專利名稱：一種用枯草芽孢桿菌工程菌聯(lián)合降解植物的木質(zhì)素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及構(gòu)建和應(yīng)用微生物工程菌的方法。具體是應(yīng)用微生物工程菌降解植物原料的木質(zhì)素的方法。
背景技術(shù)：
猛過(guò)氧化物酶(Manganese Peroxidase, MnP)、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(LigninPeroxidase, LiP)和漆酶(Laccase)具有共同降解木質(zhì)素的作用。植物資源不斷再生，十分豐富。植物的基本成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。其中在制造沼氣和乙醇業(yè)中有用的成分是纖維素，次之是半纖維素。前者由葡萄糖構(gòu)成，而后者由戊糖構(gòu)成。這些糖都是轉(zhuǎn)化為乙醇和沼氣的物質(zhì)。但是纖維素分子之間被木質(zhì)素鑲嵌，被鑲嵌著的纖維素不能被水解。木質(zhì)素是廣泛存在于植物體中的無(wú)定形的、分子結(jié)構(gòu)中含有氧代苯丙醇或其衍生物結(jié)構(gòu)單元的芳香性高聚物，形成纖維支架，結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定。欲利用纖維素則必須先降解木質(zhì)素。當(dāng)前用于降解木質(zhì)素的方法有物理、化學(xué)和生物的方法。物理法主要是機(jī)械粉碎法、高溫?zé)峤忸A(yù)處理以及輻射預(yù)處理等，但是物理法耗能大，并且需要特殊設(shè)備；化學(xué)法主要是酸或堿處理的方法?；瘜W(xué)處理法具有工藝簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，但是處理后的纖維素和半纖維素?fù)p失大，并 且產(chǎn)生大量的酸堿廢氣物污染環(huán)境。與化學(xué)法和物理法相t匕，當(dāng)前應(yīng)用的生物法主要是應(yīng)用天然的表達(dá)分泌降解木質(zhì)素的酶的白腐真菌與植物原料作用而降解植物原料中的木質(zhì)素。應(yīng)用白腐真菌降解植物的木質(zhì)素的優(yōu)勢(shì)在于，白腐真菌具有完整的降解木質(zhì)素的酶系(木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶和漆酶)，其不足之處是白腐真菌所含的錳過(guò)氧化物酶基因、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因和漆酶基因只是單拷貝，表達(dá)的酶的產(chǎn)量少，并且，白腐真菌生長(zhǎng)緩慢，降解木質(zhì)素的周期長(zhǎng)。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是常用于生產(chǎn)重組蛋白的微生物。枯草芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)要求低，生長(zhǎng)能力強(qiáng)，能將表達(dá)的蛋白分泌到胞外。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明構(gòu)建含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌、含木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架枯草芽孢桿菌工程菌和含漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌；用含錳過(guò)氧化物酶枯草芽孢桿菌工程菌、含木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌和含漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌與植物原料作用，通過(guò)工程菌分泌錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶而降解植物原料的木質(zhì)素。將含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌、含木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架枯草芽孢桿菌工程菌和含漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌進(jìn)行混合應(yīng)用于降解植物原料的木質(zhì)素。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:1.克隆基因:應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR或PCR技術(shù)從含錳過(guò)氧化物酶基因的微生物、含木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因的微生物和含漆酶基因的微生物中分別克隆錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶基因。
2.通過(guò)PGR擴(kuò)增或DNA序列合成獲得構(gòu)建表達(dá)載體所需的啟動(dòng)子、信號(hào)肽、轉(zhuǎn)錄終止子和抗性基因表達(dá)框架的DNA序列。3.分別構(gòu)建含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架(巨大芽孢桿菌的磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子的DNA序列-信號(hào)肽的DNA序列-錳過(guò)氧化物酶基因的DNA序列-轉(zhuǎn)錄終止子的DNA序列)的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體、含木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架(巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子的DNA序列-信號(hào)肽的DNA序列-木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因的DNA序列-轉(zhuǎn)錄終止子的DNA序列)的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體和含漆酶基因表達(dá)框架(巨大芽孢桿菌的磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子的DNA序列-信號(hào)肽的DNA序列-漆酶基因的DNA序列-轉(zhuǎn)錄終止子的DNA序列)的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體。