專利名稱：胰島素分泌細胞提取物及其在干細胞誘導分化中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物細胞提取物及應用技術，具體涉及人或動物胰島素分泌細胞提取物及其在干細胞誘導分化為胰島素分泌細胞中的應用技術。
背景技術：
國內(nèi)目前有糖尿病人約2500萬人，還有近3000萬人有發(fā)生糖尿病的可能，該病雖可通過注射胰島素和降糖藥物有效控制高血糖癥狀，但不能根治，目前這類疾病在臨床上沒有理想治療措施，近幾年，經(jīng)肝內(nèi)門靜脈植入胰島細胞治療糖尿病取得了一些療效，一些病人在接受胰島細胞移植后，能脫離胰島素治療，血糖控制時間可長達1年以上，遺憾的是，胰島細胞移植仍面臨兩大難題供者來源不足和嚴重的免疫排斥反應等。干細胞作為一類具有自我更新及多向分化潛能的的細胞，已經(jīng)逐漸成為人們尋找胰島細胞的新資源。
1997年以來，干細胞研究取得重要進展，研究發(fā)現(xiàn)人體間充質干細胞(MSC)可以被誘導分化為神經(jīng)、肌肉、皮膚、軟骨、脂肪、肌腱、胰島素分泌、肝臟、血液及組織類型的成熟細胞，擴增誘導后移植到體內(nèi)和相應組織細胞良好整合，發(fā)揮特定的生物學功能，可以用來移植治療多種疾病。干細胞誘導分化后的胰島素分泌樣細胞移植將成為糖尿病治療的最佳選擇，可以用來移植治療急慢性胰組織損傷如急性胰島損傷等疾病。
關于骨髓來源干細胞的可塑性即分化潛能已獲得以下證據(jù)(1)將骨髓干細胞移植到腦組織中，發(fā)現(xiàn)可轉化為神經(jīng)細胞，修復腦組織損傷；(2)骨髓干細胞在體外被誘導分化為分泌胰島素的胰島樣細胞；(3)純化的骨髓造血干細胞移植到胚胎組織中，可隨胚胎發(fā)育進入各種組織中，分化為相應組織類型的成熟細胞；(4)胰島素分泌干細胞來源于造血干細胞；上述研究結果提示骨髓來源的干細胞具有轉化為胰島素分泌細胞的潛能。
已有定向誘導成體干細胞分化為胰島素分泌細胞的報道，方法和使用的制劑主要有(1)體內(nèi)誘導，將干細胞直接移植到胰島素分泌組織中，觀察發(fā)現(xiàn)可以在胰島素分泌組織的特定環(huán)境中被誘導分化為胰島素分泌細胞；(2)直接通過靜脈注射方法輸入干細胞，部分干細胞可進入胰島組織，分化為胰島素分泌細胞；(3)體外條件下將干細胞與胰島素分泌細胞相關因子共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)干細胞被誘導分化為胰島素分泌樣細胞，如2003年6月自然科學進展雜志第13卷第6期報道“成人骨髓間充質干細胞體外定向誘導分化為胰島樣細胞團的研究”所采用的誘導劑為含10ng/mLβ細胞調節(jié)素(Betacellulin)等。
目前的研究尚未形成穩(wěn)定可靠的技術方法，有關報道所采用的技術主法主要采用體內(nèi)誘導，現(xiàn)有技術研究方法及誘導試劑各不相同，應用效果不穩(wěn)定，且未形成標準。
相關名詞注釋(1)干細胞是各種成熟細胞的起源細胞，根據(jù)來源及分化潛能的不同，分為胚胎干細胞(embryonic stemcells，ES)和成體干細胞(dult stem cells，ASCs)兩類。有潛在的擴增及誘導分化性能。本發(fā)明的應用涉及干細胞中的間充質干細胞和造血干細胞兩類。
(2)造血干細胞來源于骨髓、外周血和臍帶血，具有自我更新和分化潛能，特異標志是表達CD34抗原或CD133抗原。
(3)間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs簡寫為MSC)是目前研究較多的ASCs，廣泛存在于成人多種組織中，而且具有多向分化潛能，可以在體內(nèi)外被誘導分化為多種類型、不同功能的成熟細胞。在體外能達到50次以上倍增而保持其多向分化的潛能性。
(4)DMEM與F12培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)通用基礎培養(yǎng)基。
