專利名稱：將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
由于人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞(human Amnion mesenchymal cells, hAMCs)具有增殖活 性和多分化潛能等干細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)，本發(fā)明涉及了一種將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成 胰島分泌細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
由于羊膜是來源于胎兒的產(chǎn)物，暴露于母體免疫系統(tǒng)監(jiān)視下，其表面人類白細(xì)胞 抗原(HLA)-A、B、C低表達(dá)，不表達(dá)HLA-DR，提示羊膜移植不引發(fā)免疫排斥。間充質(zhì)干細(xì)胞 是低免疫原性細(xì)胞，不引發(fā)異常淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，并且能通過抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì) 胞功能，影響樹突狀細(xì)胞活性，此外還可以產(chǎn)生各種生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白 酶來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和改變組織微環(huán)境，刺激內(nèi)源性干細(xì)胞減輕免疫炎癥反應(yīng)。人羊膜間充 質(zhì)細(xì)胞低表達(dá)MHC-I，不表達(dá)MHC-II，可以避免免疫排斥反應(yīng)，SUSANNE等對同一條件下人 羊膜間充質(zhì)細(xì)胞、人羊膜上皮細(xì)胞與脂肪組織來源的干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行比較，發(fā) 現(xiàn)羊膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞和上皮干細(xì)胞免疫抑制作用的發(fā)揮依賴于細(xì)胞接觸和細(xì)胞劑 量。干細(xì)胞是一群具有極強(qiáng)自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞，易分離，體外可大 量擴(kuò)增，異體移植不引起免疫排斥反應(yīng)。誘導(dǎo)分化的胰島細(xì)胞可以發(fā)揮對血糖的生理性調(diào) 節(jié)作用，被認(rèn)為是獲取胰島細(xì)胞的最佳種子細(xì)胞。Lumelsky等[1]成功地將小鼠胚胎干細(xì) 胞(embryonic stem cells, ESCs)誘導(dǎo)分化為能分泌胰島素的細(xì)胞團(tuán)。Assady等[2]證 實(shí)人ESCs可誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞。干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為β細(xì)胞的基本原理是借助生物 因子啟動干細(xì)胞中PDX-I基因的表達(dá)，改變細(xì)胞原有形態(tài)，表達(dá)胰島特異性標(biāo)記，胰島素、 胰高血糖素和胰多肽等。生物誘導(dǎo)因子包括堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、肝細(xì)胞生 長因子(HGF)、尼克酰胺及適當(dāng)濃度的葡萄糖。

發(fā)明內(nèi)容
本申請的發(fā)明目的在于提供一種將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞 的方法。為了完成本發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案本發(fā)明將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，它包括(1)在無 菌條件下，從一個胎盤中分離出人羊膜組織，放入生理鹽水中浸泡；(2)清洗上述人羊膜組織；(3)消化清洗后的人羊膜組織；(4)將上述人羊膜組織分離成單個人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞；(5)將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)增到所需的數(shù)目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜間 充質(zhì)細(xì)胞的懸濁液，使人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞的個數(shù)為IX IO6個/ml-2 X IOw個/ml ；其中
