專利名稱：一種無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，尤其是一種無動物血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)是干細(xì)胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。間充質(zhì)干細(xì)胞最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注。間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。目前國內(nèi)外對于間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增體系主要是基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加5-10%濃度的胎牛血清(FBS)。FBS中含有異種蛋白質(zhì)，它本身有攜帶細(xì)菌、病毒、蛋白傳染性疾病或朊病毒的風(fēng)險。另外，有研究表明干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中可以吞噬培養(yǎng)基中的蛋白，內(nèi)含有牛血清蛋白(7mg-30mg/108個細(xì)胞)，可以使受者體內(nèi)產(chǎn)生抗牛蛋白抗體，引起免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致患者尤其在重復(fù)輸注間充質(zhì)干細(xì)胞治療后治療失效。因此FBS在間充質(zhì)干細(xì)胞臨床大規(guī)模培養(yǎng)中的不利因素已經(jīng)逐漸暴露出來，現(xiàn)已有很多學(xué)者研究FBS的替代品。當(dāng)前已有一些公司開發(fā)新一代無血清培養(yǎng)基。但是現(xiàn)有無血清培養(yǎng)基或化學(xué)成分不確定，或價格昂貴，或難以保證培養(yǎng)基批次間的一致性。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，有必要針對上述問題，提供一種無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基。
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為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:一種無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加成份組成；其中,基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM-LG，添加成份及其含量如下:堿性成纖維生長因子:5_20ng/mL ；表皮生長因子:5_20ng/mL ；青霉素:100U/mL;鏈霉素:100μ g/mL ;肝素:50-200μ g/mL ；L-谷氨酰胺:2-8mM ；2-巰基乙醇:100-300 μ M ；白血病抑制因子:500_2000U/mL ；丙酮酸鈉:0.5_2mM。作為本發(fā)明無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述堿性成纖維生長因子為15ng/mL ;表皮生長因子為15ng/mL。
作為本發(fā)明無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述肝素為100 μ g/mL。作為本發(fā)明無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述L-谷氨酰胺為5mM。作為本發(fā)明無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述2-巰基乙醇為0.1mM。作為本發(fā)明無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述白血病抑制因子為1000U/mL。作為本發(fā)明無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述丙酮酸鈉為ImM。本發(fā)明無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，不含血清，可避免批間差異和血清組分對細(xì)胞培養(yǎng)的影響，成本低；避免血清的外源性污染和對細(xì)胞毒性作用；成分明確，有利于研究細(xì)胞的生理調(diào)節(jié)機(jī)制。


圖1不同干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)圖片；圖1A為本發(fā)明無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)圖片；圖1B為普通干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的的形態(tài)圖片。
具體實(shí)施方式
為了更好的了解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步說明。

喊性成纖維細(xì)胞生長因子(BasicFibroblast Growth Factor,bFGF)是含 155 個氨基酸的促有絲分裂的陽離子多肽，分子量為16 18.5KD。bFGF具有廣泛的生物學(xué)作用，對多種細(xì)胞的生長、分化及功能有影響，在正常生理和病理過程中發(fā)揮作用，其主要生物學(xué)作用有:(I)作為血管生長因子；(2)促進(jìn)創(chuàng)傷愈合與組織修復(fù)；(3)促進(jìn)組織再生；(4)參與神經(jīng)再生等。bFGF有很強(qiáng)的肝素親和力，在其114 123位氨基酸為高親和力區(qū)，其它部位則有低親和力區(qū)?？筨FGF與受體結(jié)合的單克隆抗體對其與肝素結(jié)合力無影響，取消有羥基端42位氨基酸，肝素親和力即消失，而且可喪失部分生物學(xué)活性。肝素是一種由D-葡糖胺、L-艾杜糖醛酸、N-乙酰葡糖胺及葡糖醛酸交替組成的粘多糖硫酸酯，分子量從5至30kDa，其中硫酸根約占40%。肝素主要是由肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生，在肺、心、肝、肌肉等組織中含量豐富，生理情況下血漿中含量甚微。無論在體內(nèi)還是體外，肝素的抗凝作用都很強(qiáng)，故臨床把它作為抗凝劑廣泛使用。表皮生長因子(Epidermal Growth Factor, EGF)是一種小肽，由53個氨基酸殘基組成，EGF是一種多功能的生長因子，在體內(nèi)體外都對多種組織細(xì)胞有強(qiáng)烈的促分裂作用。L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時起到很重要的作用。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝；在缺少谷氨酰胺時，細(xì)胞生長不良而死亡。L-谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置-20°C冰凍保存，用前加入培養(yǎng)基中。加有L-谷氨酰胺的液體培養(yǎng)基4°C冰箱儲存兩周以上時，應(yīng)重新加入原來量的L-谷氨酰胺。