以上所構(gòu)建的表達(dá)載體除了含有基因表達(dá)框架之外，還有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)、G418基因表達(dá)框架和氨芐青霉素基因表達(dá)框架。4.通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法將以上構(gòu)建的三種枯草芽孢桿菌表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌。根據(jù)G418抗性，篩選高拷貝重組了錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌重組子作為含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌；篩選高拷貝重組了含木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌重組子作為含木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌；篩選高拷貝重組了漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌重組子作為含漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌。5.將以上構(gòu)建的含錳 過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌、含木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌和含漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌進(jìn)行混合而作為降解植物的木質(zhì)素的枯草芽孢桿菌工程菌的混合菌。6.將以上所述的含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌、含木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌和含漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌的混合菌與植物原料作用，通過(guò)工程菌分泌錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶而降解植物的木質(zhì)素。本發(fā)明構(gòu)建含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌、含木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌和含漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌，并將這三種工程菌進(jìn)行混合應(yīng)用，將這種混合菌與植物原料作用，降解植物的木質(zhì)素的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)于:(I)由于工程菌的構(gòu)建選擇了強(qiáng)的啟動(dòng)子調(diào)控基因，生產(chǎn)性能好的微生物作為工程菌構(gòu)建的對(duì)象，所以，本發(fā)明構(gòu)建的含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌、含木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌和含漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌的混合菌不僅具備枯草芽孢桿菌本身的營(yíng)養(yǎng)要求低、生長(zhǎng)繁殖迅速等特點(diǎn)，還具備工程菌的良好表達(dá)分泌降解木質(zhì)素的酶系(錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶)的功能，這三種工程菌的混合應(yīng)用對(duì)植物的木質(zhì)素的降解作用強(qiáng)于當(dāng)前應(yīng)用于降解植物的木質(zhì)素的天然的表達(dá)分泌錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶的天然的微生物。


附圖1.枯草芽孢桿菌表達(dá)載體I。Pgap.巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子；S.MFa因子信號(hào)肽；genel.錳過(guò)氧化物酶基因；TT.轉(zhuǎn)錄終止子；G418.G418基因表達(dá)框架；ColEl.大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；AMP.氨芐青霉素基因表達(dá)框架。附圖2.枯草芽孢桿菌表達(dá)載體2。Pgap.巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子；S.MFa因子信號(hào)肽；genel.木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因；TT.轉(zhuǎn)錄終止子；G418.G418基因表達(dá)框架；ColEl.大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；AMP.氨芐青霉素基因表達(dá)框架。附圖3.枯草芽孢桿菌表達(dá)載體3。Pgap.巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子；S.MFa因子信號(hào)肽；genel.漆酶基因；TT.轉(zhuǎn)錄終止子；G418.G418基因表達(dá)框架；ColEl.大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；AMP.氨芐青霉素基因表達(dá)框架。附圖4.掃描電鏡拍的枯草芽孢桿菌工程菌1、枯草芽孢桿菌工程菌2和枯草芽孢桿菌工程菌3與水稻秸桿作用4天后的照片。附圖5.掃描電鏡拍的含錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶的白腐真菌與水稻秸桿作用4天后的照片。附圖6.掃描電鏡拍的枯草芽孢桿菌與水稻秸桿作用4天后的照片。附圖7.掃描電鏡拍的氨水與水稻秸桿作用4天后的照片。附圖8.掃描電鏡拍的天然的水稻秸桿的照片。