(6)將上述人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞懸液中用含有20% FBS的α -MEM的培養(yǎng)基調(diào)整到 人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞的個數(shù)為1 X IO5個/ml，然后將其接種到24孔板中，待8_12小時細(xì)胞貼 壁后，加入20mmol/L尼克酰胺后，先用低糖的DMEM預(yù)先誘導(dǎo)24小時后，誘導(dǎo)為中間絲蛋白 陽性細(xì)胞，再用無血清的高糖DMEM誘導(dǎo)10小時后，得到胰島分泌細(xì)胞；(7)取出一部分從步驟(6)中得到的細(xì)胞，用RT-PCR方法或免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢 測上述細(xì)胞是否為胰島分泌細(xì)胞；本發(fā)明將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，其中所述的步驟 ⑵為倒掉步驟(1)的生理鹽水，用溫度為4°C的含有100IU/ml青霉素和1000ug/ml鏈霉 素混合液的生理鹽水對上述人羊膜組織進(jìn)行清洗，直至人羊膜組織無任何雜質(zhì)和血漬后， 在溫度為20 25°C的無菌間，用含100IU/ml青霉素和1000ug/ml鏈霉素的D-hank，s沖 洗上述人羊膜組織3-5遍后，放置在含100IU/ml青霉素和1000ug/ml鏈霉素D-hank’ s液 中浸泡2小時；2小時后用D-hank' s液清洗3-5遍；本發(fā)明將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，其中所述的步驟
(3)是將清洗后的人羊膜組織加入等體積的0.25%胰蛋白酶的消化液，放入37°C水浴鍋中 分兩次共消化45分鐘后，倒掉上述消化液，加入3ml的含10% FBS和的DMEM/F12液終止消 化，將消化后的羊膜組織用D-hank’ s液清洗直至清洗液澄清為止；本發(fā)明將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，其中所述分兩次 共消化45分鐘是將清洗后的人羊膜組織加入等體積的0. 25%胰蛋白酶消化液，放入37°C 水浴鍋中消化15分鐘后，倒掉上述消化液，然后再加入等體積的新0.25%胰蛋白酶消化 液，放入37°C水浴鍋中消化30分鐘后，倒掉上述消化液，在消化時每隔5分鐘晃動一次，使 人羊膜組織被充分地消化；本發(fā)明將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，其中所述的步驟
(4)中的將上述人羊膜組織分離成單個人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞是采取以下步驟(I)將消化后的人羊膜組織用剪刀剪成漿狀后放入燒杯中，加入等體積的0. 2% 膠原蛋白酶V，然后放入溫度為37°C的水浴鍋中消化20 30分鐘；(II)將消化后的羊膜漿狀液分別用60目細(xì)胞篩和200目細(xì)胞篩進(jìn)行過濾，得到細(xì) 胞懸濁液；(III)用無血清DMEM/F12按1 1的比例稀釋上述過濾后細(xì)胞懸濁液，然后在室 溫下將其放入離心機(jī)內(nèi)以2500r/min轉(zhuǎn)速離心10分鐘，10分鐘后將上述溶液中的上清液倒 掉，然后再加入DMEM/F12，用吸管將細(xì)胞吹打均勻后，再將其放入離心機(jī)內(nèi)以1500r/min轉(zhuǎn) 速離心5分鐘，5分鐘后將上述溶液中的上清液倒掉，再加入含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng) 液后，用吸管將細(xì)胞吹打均勻后，使人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞個數(shù)為IX IO6個/ml-2 X IO6個/ml ；本發(fā)明將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，其中所述的步驟
(5)是將步驟(4)得到人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞和含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液放置在培養(yǎng)瓶 中，培養(yǎng)瓶在溫度為36. 5-37. 5 °C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為4. 5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2_3 天更換全部培養(yǎng)液，培養(yǎng)5-7天，觀察培養(yǎng)瓶中人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞融合達(dá)到85%以上時， 去掉培養(yǎng)液，用D-hank’ s液清洗兩遍后，再加2ml 0. 