(5)卵細胞提取物從人或動物卵細胞中提取，分子量大小正常不等的復雜混合物，含有多種促進、調控及誘導細胞生長分化因子?？勺鳛闋I養(yǎng)液使用。該項技術的技術方案記載在專利申請?zhí)枮?00410033182.9的專利申請中。
(6)胰島素分泌細胞特指具有分泌胰島素功能的胰β細胞，是胰腺組織結構與功能重要組成細胞。
(7)干細胞誘導分化用天然化合物或細胞因子等與干細胞在特定溫度、濕度和二氧化碳條件下共同培養(yǎng)一定時間后，干細胞分化為成熟細胞。不同誘導因子和條件誘導后所得成熟細胞類型不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種取材于人或動物體內(nèi)胰島素分泌細胞組織，經(jīng)人工提取的、使分子量小于20萬道爾頓(Da)的胰島素分泌細胞提取物；本發(fā)明還提供該胰島素分泌細胞提取物在體外MSC及造血干細胞誘導分化為胰島素分泌細胞中作為誘導劑的應用技術，本發(fā)明的胰島素分泌細胞提取物在MSC及造血干細胞誘導分化為胰島素分泌細胞的應用中，顯示出良好的誘導分化率，且效果好，重復性及穩(wěn)定性好。
本發(fā)明的應用，在技術方案中，以MSC為代表進行闡述。
發(fā)明技術方案如下人或動物胰島素分泌細胞提取物，主要包括以下方法提取取人或動物胰腺組織，去除紅細胞、被膜及結締組織等非需要成份→細胞勻漿→細胞破碎→沉淀或過濾，取上清液→分離去除大于20萬道爾頓(Da)以上分子量的物質→蛋白濃度測定，活性測定，除菌，凍存或制備成試劑分裝。
具體方法為(1)取人或動物胰腺組織，去除內(nèi)存紅細胞及被膜、結締組織，剪碎備用；(2)在4℃以下，勻漿3-5次；(3)將勻漿液行細胞破碎至細胞完全破碎；(4)在1-4℃條件下，去處沉渣和蛋白絮狀物，吸取上清液；(5)獲得的上清液，截留分離去除分子量大于20萬道爾頓(Da)以上的大分子物質，使獲得的過濾液中的蛋白和多肽類物質的分子量小于20萬道爾頓(Da)；(6)獲得的過濾液蛋白含量測定，活性測定，除菌，凍存或無菌分裝，此為本發(fā)明的胰島素分泌細胞提取物。
步驟(1)的胰腺組織剪碎后進行勻漿，也可以加入1-4倍生理鹽水稀釋后再勻漿；步驟(3)細胞破碎可以用化學或物理的方法，優(yōu)選凍融，是置于冰箱凍存至完全凍結，然后在不高于42℃的條件下徹底融化，最好是隔水加溫，如上條件反復凍融3-5次，按常規(guī)涂片顯微鏡觀察，證明細胞完全破碎；步驟(5)的截留分離方法可以是高速離心、電泳、過濾膜過濾等方法，優(yōu)選過濾膜在正壓或負壓條件下過濾截留，其目的是將大分子物質分離出來，保留分子量小于20萬道爾頓(Da)的成份。過濾膜的選用要求能截留下分子量大于20萬道爾頓(Da)的大分子物質。本發(fā)明的胰島素分泌細胞提取物濾液用常規(guī)方法制成試劑，可粉劑或水劑。制成水劑時，蛋白質濃度大于4毫克/毫升為好，若水劑中蛋白濃度過低，在應用時為了滿足蛋白濃度，相應的水容積增大，導致一定體積的培養(yǎng)液內(nèi)的其它成份用量減少，不能滿足培養(yǎng)液配比要求。不論是粉劑或水劑，應用時，根據(jù)活性單位要求取量即可。試劑應按生物制劑保存辦法低溫保存。
所述的人或動物胰腺組織是直接從人或動物體取得的，動物又以哺乳動物為好。
本發(fā)明的胰島素分泌細胞提取物的生產(chǎn)過程，最好在上述低溫條件下進行，以減少活性損失，防止污染。細胞破碎應完全，可采用化學或機械方法，超聲波等技術，凍融過程需反復進行至細胞完全破碎。蛋白質含量可因鹽水加入的多少而變化，提取液中蛋白質濃度最好為1毫克/毫升以上，保證其它有效成份得以充分提取，制備成試劑時，可再濃縮或稀釋到要求濃度，活性界定是在應用中以100毫升培養(yǎng)液含胰島素分泌細胞提取物以蛋白質濃度表示，含蛋白質1毫克以上即表現(xiàn)有活性，為有效活性范圍。凍存以結凍為溫度要求，能較好地保存提取物的活性，積量后制備試劑，可以是-20℃以下，能長期保存。除菌方法以過濾法為好。
