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誘導(dǎo)脂肪干細胞分化為成纖維細胞的方法

文檔序號:8483881閱讀:1340來源:國知局
誘導(dǎo)脂肪干細胞分化為成纖維細胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細胞誘導(dǎo)領(lǐng)域,尤其涉及誘導(dǎo)脂肪干細胞分化為成纖維細胞的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細胞治療被認為是臨床上一種組織損傷修復(fù)的安全、有效的治療方法?,F(xiàn)有技 術(shù)中,以骨髓或臍血充間質(zhì)干細胞作為創(chuàng)面修復(fù)材料的技術(shù)已有報道。但是,骨髓充間質(zhì)干 細胞(BMSCs)存在病毒污染的隱患,且隨著供者年齡增長,其細胞數(shù)量和擴增、分化能力出 現(xiàn)明顯下降趨勢,不適合批量制備。而來源于臍血或胎盤的充間質(zhì)干細胞雖然可以克服上 述缺陷,卻僅能在出生時保存,并非所有患者都能提供。從人體脂肪組織中分離出來的脂肪 間充質(zhì)干細胞(ADSCs)可通過分泌多種生長因子,控制和調(diào)節(jié)臨近的受損細胞,發(fā)揮重要 功能,而且ADSCs容易從吸脂的脂肪中獲得,對患者創(chuàng)傷小,干細胞分離效率高,具有多能 分化的能力,因此ADSCs近年來已經(jīng)成為種子細胞的研宄熱點。
[0003] 但是,將ADSCs用于制備創(chuàng)面修復(fù)材料首先面臨的問題就是分化。2008年有報道 稱,利用脂肪干細胞于人脫細胞真皮基質(zhì)復(fù)合,移植到裸鼠皮膚缺損處,發(fā)現(xiàn)植入的細胞向 血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、上皮細胞分化,并能有效促進創(chuàng)面愈合。而皮膚作為人體面積 最大的器官,發(fā)生大面積缺損或難愈合是現(xiàn)如今困擾臨床工作著的一大難題,ADSCs無疑成 為種子細胞和支架材料的理想選擇?,F(xiàn)有技術(shù)中對ADSCs成纖維細胞分化研宄較少,僅有 的研宄結(jié)果顯示,ADSCs分化為成纖維細胞所需的時間較為漫長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此,本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種快速誘導(dǎo)脂肪干細胞分化為成 纖維細胞的方法。
[0005] 本發(fā)明提供的誘導(dǎo)脂肪干細胞分化為成纖維細胞的方法為:將脂肪干細胞于磷酸 維生素 C和bFGF存在條件下誘導(dǎo)培養(yǎng),得到成纖維細胞。
[0006] 磷酸維生素 C,又名維生素 C磷酸酯,能夠促進膠原蛋白生成。
[0007] bFGF為成纖維細胞生長因子,具有促進有絲分裂的作用,能夠促進創(chuàng)傷組織愈合 與組織修復(fù),促進組織再生。
[0008] 本發(fā)明采用磷酸維生素 C和bFGF作為誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)脂肪干細胞分化成為成纖維細 胞。實驗表明,經(jīng)過7~10天的誘導(dǎo)脂肪干細胞向成纖維細胞分化,且與其他對照組相比 分化速度更快。
[0009] 在一些實施例中,誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有5wt% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0010] 在一些實施例中,bFGF的濃度為5~15 μ g/mL;磷酸維生素 C的濃度為0.5~ I.5mmol/L〇
[0011] 在一些實施例中,bFGF的濃度為10 μ g/mL ;磷酸維生素 C的濃度為lmmol/L。
[0012] 本發(fā)明通過實驗表明,生長因子的種類、濃度對脂肪干細胞成纖維細胞分化速度 的影響十分顯著,改變生長因子的種類或濃度會導(dǎo)致分化速度的下降。
[0013] 在一些實施例中,誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中還包括地塞米松。
[0014] 在一些實施例中,地塞米松的濃度為0. 01~0. 2 μ mol/L。
[0015] 在一些實施例中,地塞米松的濃度為0. 1 μ mol/L。
[0016] 地塞米松作為抗炎劑使用。
[0017] 在一些實施例中,脂肪干細胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)前,經(jīng)胰蛋白酶消化、融合。
[0018] 具體的,脂肪干細胞的胰蛋白酶消化、融合為:取第三代~第五代的脂肪干細胞, 加入質(zhì)量分數(shù)為〇. 25%胰蛋白酶和質(zhì)量分數(shù)為0. 02% EDTA進行消化,以血清終止消化后 1200r/min離心5min,以DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞,調(diào)整密度為I X 104/mL,培養(yǎng)至40 %~ 50 %融合。