具體實(shí)施方式
下面采用非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例一1.1獲得酶基因及構(gòu)建表達(dá)載體所需的相關(guān)原件(I)PCR擴(kuò)增巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子序列。提取巨大芽孢桿菌的基因組DNA，以基因組DNA為模板，應(yīng)用引物5’ TTTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCA3，和 5’ GGGCATGCGGGAATACATTACGGCCGAT3，)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是其三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子序列。(2) PCR擴(kuò)增枯草芽孢桿菌的漆酶基因用蝸牛酶裂解枯草芽孢桿菌的細(xì)胞壁，提取枯草芽孢桿菌基因組DNA，應(yīng)用上游引物(5’ AACCTAGGATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC3’ )和下游引物(5’ AAGCGGCCGCCTATTTATGGGGATCAGTTATA3’ )進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是枯草芽孢桿菌的漆酶基因序列。(3)應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增白腐真菌的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因和錳過(guò)氧化物酶基因應(yīng)用RNA提取試劑盒提取白腐真菌菌屬的總RNA，以總RNA為模板，應(yīng)用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以上述合成的cDNA為模板，應(yīng)用引物I (5’ AAGAATTCGCCACCTGTTCCAACGGCAAGACCGTC3’ )和引物 2(5’ AAGCGGCCGCCTAAGCACCCGGAGGCGGAGGGATGCG3，)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因序列；以上述合成的cDNA為模板，應(yīng)用引物3 (5，CCGAATTCGCGGTCTGCCCCGACGGCACCCGCGTCA3’ )和引物 4(5’ TTGCGGCCGCCTATGCGGGACCGTTGAACTGGACACC3’ )進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的錳過(guò)氧化物酶基因序列(4)用PCR從枯草芽孢桿菌基因組中擴(kuò)增rDNA序列應(yīng)用常規(guī)方法提取枯草芽孢桿菌基因組DNA，應(yīng)用如下引物(5’ CCGGTACCgacgaacgctggcggcgtgc3:5’CCTTCGAAgcaccttccgatacggctacct3’)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲得的 PCR 產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是枯草芽孢桿菌基因組中的rDNA序列。說(shuō)明:①枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌基因組DNA提取方法:將菌細(xì)胞加于9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L山梨醇溶解)于30°C振搖30分鐘，然后按照常規(guī)的細(xì)菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA。②引物5’端的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基).
(5)合成如下氨芐青霉素基因表達(dá)框架序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒(méi)有下劃線的是氨芐青霉素抗性基因序列] 5， AAGGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCAT AGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTG CAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAG GGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAG CTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTG TCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCC CCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGC AGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTT TCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTG CCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAAC GTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGC AAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAAGCTTGG3’(6)合成如下G418抗性基因表達(dá)框架序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒(méi)有下劃線的是G418抗性基因序列]CCATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCAA⑦合成MFa因子信號(hào)肽[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒(méi)有下劃線的是α因子信號(hào)肽序列]:TTGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTGG⑧合成轉(zhuǎn)錄終止子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒(méi)有下劃線的是轉(zhuǎn)錄終止子序列]:TTACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTT TATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATC AGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGG AAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTT CTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATC GATGG1.2構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)載體(I)由專業(yè)的DNA序列合成公式合成大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的兩條堿基互補(bǔ)的雙鏈，并且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過(guò)T4DNA連接酶的作用使其環(huán)化，形成DNA克隆載體。將這克隆載體命名為BQ。(2)構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)載體1、枯草芽孢桿菌表達(dá)載體2和枯草芽孢桿菌表達(dá)載體3。①構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)載體1:通過(guò)DNA內(nèi)切酶的酶切作用和T4DNA連接酶的連接作用依次將氨芐青霉素基因表達(dá)框架、三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子、MFa因子信號(hào)肽、錳過(guò)氧化物酶基因、轉(zhuǎn)錄終止子和G418基因表達(dá)框架重組于BQ表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成枯草芽孢桿菌表達(dá)載體I (附圖1)。在表達(dá)載體I中，三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子、MFa因子信號(hào)肽、錳過(guò)氧化物酶基因和轉(zhuǎn)錄終止子統(tǒng)稱為含錳過(guò)氧化物酶基因的表達(dá)框架，它們的位置是:三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子-MF a因子信號(hào)肽-錳過(guò)氧化物酶基因-轉(zhuǎn)錄終止子。②構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)載體2:通過(guò)DNA內(nèi)切酶的酶切作用和T4DNA連接酶的連接作用依次將氨芐青霉素基因表達(dá)框架、三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子、MFa因子信號(hào)肽、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因、轉(zhuǎn)錄終止子和G418基因表達(dá)框架重組于BQ表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成枯草芽孢桿菌表達(dá)載體2(附圖2)。在表達(dá)載體2中，三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子、MFa因子信號(hào)肽、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因和轉(zhuǎn)錄終止子統(tǒng)稱為含木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因的表達(dá)框架，它們的位置是:三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子-MF a因子信號(hào)肽-木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因-轉(zhuǎn)錄終止子。③構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)載體3:通過(guò)DNA內(nèi)切酶的酶切作用和T4DNA連接酶的連接作用依次將氨芐青霉素基因表達(dá)框架、三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子、MF a因子信號(hào)肽、漆酶基因、轉(zhuǎn)錄終止子、G418基因表達(dá)框架和rDNA重組于BQ表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成枯草芽孢桿菌表達(dá)載體3 (附圖3)。在表達(dá)載體3中，三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子、MFa因子信號(hào)肽、漆酶基因和轉(zhuǎn)錄終止子統(tǒng)稱為含漆酶基因的表達(dá)框架，它們的位置是:三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子-MFa因子信號(hào)肽-漆酶基因-轉(zhuǎn)錄終止子。1.3構(gòu)建枯草芽孢桿菌工程菌用常規(guī)的氯化鈣方法制備大腸桿菌感受態(tài)，將以上構(gòu)建的載體DNA轉(zhuǎn)化于大腸桿菌，提取質(zhì)粒(載體)DNA。