25%的胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化，在 消化過程中，用顯微鏡下觀察細(xì)胞的消化情況，當(dāng)70%的細(xì)胞變化成圓形時，立即加入2ml DMEM/F12和10% FBS培養(yǎng)液終止消化，然后用力吹打培養(yǎng)瓶的壁，將貼壁的細(xì)胞吹打下來；將回收的間充質(zhì)細(xì)胞放入離心機(jī)內(nèi)以1500r/min轉(zhuǎn)速每次離心5分鐘，共計兩次，然后倒掉 上清液，并計算細(xì)胞的個數(shù)；將上述回收的間充質(zhì)細(xì)胞1 X IO6個/ml-2X IO6個/ml的密度 重復(fù)上述操作進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)，直至達(dá)到所需細(xì)胞數(shù)量；本發(fā)明將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，其中所述的步驟 (7)的用RT-PCR方法是檢測上述細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，若上述細(xì)胞包括胰島素、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn) 2(GLUT2)、葡萄糖激酶、中間絲蛋白陽性細(xì)胞和胰腺和十二指腸同源盒(PDX-I)細(xì)胞，說明 從步驟(6)得到的細(xì)胞為胰島分泌細(xì)胞，否則，說明從步驟(6)得到的細(xì)胞不是胰島分泌細(xì) 胞；本發(fā)明將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，其中所述的步驟 (7)的用免疫細(xì)胞化學(xué)方法是檢測上述細(xì)胞是否包括胰島素和C肽的表達(dá)，若上述細(xì)胞包 括胰島素和C肽的表達(dá)，說明從步驟(6)得到的細(xì)胞為胰島分泌細(xì)胞，否則，說明從步驟 (6)得到的細(xì)胞不是胰島分泌細(xì)胞。在成年機(jī)體中，間充質(zhì)細(xì)胞存在于多種組織中，如骨髓、脂肪組織，但提取相當(dāng)困 難。目前間充質(zhì)細(xì)胞的主要來源為成人骨髓，但成人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(bone marrow-MCs, BM-MCs)細(xì)胞數(shù)量極少，Pittenger等發(fā)現(xiàn)僅0. 001% 0. 01 %的經(jīng)過密度梯度分離的單核 細(xì)胞產(chǎn)生可塑性的貼壁細(xì)胞克隆，并且增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，病毒感染率較 高，供者間充質(zhì)細(xì)胞的采集須行骨髓穿刺術(shù)，使來源受到限制。而人類羊膜作為胚胎發(fā)育的 早期產(chǎn)物，無論從解剖結(jié)構(gòu)還是在發(fā)育行為上，都包含有較為幼稚的胚胎干細(xì)胞及趨于成 熟的成體干細(xì)胞成分；羊膜組織在胎兒娩出后即完成使命，對其研究不會涉及倫理道德問 題；由于羊膜MCs是來源于胎兒的產(chǎn)物，暴露于母體免疫系統(tǒng)監(jiān)視下，間充質(zhì)細(xì)胞表面人類 白細(xì)胞抗原I(human leucocyte antigen，HLA)-A、B、C不表達(dá)，人類白細(xì)胞抗原HLA-DR低 表達(dá)，從羊膜分離出間充質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，經(jīng)體外擴(kuò)增后成功植入新生大鼠和豬體內(nèi)。上述優(yōu) 勢使人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞有望成為人類組織工程和細(xì)胞治療的理想種子細(xì)胞。利用上述方法得到的胰島分泌細(xì)胞可以用于修復(fù)人體內(nèi)的胰島組織。


圖1為用本發(fā)明方法所得到的胰島分泌細(xì)胞，即用體外人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)胰 島素的免疫化學(xué)形態(tài)圖；圖2為用本發(fā)明方法所得到的胰島分泌細(xì)胞，即用體外人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)胰 高血糖的免疫化學(xué)形態(tài)圖；圖3為體外培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞合成酶聯(lián)免疫分析圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明一種將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，它包括(1)在無菌條件下，從一個從正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的胎盤的臍帶面，鈍性分離出的 人羊膜組織，放入生理鹽水中浸泡；(2)倒掉步驟(1)的生理鹽水，用溫度為4°C的含有100IU/ml青霉素和1000ug/ml 鏈霉素混合液的生理鹽水對上述人羊膜組織進(jìn)行清洗，直至人羊膜組織無任何雜質(zhì)和血漬 后，在溫度為20 25°C的無菌間，用含100IU/ml青霉素和1000ug/ml鏈霉素的D-hank，s沖洗上述人羊膜組織3-5遍后，放置在含100IU/ml青霉素和1000ug/ml鏈霉素D-hank’ s 液中浸泡2小時；2小時后用D-hank’ s液清洗3_5遍；(3)將清洗后的人羊膜組織加入等體積的0. 25%胰蛋白酶消化液，放入37°C水浴 鍋中消化15分鐘后，倒掉上述消化液，然后再加入等體積的新0. 25%胰蛋白酶消化液，放 入37°C水浴鍋中消化30分鐘后，倒掉上述消化液，在消化時每隔5分鐘晃動一次，使人羊膜 組織被充分地消化，加入3ml的含10% FBS的DMEM/F12終止消化，將消化后的羊膜組織用 D-hank' s液清洗直至清洗液澄清為止；(4)將上述人羊膜組織分離成單個人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞；其中采用以下步驟(I)將消化后的人羊膜組織用剪刀剪成漿狀后放入燒杯中，加入等體積的0. 2% 膠原蛋白酶V，然后放入溫度為37°C的水浴鍋中消化20 30分鐘；(II)將消化后的羊膜漿狀液分別用60目細(xì)胞篩和200目細(xì)胞篩進(jìn)行過濾，得到細(xì) 胞懸濁液；(III)用無血清DMEM/F12按1 1的比例稀釋上述過濾后細(xì)胞懸濁液，然后在室 溫下將其放入離心機(jī)內(nèi)以2500r/min轉(zhuǎn)速離心10分鐘，10分鐘后將上述溶液中的上清液倒 掉，然后再加入DMEM/F12，用吸管將細(xì)胞吹打均勻后，再將其放入離心機(jī)內(nèi)以1500r/min轉(zhuǎn) 速離心5分鐘，5分鐘后將上述溶液中的上清液倒掉，再加入10% FBS和DMEM/F12培養(yǎng)液 后，用吸管將細(xì)胞吹打均勻后，使人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞個數(shù)為IX IO6個/ml-2 X IO6個/ml ；(5)將得到人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞和含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液放置培養(yǎng)瓶中，培 養(yǎng)瓶在溫度為36. 5-37. 5°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為4. 5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2_3天更 換全部培養(yǎng)液，培養(yǎng)5-7天，觀察培養(yǎng)瓶中人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞融合達(dá)到85%以上時，去掉培 養(yǎng)液，用D-hank’ s液清洗兩遍后，再加2ml 0. 25%的胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化，在消化過 程中，用顯微鏡下觀察細(xì)胞的消化情況，當(dāng)70%的細(xì)胞變化成圓形時，立即加入2ml含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，然后用力吹打培養(yǎng)瓶的壁，將貼壁的細(xì)胞吹打下來；將回 收的間充質(zhì)細(xì)胞放入離心機(jī)內(nèi)以1500r/min轉(zhuǎn)速每次離心5分鐘，共計兩次，然后倒掉上清 液，并計算細(xì)胞的個數(shù)；將上述回收的間充質(zhì)細(xì)胞1 X IO6個/ml-2X IO6個/ml的密度重復(fù) 上述操作進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)，直至達(dá)到所需細(xì)胞數(shù)量；(6)將上述人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞懸液中用含有20% FBS的α -MEM的培養(yǎng)基調(diào)整到 人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞的個數(shù)為1 X IO5個/ml，然后將其接種到24孔板中，待8_12小時細(xì)胞貼 壁后，加入20mmol/L尼克酰胺后，先用低糖的DMEM預(yù)先誘導(dǎo)24小時后，誘導(dǎo)為中間絲蛋白 陽性細(xì)胞，再用無血清的高糖DMEM誘導(dǎo)10小時后，得到胰島分泌細(xì)胞；(7)取出一部分從步驟(6)中得到的細(xì)胞用RT-PCR方法或免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測 上述細(xì)胞，檢測得到的細(xì)胞是否為胰島分泌細(xì)胞。其中所述的用RT-PCR方法是檢測上述細(xì) 胞相關(guān)基因表達(dá)，若上述細(xì)胞包括胰島素、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)2(GLUT2)、葡萄糖激酶、中間絲蛋 白陽性細(xì)胞和胰腺盒十二指腸同源盒(PDX-I)細(xì)胞，說明從步驟(6)得到的細(xì)胞為胰島分 泌細(xì)胞，否則，說明從步驟(6)得到的細(xì)胞不是胰島分泌細(xì)胞；所述的用免疫細(xì)胞化學(xué)方法 是檢測上述細(xì)胞是否包括胰島素和C肽的表達(dá)，若上述細(xì)胞包括胰島素和C肽的表達(dá)， 說明從步驟(6)得到的細(xì)胞為胰島分泌細(xì)胞，否則，說明從步驟(6)得到的細(xì)胞不是胰島分 泌細(xì)胞。可以分別進(jìn)行用RT-PCR方法或免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測，也可以即進(jìn)行既用RT-PCR方法鑒定又免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行檢測。圖1為用本發(fā)明方法所得到的胰島分泌細(xì)胞在細(xì)胞免疫熒光化學(xué)的結(jié)果，從圖3 中可以看出第一組對照組(control)為正常血清中胰島素的含量；第二組為人羊膜間充 質(zhì)的胞漿(cytoplasm)中胰島素的含量；第三組為人羊膜間充質(zhì)的上清液(supernatant) 中胰島素的含量，即用本發(fā)明的方法得到的胰島分泌細(xì)胞中胰島素的含量。以上方法只是對本發(fā)明的解釋，不是對發(fā)明的限定，本發(fā)明所限定的范圍參見權(quán) 利要求，在不違背本發(fā)明的精神的情況下，本發(fā)明可以作任何形式的修改。