2-巰基乙醇(又稱為β -巰基乙醇)是一種有機(jī)化合物，其化學(xué)式為HOCH2CH2SH,它兼具乙二醇(HOCH2CH2OH)和乙二硫醇(HSCH2CH2SH)的官能團(tuán)，通常用于二硫鍵的還原，保護(hù)二硫鍵，從而使蛋白質(zhì)不被氧化掉而失活。白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor,LIF)具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和表型的作用；丙酮酸鈉(分子式CH3COCOONa,分子量110.04g/mol)可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源。實(shí)施例1一種無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加成份組成；其中,基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM-LG，添加成份及其含量如下:堿性成纖維生長因子:15ng/mL ;表皮生長因子:15ng/mL ;青霉素:100U/mL;鏈霉素:100μ g/mL ;肝素:100μ g/mL;L-谷氨酰胺:5mM;2-巰基乙醇:100μΜ;白血病抑制因子:1000U/mL ;`
丙酮酸鈉:ImM。使用本發(fā)明無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的效果如下。1.把經(jīng)常規(guī)膠原酶I消化法分離所得并液氮保存的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞凍存管從液氮中取出來，立即投入37°C水浴鍋中，輕微搖動，液體都融化后(約1-1.5分鐘)，拿出來噴少許酒精放到超凈工作臺里。2.把上述經(jīng)37°C解凍后的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞吸到裝有IOmL培養(yǎng)基的15mL的離心管中，再用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細(xì)胞都洗下來，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。3.把上清液倒掉，分別加ImL制備好的上述培養(yǎng)基，把細(xì)胞懸浮起來；吸到裝有IOmL培養(yǎng)基的IOcm培養(yǎng)皿中前后左右輕輕搖動，使培養(yǎng)皿中的細(xì)胞均勻分布。4.標(biāo)好細(xì)胞種類和日期、培養(yǎng)基種類人等，放到CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后換培養(yǎng)基。5.培養(yǎng)皿中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%_90%時，采用Invitrogen公司的全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀Countess進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM-LG中添加10%的胎牛血清(體積分?jǐn)?shù))，作為對照培養(yǎng)基培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。使用本發(fā)明無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞密度為2 X IO7個/mL，使用對照培養(yǎng)基培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞密度為2 X IO6個/mL。本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基含有高濃度的谷氨酰胺，可以顯著提高脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的生長速度，有效改善脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的生長狀態(tài)，保持脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性不變。如圖1所示，培養(yǎng)于本發(fā)明無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞保持良好的貼壁特性，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞均呈現(xiàn)出梭形的成纖維狀細(xì)胞形態(tài)。
以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此 ，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加成份組成，其特征在于基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM-LG，添加成份及其含量如下 堿性成纖維生長因子5-20ng/mL ； 表皮生長因子5-20ng/mL ； 青霉素100U/mL ； 鏈霉素100μ g/mL ； 肝素50-200 μ g/mL ； L-谷氨酰胺2_8mM ； 2-巰基乙醇100-300μΜ ; 白血病抑制因子500-2000U/mL ； 丙酮酸鈉0. 5-2mM。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于所述堿性成纖維生長因子為15ng/mL ;表皮生長因子為15ng/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于所述肝素為 100 μ g/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于所述L-谷氨酰胺為5mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于所述2-巰基乙醇為O. ImM。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于所述白血病抑制因子為1000U/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于所述丙酮酸鈉為ImM。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加成份組成；其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM-LG，添加成份及其含量如下堿性成纖維生長因子5-20ng/mL；表皮生長因子5-20ng/mL；青霉素100U/mL；鏈霉素100μg/mL；肝素50-200μg/mL；L-谷氨酰胺2-8mM；2-巰基乙醇100-300μM；白血病抑制因子500-2000U/mL；丙酮酸鈉0.5-2mM。本發(fā)明無血清的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，不含血清，可避免批間差異和血清組分對細(xì)胞培養(yǎng)的影響；避免血清的外源性污染和對細(xì)胞毒性作用；成分明確，有利于研究細(xì)胞的生理調(diào)節(jié)機(jī)制。
文檔編號C12N5/0775GK103255103SQ20131013450
公開日2013年8月21日 申請日期2013年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月17日
發(fā)明者馮文峰, 佘志勇, 方海慶, 陳建興 申請人:廣州愛菲科生物科技有限公司