按照常規(guī)方法制備枯草芽孢桿菌感受態(tài)，用電轉(zhuǎn)化方法分別將以上構(gòu)建的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體1、枯草芽孢桿菌表達(dá)載體2和枯草芽孢桿菌表達(dá)載體3分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化作用的枯草芽孢桿菌細(xì)胞涂布于含G418濃度為5000 μ g/ml的LB瓊脂(I %蛋白胨，0.5 %酵母提取物，I %氯化鈉，1.5 %瓊脂粉)平板，30°C培養(yǎng)3天。將在含G418濃度為iOOyg/ml的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的克隆轉(zhuǎn)種于G418濃度為20000 μ g/ml的LB瓊脂平板上，30°C培養(yǎng)3天。挑選能在G418濃度為20000 μ g/ml的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的克隆進(jìn)行搖瓶發(fā)酵表達(dá)，根據(jù)SDS-PAGE電泳初步分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)。用離子交換和分子篩層析方法分離純化各種目標(biāo)蛋白，然后將分離純化的目標(biāo)蛋白用蛋白印跡法進(jìn)行驗(yàn)證(說(shuō)明.蛋白印跡:委托專業(yè)的多肽合成服務(wù)公司人工合成以上三種蛋白序列C端的35個(gè) 氨基酸序列，將這些合成的多肽分別注射于家兔制備抗這些多肽的抗體而應(yīng)用于蛋白印跡)證明以上所述的3種基因在枯草芽孢桿菌中表達(dá)和分泌到胞外。用常規(guī)方法進(jìn)行酶活性測(cè)定，結(jié)果證明在枯草芽孢桿菌中表達(dá)分泌的重組漆酶具有漆酶活性、在枯草芽孢桿菌中表達(dá)分泌的重組木質(zhì)素過(guò)氧化物酶具有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性和在枯草芽孢桿菌中表達(dá)分泌的的重組錳過(guò)氧化物酶具有錳過(guò)氧化物酶活性。將重組了枯草芽孢桿菌表達(dá)載體I的重組子命名為枯草芽孢桿菌工程菌1，將重組了枯草芽孢桿菌表達(dá)載體2的重組子命名為枯草芽孢桿菌工程菌2，將重組了枯草芽孢桿菌表達(dá)載體3的重組子命名為枯草芽孢桿菌工程菌3。1.4應(yīng)用混合的將枯草芽孢桿菌工程菌1、枯草芽孢桿菌工程菌2和枯草芽孢桿菌工程菌3與植物作用，降解植物的木質(zhì)素(I)將枯草芽孢桿菌工程菌1、枯草芽孢桿菌工程菌2和枯草芽孢桿菌工程菌3接種于LB液體培養(yǎng)基(I %蛋白胨，0.5 %酵母提取物，I %氯化鈉)中培養(yǎng)至0D_ = 6，取IOOOmL菌液接種于5000克(濕重)經(jīng)過(guò)粉碎的水稻秸桿中，混勻，于30°C放置4天。用常規(guī)的硫酸法測(cè)定其經(jīng)過(guò)三種枯草芽孢桿菌工程菌作用的水稻秸桿殘留木質(zhì)素的含量為
4.0%。(2)將具有分泌表達(dá)漆酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶的、通常應(yīng)用于植物原料發(fā)酵沼氣和乙醇的預(yù)處理(降解木質(zhì)素)的白腐真菌模式菌種-黃孢原毛平革菌接種于馬鈴薯培養(yǎng)基(20%馬鈴薯，2%葡萄糖)中培養(yǎng)至0D_ = 6，取IOOOmL菌液接種于5000克(濕重)經(jīng)過(guò)粉碎的水稻秸桿中，混勻，于30°C放置4天，用常規(guī)的硫酸法測(cè)定其經(jīng)過(guò)白腐真菌作用的水稻秸桿殘留木質(zhì)素的含量為9.3%。(3)將枯草芽孢桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl = 6，取IOOOmL菌液接種于5000克(濕重)經(jīng)過(guò)粉碎的水稻秸桿中，混勻，于30°C放置4天。用常規(guī)的硫酸法測(cè)定經(jīng)過(guò)枯草芽孢桿菌作用的水稻秸桿殘留的木質(zhì)素的含量為14.8%。(4)將5000克(濕重)經(jīng)過(guò)粉碎的水稻秸桿與1000mL5%氨水混勻，于30°C放置4天，用常規(guī)的硫酸法測(cè)定其經(jīng)過(guò)氨水作用的水稻秸桿殘留木質(zhì)素的含量為10.2%。(5)用常規(guī)的硫酸法測(cè)定沒(méi)有經(jīng)過(guò)處理的秸桿的木質(zhì)素的含量為15.0%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，將枯草芽孢桿菌工程菌1、枯草芽孢桿菌工程菌I和枯草芽孢桿菌工程菌3混合應(yīng)用降解植物的木質(zhì)素的效果極顯著強(qiáng)于枯草芽孢桿菌(P < 0.001)、極顯著強(qiáng)于白腐真菌(P <0.001)以及極顯著強(qiáng)于氨水(P <0.001)的降解木質(zhì)素的效果。實(shí)施例二2.1獲得酶基因及構(gòu)建表達(dá)載體所需的相關(guān)原件(I)PCR擴(kuò)增巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子序列。提取巨大芽孢桿菌的基因組DNA，以基因組DNA為模板，應(yīng)用引物5’ TTTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCA3，和 5’ GGGCATGCGGGAATACATTACGGCCGAT3，)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定和用 NCBI提供的BLAST軟件分析證明是其三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子序列。(2) PCR擴(kuò)增枯草芽孢桿菌的漆酶基因用蝸牛酶裂解枯草芽孢桿菌的細(xì)胞壁，提取枯草芽孢桿菌基因組DNA，應(yīng)用上游引物(5’ AACCTAGGATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC3’ )和下游引物(5’ AAGCGGCCGCCTATTTATGGGGATCAGTTATA3’ )進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是枯草芽孢桿菌的漆酶基因序列。