本發(fā)明所述的胰島素分泌細胞提取物在MSC誘導分化中的應用，是將本發(fā)明的胰島素分泌細胞提取物、基礎培養(yǎng)基等與MSC共同培養(yǎng)，誘導其分化為胰島素分泌樣細胞，其應用可以是本發(fā)明的胰島素分泌細胞提取物作為誘導劑結合現(xiàn)有技術的應用，也可以是本發(fā)明的胰島素分泌細胞提取物與其它試劑如基礎培養(yǎng)基、營養(yǎng)液、促細胞生長因子、抗氧化劑及抗生素等共同制備成干細胞誘導分化試劑盒的應用。所述試劑盒的應用可以是主要由基礎培養(yǎng)基和卵細胞提取物和胰島素分泌細胞提取物制備的試劑盒中的應用，可以是主要由基礎培養(yǎng)基和胰島素分泌細胞提取物制備的試劑盒中的應用。所述基礎培養(yǎng)基以選自DMEM與F12的混合培養(yǎng)基為好。
應用有效量即活性條件以培養(yǎng)液總體積中含胰島素分泌細胞提取物以蛋白質濃度表示，顯示為蛋白質1％(毫克/毫升)以上即表現(xiàn)有活性，為有效活性范圍，在1％-100％為更有效活性范圍。在此活性范圍內(nèi)，誘導分化率達到60％以上。
經(jīng)多次反復的實驗，分別以人MSC或造血干細胞為例，擴增培養(yǎng)15天，傳代四次，將擴增后的干細胞誘導分化為胰島素分泌細胞，再培養(yǎng)15天，傳代四次，誘導分化為胰島素分泌細胞的誘導分化率達到本發(fā)明的應用效果，且重復性和穩(wěn)定性好。誘導細胞鑒定結果經(jīng)顯微鏡觀察具有胰島細胞形態(tài)，用標記單克隆抗體進行流式細胞分析和免疫細胞化學鑒定證明表達胰島素分泌細胞的特異抗原標志，正常分泌胰島素，體內(nèi)移植后可以發(fā)揮胰島素分泌細胞的特定生物學功能和治療胰島細胞損傷性疾病。
本發(fā)明的胰島素分泌細胞提取物在MSC和造血干細胞誘導分化為胰島素分泌細胞的應用中，顯示出良好的誘導分化率，在60％以上，適宜的應用，誘導分化率可達到95％以上。本發(fā)明的應用覆蓋這兩類細胞誘導分化中的應用。
所述人或動物胰島素分泌細胞提取物所含成份及其含量目前尚未完全清楚，已有報導證實，胰島素分泌細胞胞漿中含有潛在調節(jié)細胞生長與分化的因子，還含有豐富的蛋白質及相關因子，與其它培養(yǎng)基及相關因素共同為MSC及造血干細胞誘導分化提供了理想的綜合營養(yǎng)環(huán)境，表現(xiàn)為維持干細胞生長的同時，誘導其向胰島素分泌細胞分化。
現(xiàn)結合實施例對本發(fā)明作進一步闡述實施例1，胰島素分泌細胞提取物的制備(1)取人或動物胰腺組織，立即通過動脈和靜脈灌生理鹽水，最大限度地去除血管內(nèi)存留的紅細胞，剃出被膜、結締組織、血管等非需要成份，剪碎，加入等量生理鹽水備用；(2)組織勻漿或搗碎機在4℃條件下，1-3萬轉/分鐘勻漿3-5次，每次1分鐘；應注意勻漿機不宜過熱，否則部分組織液失去活性；
(3)將勻漿液置于-20℃冰箱凍存至完全凍結，一般24小時以上，然后在不高于42℃的條件下隔水徹底融化，如上條件反復凍融3-5次，按常規(guī)涂片顯微鏡觀察，證明細胞完全破碎；(4)在1-4℃的條件下自然沉降2-10小時，吸取上清液，用3-4層無菌紗布過濾，去處沉渣和蛋白絮狀物，在4℃條件下，400-600g離心30分鐘，取上清液；(5)用過濾膜在正壓或負壓條件下過濾獲得的上清液，截留分子量大于20萬道爾頓(Da)以上的大分子物質，使過濾液中的蛋白和多肽類物質的分子量小于20萬道爾頓(Da)；(6)測定蛋白濃度為20毫克/毫升，應用活性測定符合，過濾法除菌，用無菌生理鹽水稀釋成蛋白濃度為10毫克/毫升，無菌分裝，為水劑試劑。
實施例2，MSC誘導分化為胰島素分泌細胞的應用試劑盒的應用，卵細胞提取物水劑，含蛋白10毫克/毫升，上述胰島素分泌細胞提取物水劑，含蛋白10毫克/毫升，制備每100毫升試劑盒，各組份獨立包裝用量(1)DMEM與F12混合培養(yǎng)基 80毫升(2)動物卵細胞提取物水劑 10毫升(3)胰島素分泌細胞提取物水劑 10毫升試劑盒中可以有常規(guī)用有效量的促細胞生長因子、抗氧化劑及抗生素等。