[0019] 在一些實施例中,誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中每2天更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
[0020] 在一些實施例中,誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為7d~10d,溫度為37°0,〇)2體積分數(shù)5%,飽 和濕度95%。
[0021] 在一些實施例中,第三代~第五代的脂肪干細胞的制備方法包括:將脂肪組織經(jīng) PBS緩沖液沖洗,以膠原酶消化后,經(jīng)離心取細胞沉淀后以脂肪干細胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至 80%融合,以胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)至第三代~第五代。
[0022] 在一些實施例中,誘導(dǎo)培養(yǎng)后,還包括擴增培養(yǎng)、傳代的步驟。
[0023] 在一些實施例中,擴增培養(yǎng)、傳代的培養(yǎng)基為成纖維細胞無血清培養(yǎng)基SFM。
[0024] 在一些實施例中,擴增培養(yǎng)、傳代過程中,每2天更換培養(yǎng)基。
[0025] 在一些實施例中,擴增培養(yǎng)、傳代的條件為溫度為37°C,0)2體積分數(shù)5%,飽和濕 度 95%。
[0026] 本發(fā)明提供的誘導(dǎo)脂肪干細胞分化為成纖維細胞的方法為:將脂肪干細胞于磷酸 維生素 C和bFGF存在條件下誘導(dǎo)培養(yǎng),得到成纖維細胞。經(jīng)試驗證明,采用本發(fā)明提供的 方法,培養(yǎng)7~10天后細胞仍呈梭形或漩渦形狀,雖然形狀上與脂肪干細胞十分相似,但是 對I型膠原的表達情況檢測結(jié)果表明,培養(yǎng)后的細胞中I型膠原的表達量升高了 124倍,顯 著優(yōu)于對照組。說明,采用本發(fā)明提供的方法成功將脂肪干細胞誘導(dǎo)分化稱為成纖維細胞, 且分化速度優(yōu)于對照組。繼續(xù)擴增培養(yǎng)、傳代過程中,細胞進一步的分化、擴增,從而能夠獲 得更大量的成纖維細胞。
【附圖說明】
[0027] 圖1示原代培養(yǎng)脂肪干細胞的倒置顯微鏡(100X)觀察結(jié)果,其中,圖ι-a示原代 培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果;圖Ι-b示原代培養(yǎng)5天后觀察結(jié)果;
[0028] 圖2示流式細胞儀檢測擴增培養(yǎng)至第三代的脂肪干細胞表面抗原表達情況;
[0029] 圖3示脂肪干細胞成纖維細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后以倒置顯微鏡放大40倍觀察細胞形態(tài) 結(jié)果;其中圖3-a示誘導(dǎo)培養(yǎng)前脂肪干細胞形態(tài),圖3-b示實驗組細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后形態(tài);圖 3-c示對照組1細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后形態(tài);圖3-d示對照組2細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后形態(tài);圖3-e示對 照組3細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后形態(tài);
[0030] 圖4示免疫熒光染色檢測誘導(dǎo)分化后細胞I型膠原的表達情況;其中,圖4-a示實 驗組細胞I型膠原表達情況;圖4-b示對照組1細胞I型膠原表達情況;圖4-c示對照組2 細胞I型膠原表達情況;圖4-d示對照組3細胞I型膠原表達情況。
【具體實施方式】
[0031] 本發(fā)明提供了誘導(dǎo)脂肪干細胞分化為成纖維細胞的方法,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借 鑒本文內(nèi)容,適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是,所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域 技術(shù)人員來說是顯而易見的,它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過 較佳實施例進行了描述,相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文的方 法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合,來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0032] 本發(fā)明
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