(3)應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增白腐真菌的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因和錳過(guò)氧化物酶基因應(yīng)用RNA提取試劑盒提取白腐真菌菌屬的總RNA，以總RNA為模板，應(yīng)用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以上述合成的cDNA為模板，應(yīng)用引物I (5’ AAGAATTCGCCACCTGTTCCAACGGCAAGACCGTC3’ )和引物 2(5’ AAGCGGCCGCCTAAGCACCCGGAGGCGGAGGGATGCG3，)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因序列；以上述合成的cDNA為模板，應(yīng)用引物3 (5，CCGAATTCGCGGTCTGCCCCGACGGCACCCGCGTCA3’ )和引物 4(5’ TTGCGGCCGCCTATGCGGGACCGTTGAACTGGACACC3’ )進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的錳過(guò)氧化物酶基因序列(4)用PCR從枯草芽孢桿菌基因組中擴(kuò)增rDNA序列應(yīng)用常規(guī)方法提取枯草芽孢桿菌基因組DNA，應(yīng)用如下引物(5’ CCGGTACCgacgaacgctggcggcgtgc3:5’CCTTCGAAgcaccttccgatacggctacct3’)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲得的 PCR 產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是枯草芽孢桿菌基因組中的rDNA序列。說(shuō)明:①枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌基因組DNA提取方法:將菌細(xì)胞加于9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L山梨醇溶解)于30°C振搖30分鐘，然后按照常規(guī)的細(xì)菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA。②引物5’端的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基).
(5)合成如下氨芐青霉素基因表達(dá)框架序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒(méi)有下劃線的是氨芐青霉素抗性基因序列]
5’ AAGGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCAT AGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTG CAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAG GGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAG CTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTG TCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCC CCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGC AGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTT TCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTG CCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAAC GTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGC AAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAAGCTTGG3’(6)合成如下G418抗性基因表達(dá)框架序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒(méi)有下劃線的是G418抗性基因序列]CCATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCAA ⑦合成MF α因子信號(hào)肽[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒(méi)有下劃線的是a因子信號(hào)肽序列]:TTGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTGG⑧合成轉(zhuǎn)錄終止子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒(méi)有下劃線的是轉(zhuǎn)錄終止子序列]:TTACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTT TATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATC AGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTT CTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATC GATGG2.2構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)載體(I)由專業(yè)的DNA序列合成公式合成大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的兩條堿基互補(bǔ)的雙鏈，并且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過(guò)T4DNA連接酶的作用使其環(huán)化，形成DNA克隆載體。將這克隆載體命名為BQ。(2)構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)載體1、枯草芽孢桿菌表達(dá)載體2和枯草芽孢桿菌表達(dá)載體3。