一株非解乳糖鏈球菌菌株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物菌種選育技術領域，具體涉及一株自雞盲腸分離篩選出的非解 乳糖鏈球菌菌株。
【背景技術】
[0002] 隨著遺傳學和分子生物學領域的飛速發(fā)展，許多新型復雜的技術被應用于菌種 選育，如原生質體融合育種技術和基因工程育種技術等，但是誘變育種技術仍是提供菌株 生產能力的重要有效手段。它獲得的正突變率相對較高，可以得到多種優(yōu)良突變體和新的 有益基因類型。另一方面，誘變育種存在一定的盲目性和隨機性，在實際應用中，研宄者 應根據出發(fā)菌株及實驗室條件等具體情況來選擇合適的誘變方法。陳鳳蓮等[2009年，哈 爾濱商業(yè)大學學報]通過采用紫外線誘變的方法結合平板培養(yǎng)基得到一產木聚糖酶活力 高的黑曲霉菌株A3,活力可達到58. 305U/mL。徐同寶等（2009年）以黑曲霉XE6為出發(fā)菌 株，經微波和硫酸二乙酯誘變處理，選育出一株高產木聚糖酶菌株mAnl，該菌株遺傳性狀 穩(wěn)定，并且利用單因素輪換法和正交試驗法對菌株進行發(fā)酵研宄，發(fā)現(xiàn)木聚糖酶的酶活為 81. 151U/g，比出發(fā)菌株的酶活提高了 34.88%。

【發(fā)明內容】

[0003] 為了進一步選育生產發(fā)酵黃芪多糖性能更好的菌株，本申請將紫外線和亞硝基胍 結合起來，對非解乳糖鏈球菌CGMCC No. 4227進行復合誘變，得到了一種發(fā)酵生產黃芪多 糖更為理想的菌株一非解乳糖鏈球菌（Streptococcus alactolyticus) UN10-1菌株，并將 其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號，中國科學院微生物研宄所，保藏時間2014年04月08日，保藏號CGMCC No. 9022。
[0004] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種包含非解乳糖鏈球菌（Streptococcus alactolyticus)UN10_l CGMCC No. 9022的發(fā)酵菌劑，其特征在于：所述發(fā)酵菌劑由以下步 驟制備得到：
[0005] (1)將非解乳糖鏈球菌（Streptococcus alactolyticus) UN10-1 CGMCC No. 9022 接入MRS培養(yǎng)基進行斜面培養(yǎng)；接種量為培養(yǎng)基體積分數的2% ;
[0006] (2)將步驟（1)得到的培養(yǎng)物進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵菌劑，接種量為培養(yǎng)基體積 分數的3%。
[0007] 優(yōu)選地，所述步驟（1)的培養(yǎng)條件為：溫度37°C，厭氧培養(yǎng)，時間為24h，pH值 6. 4 ~7. 4〇
[0008] 優(yōu)選地，所述步驟（2)的培養(yǎng)條件為：溫度37°C，厭氧培養(yǎng)，轉速120r/min，時間 48小時，pH值6. 4~7. 4。
[0009] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述非解乳糖鏈球菌UN10-1的篩選方法，是先進行 紫外線誘變再進行亞硝基胍誘變得到的。
[0010] 優(yōu)選地，所述紫外線誘變的條件為：波長為254nm，功率為15W，時間為IOs ;所述亞 硝基胍誘變的條件為I. 〇mg/ml。 toon] 本發(fā)明的第四個目的是提供上述菌株在提取多糖中的應用。
[0012] 本發(fā)明的第五個目的是提供上述菌株在發(fā)酵黃芪中的應用。
[0013] 本發(fā)明采用紫外線（UV)誘變和亞硝基胍（NTG)誘變相結合的復合誘變方法 (UV-NTG)對非解乳糖鏈球菌CGMCC No. 4227對數期菌懸液進行誘變篩選，最終獲得了一株 遺傳穩(wěn)定性好、安全的非解乳糖鏈球菌UN10-1CGMCC No. 9022。利用其發(fā)酵黃芪后，多糖產 量為293. 39mg/g，較原始出發(fā)菌株提高了 94. 99%，具有良好的開發(fā)前景。
[0014] 本發(fā)明的菌株具有發(fā)酵黃芪性能好，多糖產量高，安全性高等特點，可用于生產發(fā) 酵型黃芪多糖。
【附圖說明】
[0015] 附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發(fā)明的實 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0016] 圖1為不同的UV+NTG誘變條件與非解乳糖鏈球菌LZMYFGM9菌株CGMCC No. 4227 致死率的關系圖；
[0017] 圖2為UV-NTG復合誘變對非解乳糖鏈球菌LZMYFGM9菌株CGMCC No. 4227誘變后 多糖產量的影響圖。
【具體實施方式】
[0018] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0019] 實施例1
[0020] 1.菌種的復蘇與活化
[0021] 將中國專利201210141827. 5中提供的非解乳糖鏈球菌LZMYFGM9菌株（該菌株的 分類命名為非解乳糖鏈球菌Streptococcus alactolyticus，保藏編號為CGMCC No. 4227， 保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏地址為北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研宄所；保藏時間2010年10月19日）在37°C 快速復蘇，然后在無菌操作臺內將解凍的菌株接入滅菌MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37°C厭氧條 件下培養(yǎng)18_24h。按2%接種量將種子液加至新的滅菌MRS肉湯培養(yǎng)基中，將復蘇好的菌 進行傳代培養(yǎng)。
[0022] 取出已經活化并傳4代培養(yǎng)至對數期的培養(yǎng)液，3500r/min離心15min，棄上清，加 等體積無菌PBS(100mmol/L，pH7)，重新懸浮菌體，再離心，棄去上清，重復上述步驟2次，用 PBS恢復成菌懸液，菌懸液濃度控制為IO6個/ml左右，將上述菌懸液倒入裝有小玻璃珠的 無菌三角瓶內，振蕩20-30min，打散細胞。
[0023] 2.誘變處理
[0024] 申請人共設計了三種不同的誘變處理方法，具體如下：
[0025] (1)紫外線（UV)誘變
[0026] 波長為254nm，功率為15W的紫外燈預熱30min后，取6. OmL菌懸液分別鋪于7個 直徑為9cm的無菌培養(yǎng)皿中，將盛有菌懸液的平皿放在磁力攪拌器上，距離紫外燈20cm，分 別照射〇8、1〇8、3〇8、6〇8、9〇8、12〇 8、15〇8，邊照射邊攪拌，使菌體均勻接受紫外線光波。在紅 光下取0.1 mL菌懸液，用無菌生理鹽水梯度稀釋后涂布滅菌MRS瓊脂培養(yǎng)基平板，每個稀 釋度涂布3個平板，37°C厭氧避光培養(yǎng)，72h后觀察統(tǒng)計菌落總數，以未經紫外線處理的稀 釋液涂布平板為對照，計算致死率。
[0027] (2)亞硝基胍（NTG)誘變
[0028] 準確稱取20mg亞硝基胍于棕色瓶中，加0. 2ml丙酮使其溶解，溶解后加 PBS溶 液l〇ml，配制成2. Omg/ml亞硝基胍（NTG)母液。將NTG母液與菌懸液按比例混合，使NTG 的最終濃度分別為 〇· 5mg/mL、l. Omg/mL、l. 5mg/mL、2. 0mg/mL，30°C水浴，分別處理 IOmiru 20min、30min、60min，將NTG處理過的菌體3500r/min離心15min，用PBS沖洗3次以除去 NTG殘留，用PBS將菌懸