誘導培養(yǎng)方法1、間充質干細胞分離、純化按常規(guī)方法從骨髓、脂肪等組織中分離獲得單個核細胞，先進行細胞原代貼壁培養(yǎng)后用間充質干細胞的表面特異標志抗原進行正、負免疫篩選，獲得純間充質干細胞。若細胞數(shù)量足夠，也可直接用分離獲得的單個核細胞進行分離純化。依據(jù)實驗目的和細胞數(shù)量，先進行細胞擴增培養(yǎng)到所需數(shù)量或直接用本試劑進行誘導。
2、間充質干細胞貼壁培養(yǎng)將間充質干細胞用基礎培養(yǎng)基稀釋為1×105細胞/ml，按1×104細胞/cm2密度接種到培養(yǎng)瓶(皿)中，按間充質干細胞體外擴增方法進行體外培養(yǎng)至細胞長滿瓶壁，2/3以上細胞融合后進行誘導培養(yǎng)。間充質干細胞判定標準形態(tài)梭形，呈火焰狀有規(guī)則排列生長。表面分子標志CD34-、CD45-、CD103+、CD106+、SH2+、SH4+。
3、誘導培養(yǎng)移出貼壁培養(yǎng)細胞后的培養(yǎng)液，用生理鹽水洗1-2次，將上述量的細胞進行誘導，需試劑盒培養(yǎng)液總體積為10ML，設定培養(yǎng)液中兩種細胞提取物活性蛋白質含量分別為50％，則取DMEM/F12培養(yǎng)基9.0毫升，卵細胞提取物0.5毫升，胰島素分泌細胞提取物0.5毫升，此10ML培養(yǎng)液中含兩種細胞提取物蛋白質各5mg，活性蛋白質濃度分別為50％，根據(jù)需要可加入常規(guī)用有效量的促細胞生長因子、抗氧化劑及抗生素等。將試劑盒培養(yǎng)液與細胞的混合物置于37℃、5％CO2、95％濕度條件下培養(yǎng)，連續(xù)觀察細胞生長狀況。
4、誘導細胞鑒定(1)形態(tài)呈團塊狀，球形細胞；(2)NESTIN呈陽性，正常分泌胰島素；(3)移植試驗通過對大鼠骨髓間充質干細胞體外誘導分化為胰島素分泌細胞，再將分化的細胞移植入糖尿病大鼠體內(nèi)，經(jīng)觀察，有效解除了大鼠對胰島素的依賴，部份消除了糖尿病癥狀。
(4)誘導率90％以上。
實施例3，造血干細胞誘導分化為胰島素分泌細胞的應用試劑盒的應用，胰島素分泌細胞提取物水劑，含蛋白5毫克/毫升，制備每100毫升試劑盒，各組份獨立包裝用量(1)DMEM與F12混合培養(yǎng)基(重量比1∶1) 80毫升(3)胰島素分泌細胞提取物水劑 10毫升試劑盒中可以有常規(guī)用有效量的促細胞生長因子、抗氧化劑及抗生素等。
誘導培養(yǎng)方法1、造血干細胞分離、純化常規(guī)技術；2、造血干細胞培養(yǎng)采用懸浮培養(yǎng)，為現(xiàn)有技術手段；3、誘導培養(yǎng)培養(yǎng)方法同上，設定培養(yǎng)液中胰島素分泌細胞提取物活性蛋白質含量為30％，則取DMEM/F12培養(yǎng)基9.4毫升，胰島素分泌細胞提取物0.6毫升，此10ML培養(yǎng)液中含胰島素分泌細胞提取物蛋白質3mg，活性蛋白質濃度為30％，加入常規(guī)用有效量的促細胞生長因子、抗氧化劑及抗生素等。將試劑盒培養(yǎng)液與細胞的混合物置于37℃、5％CO2、95％濕度條件下培養(yǎng)，連續(xù)觀察細胞生長狀況。
4、誘導細胞鑒定內(nèi)容同實施例2。
實施例4結合現(xiàn)有技術的應用可以是現(xiàn)有體外間充質干細胞誘導分化為皮膚細胞的方法中，本發(fā)明胎盤羊膜細胞提取物作為誘導試劑的應用。關于結合現(xiàn)有技術的應用，從理論上認為是可行的。
經(jīng)多個實施例，培養(yǎng)液中分別含胰島素分泌細胞提取物不同蛋白濃度如5％、10％、20％、35％、50％、75％、100％及150％(毫克/毫升)作誘導培養(yǎng)，均獲得較滿意的效果，顯示出良好的重復性和穩(wěn)定性。本發(fā)明的技術方案不受實施例的限制。