①構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)載體1:通過(guò)DNA內(nèi)切酶的酶切作用和T4DNA連接酶的連接作用依次將氨芐青霉素基因表達(dá)框架、三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子、MFa因子信號(hào)肽、錳過(guò)氧化物酶基因、轉(zhuǎn)錄終止子和G418基因表達(dá)框架重組于BQ表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成枯草芽孢桿菌表達(dá)載體I (附圖1)。在表達(dá)載體I中，三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子、MFa因子信號(hào)肽、錳過(guò)氧化物酶基因和轉(zhuǎn)錄終止子統(tǒng)稱為含錳過(guò)氧化物酶基因的表達(dá)框架，它們的位置是:三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子-MF a因子信號(hào)肽-錳過(guò)氧化物酶基因-轉(zhuǎn)錄終止子。②構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)載體2:通過(guò)DNA內(nèi)切酶的酶切作用和T4DNA連接酶的連接作用依次將氨芐青霉素基因表達(dá)框架、三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子、MFa因子信號(hào)肽、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因、轉(zhuǎn)錄終止子和G418基因表達(dá)框架重組于BQ表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成枯草芽孢桿菌表達(dá)載體2(附圖2)。在表達(dá)載體2中，三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子、MFa因子信號(hào)肽、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因和轉(zhuǎn)錄終止子統(tǒng)稱為含木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因的表達(dá)框架，它們的位置是:三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子-MF a因子信號(hào)肽-木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因-轉(zhuǎn)錄終止子。③構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)載體3:通過(guò)DNA內(nèi)切酶的酶切作用和T4DNA連接酶的連接作用依次將氨芐青霉素基因表達(dá)框架、三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子、MF a因子信號(hào)肽、漆酶基因、轉(zhuǎn)錄終止子、G418基因表達(dá)框架和rDNA重組于BQ表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成枯草芽孢桿菌表達(dá)載體3 (附圖
3)。在表達(dá)載體3中，三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子、MFa因子信號(hào)肽、漆酶基因和轉(zhuǎn)錄終止子統(tǒng)稱為含漆酶基因的表達(dá)框架，它們的位置是:三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子-MFa因子信號(hào)肽-漆酶基因-轉(zhuǎn)錄終止子。2.3構(gòu)建枯草芽孢桿菌工程菌 用常規(guī)的氯化鈣方法制備大腸桿菌感受態(tài)，將以上構(gòu)建的載體DNA轉(zhuǎn)化于大腸桿菌，提取質(zhì)粒(載體)DNA。按照常規(guī)方法制備枯草芽孢桿菌感受態(tài)，用電轉(zhuǎn)化方法分別將以上構(gòu)建的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體1、枯草芽孢桿菌表達(dá)載體2和枯草芽孢桿菌表達(dá)載體3分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化作用的枯草芽孢桿菌細(xì)胞涂布于含G418濃度為5000 μ g/ml的LB瓊脂(I %蛋白胨，0.5 %酵母提取物，I %氯化鈉，1.5 %瓊脂粉)平板，30°C培養(yǎng)3天。將在含G418濃度為700 μ g/ml的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的克隆轉(zhuǎn)種于G418濃度為20000 μ g/ml的LB瓊脂平板上，30°C培養(yǎng)3天。挑選能在G418濃度為20000 μ g/ml的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的克隆進(jìn)行搖瓶發(fā)酵表達(dá)，根據(jù)SDS-PAGE電泳初步分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)。用離子交換和分子篩層析方法分離純化各種目標(biāo)蛋白，然后將分離純化的目標(biāo)蛋白用蛋白印跡法進(jìn)行驗(yàn)證(說(shuō)明.蛋白印跡:委托專業(yè)的多肽合成服務(wù)公司人工合成以上三種蛋白序列C端的35個(gè)氨基酸序列，將這些合成的多肽分別注射于家兔制備抗這些多肽的抗體而應(yīng)用于蛋白印跡)證明以上所述的3種基因在枯草芽孢桿菌中表達(dá)和分泌到胞外。用常規(guī)方法進(jìn)行酶活性測(cè)定，結(jié)果證明在枯草芽孢桿菌中表達(dá)分泌的重組漆酶具有漆酶活性、在枯草芽孢桿菌中表達(dá)分泌的重組木質(zhì)素過(guò)氧化物酶具有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性和在枯草芽孢桿菌中表達(dá)分泌的重組錳過(guò)氧化物酶具有錳過(guò)氧化物酶活性。將重組了枯草芽孢桿菌表達(dá)載體I的重組子命名為枯草芽孢桿菌工程菌1，將重組了枯草芽孢桿菌表達(dá)載體2的重組子命名為枯草芽孢桿菌工程菌2，將重組了枯草芽孢桿菌表達(dá)載體3的重組子命名為枯草芽孢桿菌工程菌3。