專利名稱：一種腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)方法。
背景技術(shù)：
在過去的幾十年里，抗腫瘤藥的篩選主要是考察其對快速生長細(xì)胞的毒性作用。隨著腫瘤生物學(xué)研究的發(fā)展，人們認(rèn)識到:腫瘤細(xì)胞不僅具有旺盛的增殖能力，而且還具有破壞自身組織、浸潤相鄰組織以及浸潤血管或淋巴管并隨著血液或淋巴液轉(zhuǎn)移到其他組織的能力。腫瘤和正常組織的相互作用與腫瘤的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移等特性有很大的關(guān)系。腫瘤轉(zhuǎn)移已成為近年來的研究熱點(diǎn)之一，現(xiàn)有腫瘤轉(zhuǎn)移的研究主要包括體外或體內(nèi)模型。體內(nèi)模型主要采用免疫功能低下的小鼠或大鼠來研究，主要包括:1.自發(fā)模型；
2.基因工程模型；3.腫瘤移 植模型。其中，自發(fā)模型的模型低重復(fù)性和基因工程模型的高價(jià)格以及高技術(shù)要求使得這兩種模型更多的應(yīng)用于腫瘤病因和藥物預(yù)防研究中?？梢浦材[瘤模型以其良好的相似性和重復(fù)性廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥的臨床前篩選，但該模型有重要的缺陷，即皮下移植很少轉(zhuǎn)移，侵襲力也很弱，不適合用于針對原發(fā)灶的自發(fā)轉(zhuǎn)移進(jìn)行新藥篩選。另外，抗腫瘤轉(zhuǎn)移的臨床藥效學(xué)評價(jià)，最直接的支持依據(jù)應(yīng)該是對轉(zhuǎn)移灶的影響結(jié)果。但在對轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)的時(shí)間、部位、病理類型，尤其是微小轉(zhuǎn)移灶的檢測方面，目前存在有相當(dāng)大的困難。因此很難獲得抗腫瘤轉(zhuǎn)移的直接指標(biāo)。通常的采用的腫瘤緩解率、增長速度、輔助性的腫瘤轉(zhuǎn)移生化指標(biāo)等，難以為抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用提供客觀的直接依據(jù)，更難以將抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用與抗腫瘤作用區(qū)別開來。這些都給受試藥物抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的判斷帶來了挑戰(zhàn)。體外模型主要集中于單個(gè)分子的機(jī)制研究和侵襲轉(zhuǎn)移能力的檢測，現(xiàn)有測試方法不僅不方便，而且僅考慮單個(gè)分子，造成測試結(jié)果不準(zhǔn)確。在任何國家新藥研發(fā)都是一個(gè)高投入，高風(fēng)險(xiǎn)耗時(shí)長但一旦成功便會有巨大效益的艱苦過程。如何在較短的研發(fā)周期內(nèi)研發(fā)出高效、安全的抗腫瘤藥物是一個(gè)世界性難題。特別是我國長期以仿制國外藥品為主，由于研究經(jīng)費(fèi)短缺，技術(shù)、設(shè)備落后、供篩樣品過少等原因，使新藥篩選與相關(guān)基礎(chǔ)研究成為新藥研究系統(tǒng)工程中最薄弱的環(huán)節(jié)。因此，本專利涉及的用于評價(jià)抑制腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的抗腫瘤藥物的方法在抗腫瘤藥物研發(fā)領(lǐng)域有著廣闊的推廣應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的:本發(fā)明的第一目的是提供一種工藝簡單、效率高的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)方法。本發(fā)明的第二目的是提供了利用上述方法篩選的轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的第三目的是提供了上述轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞在抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選中的應(yīng)用。技術(shù)方案:本發(fā)明提供的一種腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)方法，包括以下步驟:
(I)腫瘤細(xì)胞的采集與培養(yǎng):采集待評價(jià)腫瘤細(xì)胞得細(xì)胞懸液，培養(yǎng)細(xì)胞懸液；(2)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià):將培養(yǎng)后的細(xì)胞懸液于聚丙烯酰胺培養(yǎng)基底上繼續(xù)培養(yǎng)，給予抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物后，觀察細(xì)胞形態(tài)，定量分析細(xì)胞層的面積、細(xì)胞與聚丙烯酰胺培養(yǎng)基底連接的強(qiáng)度、細(xì)胞間連接的強(qiáng)度并作為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，藥物刺激后Colo205細(xì)胞面積大于20 μ m2、細(xì)胞間強(qiáng)度變化10倍以上者即判定為有效體。