權(quán)利要求
一種將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，它包括(1)在無菌條件下，從一個胎盤中分離出人羊膜組織，放入生理鹽水中浸泡；(2)清洗上述人羊膜組織；(3)消化清洗后的人羊膜組織；(4)將上述人羊膜組織分離成單個人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞；(5)將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)增到所需的數(shù)目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞的懸濁液，使人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞的個數(shù)為1×106個/ml 2×106個/ml；其特征在于(6)將上述人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞懸液中用含有20％FBS的α MEM的培養(yǎng)基調(diào)整到人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞的個數(shù)為1×105個/ml，然后將其接種到24孔板中，待8 12小時細(xì)胞貼壁后，加入20mmol/L尼克酰胺后，先用低糖的DMEM預(yù)先誘導(dǎo)24小時后，誘導(dǎo)為中間絲蛋白陽性細(xì)胞，再用無血清的高糖DMEM誘導(dǎo)10小時后，得到胰島分泌細(xì)胞；(7)取出一部分從步驟(6)中得到的細(xì)胞，用RT PCR方法或免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測上述細(xì)胞是否為胰島分泌細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，其特征 在于所述的步驟(1)是從正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的胎盤的臍帶面，鈍性分離出的人羊膜組織。
3.如權(quán)利要求2所述的將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，其特征 在于所述的步驟(2)為倒掉步驟(1)的生理鹽水，用溫度為4°C的含有100IU/ml青霉素和 100ug/ml鏈霉素混合液的生理鹽水對上述人羊膜組織進(jìn)行清洗，直至人羊膜組織無任何雜 質(zhì)和血漬后，在溫度為20 25°C的無菌間，用含100IU/ml青霉素和1000ug/ml鏈霉素的 D-hank' s沖洗上述人羊膜組織3-5遍后，放置在含100IU/ml青霉素和1000ug/ml鏈霉素 D-hank’ s液中浸泡2小時；2小時后用D_hank’ s液清洗3_5遍。
4.如權(quán)利要求3所述的將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，其特征 在于所述的步驟(3)是將清洗后的人羊膜組織加入等體積的0. 25%胰蛋白酶的消化液， 放入37°C水浴鍋中分兩次共消化45分鐘后，倒掉上述消化液，加入3ml的含10% FBS的 DMEM/F12液終止消化，將消化后的羊膜組織用D-hank’ s液清洗直至清洗液澄清為止。
5.如權(quán)利要求4所述的將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，其特 征在于所述分兩次共消化45分鐘是將清洗后的人羊膜組織加入等體積的0. 25%胰蛋 白酶消化液，放入37°C水浴鍋中消化15分鐘后，倒掉上述消化液，然后再加入等體積的新 0. 25%胰蛋白酶消化液，放入37°C水浴鍋中消化30分鐘后，倒掉上述消化液，在消化時每 隔5分鐘晃動一次，使人羊膜組織被充分地消化。
6.如權(quán)利要求5所述的將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，其特征 在于所述的步驟(4)中的將上述人羊膜組織分離成單個人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞是采取以下步 驟(I)將消化后的人羊膜組織用剪刀剪成漿狀后放入燒杯中，加入等體積的0.2%膠原 蛋白酶V，然后放入溫度為37°C的水浴鍋中消化20 30分鐘；(II)將消化后的羊膜漿狀液分別用60目細(xì)胞篩和200目細(xì)胞篩進(jìn)行過濾，得到細(xì)胞懸 濁液；(III)用無血清DMEM/F12按1 1的比例稀釋上述過濾后細(xì)胞懸濁液，然后在室溫下 將其放入離心機(jī)內(nèi)以2500r/min轉(zhuǎn)速離心10分鐘，10分鐘后將上述溶液中的上清液倒掉， 然后再加入DMEM/F12，用吸管將細(xì)胞吹打均勻后，再將其放入離心機(jī)內(nèi)以1500r/min轉(zhuǎn)速 離心5分鐘，5分鐘后將上述溶液中的上清液倒掉，再加入10% FBS和DMEM/F12培養(yǎng)液后， 用吸管將細(xì)胞吹打均勻后，使人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞個數(shù)為1 X IO6個/ml-2X IO6個/ml。