2.4應(yīng)用混合的將枯草芽孢桿菌工程菌1、枯草芽孢桿菌工程菌2和枯草芽孢桿菌工程菌3與植物作用，降解植物的木質(zhì)素(I)將枯草芽孢桿菌工程菌1、枯草芽孢桿菌工程菌2和枯草芽孢桿菌工程菌3接種于LB液體培養(yǎng)基(I %蛋白胨，0.5 %酵母提取物，I %氯化鈉)中培養(yǎng)至0D_ = 6，取IOOOmL菌液接種于5000克(濕重)經(jīng)過(guò)粉碎的水稻秸桿中，混勻，于30°C放置4天。掃描電鏡觀察展示，水稻秸桿的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生明顯的改變，大部分木質(zhì)素已經(jīng)被降解，纖維素裸露(附圖4)。(2)將具有分泌表達(dá)漆酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶的、通常應(yīng)用于植物原料發(fā)酵沼氣和乙醇的預(yù)處理(降解木質(zhì)素)的白腐真菌模式菌種-黃孢原毛平革菌接種于馬鈴薯培養(yǎng)基(20%馬鈴薯，2%葡萄糖)中培養(yǎng)至0D_ = 6，取IOOOmL菌液接種于5000克(濕重)經(jīng)過(guò)粉碎的水稻秸桿中，混勻，于30°C放置4天。掃描電鏡觀察展示，水稻秸桿的細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)僅部分發(fā)生改變，沒(méi)有明顯的纖維素裸露的現(xiàn)象(附圖5)。(3)將枯草芽孢桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl = 6，取IOOOmL菌液接種于5000克(濕重)經(jīng)過(guò)粉碎的水稻秸桿中，混勻，于30°C放置4天。掃描電鏡觀察展示，水稻秸桿的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整 (附圖6)。(4)將5000克(濕重)經(jīng)過(guò)粉碎的水稻稻桿與1000mL5%氨水混勻，于30°C放置4天，掃描電鏡觀察展示，水稻秸桿的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較完整(附圖7)。(5)掃描電鏡觀察展示，沒(méi)有經(jīng)過(guò)處理的秸桿結(jié)構(gòu)完整(附圖8)。
權(quán)利要求
1.一種用枯草芽孢桿菌工程菌聯(lián)合降解植物的木質(zhì)素的方法，其特征在于:通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)從微生物中克隆錳過(guò)氧化物酶基因、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因和漆酶基因；構(gòu)建含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體、含木質(zhì)素過(guò)氧化酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體和含漆酶基因表達(dá)框架的表達(dá)載體；分別將上述構(gòu)建的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，并通過(guò)G418抗性篩選分別獲得表達(dá)載體高拷貝重組的含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌、含木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌和含漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌；將以上所述的三種枯草芽孢桿菌工程菌混合應(yīng)用，通過(guò)表達(dá)和分泌錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶而聯(lián)合降解植物的木質(zhì)素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用不同枯草芽孢桿菌工程菌聯(lián)合降解植物的木質(zhì)素的方法，其特征在于:利用權(quán)利要求1所述的方法制備降解植物的木質(zhì)素的含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌、含木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌和含漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌的混合菌的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用枯草芽孢桿菌工程菌聯(lián)合降解植物的木質(zhì)素的方法。屬生物技術(shù)領(lǐng)域。從微生物中克隆錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶基因；構(gòu)建含錳過(guò)氧化物酶基因的表達(dá)載體、含木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因的表達(dá)載體和含漆酶基因的表達(dá)載體。分別將以上所述的三種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，用G418抗性篩選而獲得含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌、含木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌和含漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌。將這三種工程菌與植物原料作用而聯(lián)合降解植物的木質(zhì)素。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)于這三種枯草芽孢桿菌工程菌對(duì)木質(zhì)素的降解作用強(qiáng)于當(dāng)前應(yīng)用于降解植物的木質(zhì)素的天然的微生物。
文檔編號(hào)C12N15/75GK103215284SQ20131013462
公開(kāi)日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月3日
發(fā)明者張愛(ài)聯(lián), 符仙, 楊穗珊, 尹慧祥 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所