步驟(I)中，腫瘤細(xì)胞的采集方法為:取待評價(jià)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆化，并制成細(xì)胞懸液；優(yōu)選地，本發(fā)明采用以下方法，以進(jìn)一步提高篩選精度:取待評價(jià)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆化得待評價(jià)腫瘤細(xì)胞的單克隆細(xì)胞，以10 μ M Staurosporin對單克隆細(xì)胞進(jìn)行刺激誘導(dǎo)單克隆細(xì)胞之間恢復(fù)細(xì)胞連接，選取刺激前后細(xì)胞面積變化最大的單克隆細(xì)胞制成細(xì)胞懸液；更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為Colo205細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞的采集方法為:取Colo205細(xì)胞進(jìn)行單克隆化，以ΙΟμΜ Staurosporin對單克隆細(xì)胞進(jìn)行刺激誘導(dǎo)恢復(fù)細(xì)胞連接,選取刺激前后細(xì)胞面積變化最大的克隆為實(shí)驗(yàn)對象，并制備細(xì)胞懸液。步驟(I)中，腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方法為:離心細(xì)胞懸液，沉淀加入DMEM10%血清培養(yǎng)基于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時(shí)間24-48h，pH為7.0-7.2，CO2濃度為5%。步驟(2)中，抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物為Nocodazole、Staurosporin。步驟(2)中，細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞層面積的測定方法為:通過細(xì)胞膜免疫熒光染色、生物顯微鏡成像來對細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞層面積進(jìn)行測定。步驟(2)中，細(xì)胞與聚丙烯酰胺培養(yǎng)基底連接的強(qiáng)度的測定方法為:對細(xì)胞與基底部連接的蛋白標(biāo)識物分子Vinculin的信號數(shù)量進(jìn)行定量測定。步驟⑵中，細(xì)胞間連接的強(qiáng)度:通過對細(xì)胞間連接分子E-cadherin蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫染色，繼而進(jìn)行定量測定。本發(fā)明還給出了 上述的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)方法在抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選中的應(yīng)用，以腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)的結(jié)果作為抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選的依據(jù)進(jìn)行抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選。有益效果:本發(fā)明提供的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)方法成本低廉、操作簡便、結(jié)果易判、快速準(zhǔn)確。本發(fā)明利用上述方法，以分子生物學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)手段為基礎(chǔ)，篩選出轉(zhuǎn)移性較強(qiáng)腫瘤細(xì)胞，并建立體外癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型，能夠高效篩選出對癌癥細(xì)胞的轉(zhuǎn)移具有潛在抑制作用的藥物，為高通量藥物篩選提供簡單易行的方法，縮短新藥的開發(fā)周期，該方法具有成本低廉、操作簡便、結(jié)果易判、快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)。傳統(tǒng)新藥開發(fā)方法通常需要確定化合物、研發(fā)、臨床一二三期，通常需要經(jīng)歷10-15年才能開發(fā)出新的藥物，采用本方法利用轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞可直接高通量篩選現(xiàn)有藥物，篩選后僅需進(jìn)行臨床三期評價(jià)即可得到抗腫瘤轉(zhuǎn)移新藥，開發(fā)周期大大縮短。


:圖1為藥物刺激前后大腸癌上皮細(xì)胞Colo205的變化。圖2為藥物刺激前后大腸癌上皮細(xì)胞Colo205的變化；圖中存在綠色的E-cadherin免疫熒光染色。
圖3為藥物刺激前后大腸癌上皮細(xì)胞CaCo2的變化；圖中存在綠色的E-cadherin免疫熒光染色。圖4為進(jìn)行藥物篩選的96孔板。圖5為利用本發(fā)明轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物流程圖。
具體實(shí)施方式