7.如權(quán)利要求6所述的將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，其特征 在于所述的步驟(5)是將步驟(4)得到人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞和含10% FBS的DMEM/F12培 養(yǎng)液放置在培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶在溫度為36. 5-37. 5°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為4. 5%的CO2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天更換全部培養(yǎng)液，培養(yǎng)5-7天，觀察培養(yǎng)瓶中人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞融合 達(dá)到85%以上時，去掉培養(yǎng)液，用D-hank’ s液清洗兩遍后，再加2ml 0. 25%的胰蛋白酶消 化液進(jìn)行消化，在消化過程中，用顯微鏡下觀察細(xì)胞的消化情況，當(dāng)70%的細(xì)胞變化成圓形 時，立即加入2ml含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，然后用力吹打培養(yǎng)瓶的壁，將 貼壁的細(xì)胞吹打下來；將回收的間充質(zhì)細(xì)胞放入離心機(jī)內(nèi)以1500r/min轉(zhuǎn)速每次離心5分 鐘，共計兩次，然后倒掉上清液，并計算細(xì)胞的個數(shù)；將上述回收的間充質(zhì)細(xì)胞1 X IO6個/ ml-2X IO6個/ml的密度重復(fù)上述操作進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)，直至達(dá)到所需細(xì)胞數(shù)量。
8.如權(quán)利要求7所述的將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，其特征 在于所述的步驟(7)的用RT-PCR方法是檢測上述細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，若上述細(xì)胞包括 胰島素、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)2、葡萄糖激酶、中間絲蛋白陽性細(xì)胞和胰腺和十二指腸同源盒細(xì)胞，說 明從步驟(6)得到的細(xì)胞為胰島分泌細(xì)胞，否則，說明從步驟(6)得到的細(xì)胞不是胰島分泌 細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求7所述的將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，其特征 在于所述的步驟(7)的用免疫細(xì)胞化學(xué)方法是檢測上述細(xì)胞是否包括胰島素和C肽的 表達(dá)，若上述細(xì)胞包括胰島素和C肽的表達(dá)，說明從步驟(6)得到的細(xì)胞為胰島分泌細(xì)胞， 否則，說明從步驟(6)得到的細(xì)胞不是胰島分泌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成胰島分泌細(xì)胞的方法，它包括從胎盤中分離出人羊膜組織；清洗上述人羊膜組織；消化清洗后的人羊膜組織；將上述人羊膜組織分離成單個人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞；將人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)增到所需的數(shù)目后，用含有20％FBS的α-MEM的培養(yǎng)基調(diào)整到人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞的個數(shù)為1×105個/ml，然后將其接種到24孔板中，待8-12小時細(xì)胞貼壁后，加入20mmol/L尼克酰胺后，先用低糖的DMEM預(yù)先誘導(dǎo)24小時后，誘導(dǎo)為中間絲蛋白陽性細(xì)胞，再用無血清的高糖DMEM誘導(dǎo)10小時后，得到胰島分泌細(xì)胞，利用上述方法得到的胰島分泌細(xì)胞可以用于修復(fù)人體內(nèi)的胰島組織。
文檔編號G01N33/53GK101914488SQ201010244938
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月4日
發(fā)明者劉艷軍, 劉穎, 吳亦芳, 張向利, 張紅霞, 曹克富, 李榮旗, 王月, 王瑞蘭, 肖靜, 范育紅, 郭麗麗, 郭敏 申請人:李榮旗