權利要求
1.胰島素分泌細胞提取物，主要包括以下方法制取(1)取人或動物胰腺組織，去除紅細胞、被膜及結締組織，剪碎備用；(2)細胞勻漿；(3)將勻漿液行細胞破碎至細胞完全破碎；(4)沉淀或過濾，取上清液；(5)分離去除分子量大于20萬道爾頓(Da)以上的物質；(6)蛋白濃度測定，活性測定，除菌，凍存或制備試劑無菌分裝，此為本發(fā)明的胰島素分泌細胞提取物。
2.根據(jù)權利要求1所述的胰島素分泌細胞提取物，其特征在于，主要包括以下方法制取(1)取人或動物胰腺組織，去除內(nèi)存紅細胞及被膜及結締組織，剪碎備用；(2)在4℃以下，勻漿3-5次；(3)細胞破碎方法是凍融，將勻漿液置于冰箱凍存至完全凍結，然后在不高于42℃條件下徹底融化，如上條件反復凍融3-5次，按常規(guī)涂片顯微鏡觀察，細胞完全破碎；(4)在1-4℃條件下，去除沉渣和蛋白絮狀物，吸取上清液；(5)獲得的上清液，分離去除分子量大于20萬道爾頓(Da)以上的大分子物質，使獲得的過濾液中的蛋白和多肽類物質的分子量小于20萬道爾頓(Da)；(6)獲得的過濾液蛋白含量測定，蛋白質濃度為1毫克以上/每毫升濾液，活性測定，除菌，凍存或制備試劑無菌分裝。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的胰島素分泌細胞提取物，其特征在于，步驟(1)的胰腺組織中加入1-4倍生理鹽水稀釋再勻漿。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的胰島素分泌細胞提取物，其特征在于，步驟(5)的分離方法是用過濾膜在正壓或負壓條件下過濾。
5.根據(jù)權利要求3所述的胰島素分泌細胞提取物，其特征在于，步驟(5)的分離方法是用過濾膜在正壓或負壓條件下過濾。
6.根據(jù)權利要求1、2或5所述的胰島素分泌細胞提取物，其特征在于，所述動物是哺乳動物。
7.權利要求1的胰島素分泌細胞提取物在間充質干細胞或造血干細胞誘導分化中的應用，是體外誘導間充質干細胞或造血干細胞分化為胰島素分泌細胞的應用。
8.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于，所述應用是在制備試劑盒中的應用。
9.根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于，所述試劑盒的應用是基礎培養(yǎng)基選自DMEM與F12的混合培養(yǎng)基的試劑盒的應用。
10.根據(jù)權利要求8或9所述的應用，其特征在于，所述試劑盒的應用是主要由基礎培養(yǎng)基和卵細胞提取物和胰島素分泌細胞提取物制備的試劑盒中的應用，或主要是由基礎培養(yǎng)基和胰島素分泌細胞提取物制備的試劑盒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及人或動物胰島素分泌細胞提取物及其在體外干細胞誘導分化為胰島素分泌細胞中的應用，為干細胞誘導技術提供了新的誘導試劑，是胰腺組織→去除血細胞結締組織及被膜等→細胞勻漿→細胞破碎→沉淀→取上清液→分離去除分子量大于20萬道爾頓(Da)以上的物質→分裝而得，本發(fā)明所述的應用可以是胰島素分泌細胞提取物與現(xiàn)有技術有機結合的應用，也可以是制備為試劑盒的應用。在干細胞誘導分化為胰島素分泌細胞的應用中顯示出良好的誘導分化率，為90％以上。誘導分化的胰島素分泌細胞可以用來移植治療糖尿病及胰組織損傷性疾病，在臨床有很好的應用前景。
文檔編號A61P1/00GK1593462SQ20041004025
公開日2005年3月16日 申請日期2004年7月16日 優(yōu)先權日2004年7月16日
發(fā)明者潘興華, 龐榮清, 李俊, 陸家海 申請人:成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院, 潘興華