:根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。本發(fā)明所用試劑及其來源為:Staurosporiin S4400Sigma-AldrichNocodazole ml404Sigma-AldrichDMEM 培養(yǎng)基 I2491-Ol5InvitrogenE-cadherin 抗體 abl416AbcamVinculin 抗體 V4319Sigma-Aldrich本發(fā)明所用軟件及其來源為:本項(xiàng)目所采用軟件來源為imagej軟件進(jìn)行定量分析。參考:http: //rsb.1nfo, nih.gov/i i/實(shí)施例1利用腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)方法篩選轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞Colo205、CaCo2評價(jià)其轉(zhuǎn)移能力，包括以下步驟:(I)腫瘤細(xì)胞的采集與培養(yǎng):取Colo205、CaCo2細(xì)胞進(jìn)行單克隆化，以10M Staurosporin對單克隆細(xì)胞進(jìn)行刺激誘導(dǎo)恢復(fù)細(xì)胞連接，選取刺激前后細(xì)胞面積變化最大的克隆為實(shí)驗(yàn)對象，并制備細(xì)胞懸液；也可以采用下述方法采集腫瘤細(xì)胞:取待評價(jià)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆化，并制成細(xì)胞懸液；或，取待評價(jià)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆化得待評價(jià)腫瘤細(xì)胞的單克隆細(xì)胞，以Staurosporin對單克隆細(xì)胞進(jìn)行刺激誘導(dǎo)單克隆細(xì)胞之間恢復(fù)細(xì)胞連接,選取刺激前后細(xì)胞面積變化最大的單克隆細(xì)胞制成細(xì)胞懸液；離心細(xì)胞懸液，沉淀加入DMEM10%血清培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時(shí)間為 24-48h, pH 為 7.0-7.2，CO2 濃度為 5%。(2)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià):將細(xì)胞懸液于聚丙烯酰胺培養(yǎng)基底上培養(yǎng)，給予抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物后，觀察細(xì)胞形態(tài)，定量分析細(xì)胞層的面積、細(xì)胞與聚丙烯酰胺培養(yǎng)基底連接的強(qiáng)度、細(xì)胞間連接的強(qiáng)度，所述抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物可選擇Nocodazole或Staurosporin中的一種，具體而言:a.細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞層面積的測定方法為:通過細(xì)胞膜免疫熒光染色、生物顯微鏡DIC成像來對細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞層面積進(jìn)行測定；當(dāng)細(xì)胞層面積小于20 μ m2即認(rèn)為其對細(xì)胞細(xì)胞連接無影響。細(xì)胞面積測定方法:http://rsb.1nfo, nih.gov/ii/plugins/cell-counter, html
b.細(xì)胞與聚丙烯酰胺培養(yǎng)基底連接的強(qiáng)度的測定方法為:對細(xì)胞與基底部連接的蛋白標(biāo)識物分子Vinculin的信號數(shù)量進(jìn)行定量測定。測定細(xì)胞與聚丙烯酰胺培養(yǎng)基底連接的強(qiáng)度測定方法:http://rsb.1nfo, nih.gov/ii/plugins/particle-analyzer.htmlc.細(xì)胞與細(xì)胞間連接的強(qiáng)度:通過對細(xì)胞間連接分子E-cadherin蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫染色，以細(xì)胞連接處與細(xì)胞質(zhì)中E-cadherin的免疫熒光強(qiáng)度之比作為細(xì)胞連接的強(qiáng)度指標(biāo)，繼而進(jìn)行定量測定。細(xì)胞連接強(qiáng)度測定方法:http://rsb.1nfo, nih.gov/ii/plugins/radial-profiIe.html測定結(jié)果(表一):
權(quán)利要求
1.一種腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)腫瘤細(xì)胞的采集與培養(yǎng):采集待評價(jià)腫瘤細(xì)胞得細(xì)胞懸液，培養(yǎng)細(xì)胞懸液； (2)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià):將培養(yǎng)后的細(xì)胞懸液于聚丙烯酰胺培養(yǎng)基底上繼續(xù)培養(yǎng)，給予抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物后，觀察細(xì)胞形態(tài)，定量分析細(xì)胞層的面積、細(xì)胞與聚丙烯酰胺培養(yǎng)基底連接的強(qiáng)度、細(xì)胞間連接的強(qiáng)度并作為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)方法，其特征在于:步驟(I)中，腫瘤細(xì)胞的采集方法為:取待評價(jià)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆化，并制成細(xì)胞懸液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)方法，其特征在于:步驟(I)中，腫瘤細(xì)胞的采集方法為:取待評價(jià)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆化得待評價(jià)腫瘤細(xì)胞的單克隆細(xì)胞，以ΙΟμΜ Staurosporin對單克隆細(xì)胞進(jìn)行刺激誘導(dǎo)單克隆細(xì)胞之間恢復(fù)細(xì)胞連接,選取刺激前后細(xì)胞面積變化最大的單克隆細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)方法，其特征在于:步驟(I)中，所述腫瘤細(xì)胞為Colo205細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞的采集方法為:取Colo205細(xì)胞進(jìn)行單克隆化，以10 μ M Staurosporin對單克隆細(xì)胞進(jìn)行刺激誘導(dǎo)恢復(fù)細(xì)胞連接,選取刺激前后細(xì)胞面積變化最大的克隆為實(shí)驗(yàn)對象，并制備細(xì)胞懸液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)方法，其特征在于:步驟(I)中，腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方法為:離心細(xì)胞懸液，沉淀加入DMEM10%血清培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為370C，培養(yǎng)時(shí)間為24-48h，pH為7.0-7.2，CO2濃度為5%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)方法，其特征在于:步驟(2)中，細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞層面積的測定方法為:通過細(xì)胞膜免疫熒光染色、生物顯微鏡成像對細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞層面積進(jìn)行測定。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)方法，其特征在于:步驟(2)中，細(xì)胞與聚丙烯酰胺培養(yǎng)基底連接的強(qiáng)度的測定方法為:對單位細(xì)胞的基底部連接的蛋白標(biāo)識物分子Vinculin的信號數(shù)量進(jìn)行定量測定。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)方法，其特征在于:步驟(2)中，細(xì)胞間連接的強(qiáng)度:通過對細(xì)胞間連接分子E-cadherin進(jìn)行熒光免疫染色，繼而進(jìn)行定量分析。
9.權(quán)利要求1所述的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)方法在抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選中的應(yīng)用，其特征在于:以腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)的結(jié)果作為抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選的依據(jù)進(jìn)行抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)方法，包括以下步驟腫瘤細(xì)胞的采集與培養(yǎng)采集待評價(jià)腫瘤細(xì)胞得細(xì)胞懸液，培養(yǎng)細(xì)胞懸液；腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)給予抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物后，檢測細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞層面積、細(xì)胞與聚丙烯酰胺培養(yǎng)基底連接的強(qiáng)度、細(xì)胞間連接的強(qiáng)度，并作為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明提供的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評價(jià)方法具有成本低廉、操作簡便、結(jié)果易判、快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)。本發(fā)明利用上述方法，以分子生物學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)手段為基礎(chǔ)，篩選出轉(zhuǎn)移性較強(qiáng)癌細(xì)胞，并建立體外癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型，能夠高效篩選出對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移具有潛在抑制作用的藥物，為高通量藥物篩選提供簡單易行的方法，縮短新藥的開發(fā)周期。
文檔編號C12Q1/02GK103184263SQ20131013384
公開日2013年7月3日 申請日期2013年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月17日
發(fā)明者孟文翔, 滕文臣 申請人:孟文翔