和權(quán)利要求1-4中任一所述的引物BI組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了獲取miRNA的候選靶基因的方法及其專用反轉(zhuǎn)錄引物。該方法包括1)以帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)和目的miRNA種子序列的DNA為反轉(zhuǎn)錄引物，獲取與目的miRNA種子序列互補(bǔ)的mRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一條鏈，得到A庫；2)以帶特異接頭和14-20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA為反轉(zhuǎn)錄引物，獲取真核生物目的組織的mRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一條鏈，得到B庫；所述反轉(zhuǎn)錄引物B的結(jié)構(gòu)是特異接頭-T14-20；3)將所述A庫和所述B庫合成雙鏈cDNA后進(jìn)行雜交得到雜交DNA分子，擴(kuò)增所述雜交DNA分子上所述目的miRNA種子序列和所述特異接頭之間的DNA片段，根據(jù)所述擴(kuò)增產(chǎn)物得到目的miRNA的候選靶基因。
文檔編號(hào)C12N15/10GK103194441SQ20131013458
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月17日
發(fā)明者甘尚權(quán), 高蕊, 王立民, 沈敏, 王新華, 劉守仁 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)墾科學(xué)院