一種枯草芽孢桿菌及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種枯草芽孢桿菌及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 細菌性病害是危害農(nóng)作物生長的一類大病害，一直都嚴重危害著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)；目前， 常用的防治細菌性病害的藥劑主要是化學(xué)農(nóng)藥，而且對有些病害防治效果一般，對生態(tài)環(huán) 境及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全影響很大。在我國至今依然十分缺乏高效、廣譜、低毒、低殘留的以防 治細菌性病害為主的生物農(nóng)藥。
[0003] 枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種，其單個細胞0. 7~0. 8X2~3微米，著色均 勻。無莢膜，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.6~0.9X1.0~1.5微米，橢圓到 柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色，它通過 競爭性生長繁殖占據(jù)生存空間的方式來阻止植物植物病原菌的生長，能在植物表面迅速形 成一層保護膜，使農(nóng)作物免受病原菌為害?？莶菅挎邨U菌還能分泌抑菌物質(zhì)，抑制病菌孢子 發(fā)芽和菌絲生長。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)還存在以下問題：
[0005] 1、現(xiàn)有枯草芽孢桿菌制劑對水稻稻瘟病、水稻稻曲病、黃瓜白粉病、草莓灰霉病等 多種真菌引起的植物病害有明顯的防治效果，但是并沒有廠家在細菌引起的病害上取得登 記。
[0006] 2、現(xiàn)有制備枯草芽孢桿菌的方法通常采用液體發(fā)酵取得發(fā)酵液，預(yù)處理后用碟式 離心機濃縮，然后進行噴霧干燥得到原粉；發(fā)酵液經(jīng)過碟式離心機分離，重液留下，輕液棄 去，分離速度快但是收率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對以上問題，本發(fā)明提出了一種生長繁殖快、發(fā)酵周期短、下罐孢子數(shù)高和防治 效果好，制備效率高，可以防治多種細菌性病害的枯草芽孢桿菌及其制備方法和用途。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0009] 上述的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，其保藏號為CGMCC NO :9269。
[0010] 所述枯草芽孢桿菌，其中：所述菌種屬于細菌域（Bacteria)~厚壁菌門 (Firmicutes)~芽抱桿菌綱（Bacilli)~芽抱桿菌目（Bacillales)~芽抱桿菌科 (Bacillaceae)~芽抱桿菌（Bacillus)~枯草芽抱桿菌（B. subtilis)，菌種代號為M22,在 自然界中以活芽孢形式存在。
[0011] 所述枯草芽孢桿菌，其中，所述菌種的有效成分分析方法為：采用稀釋平板法，將 稀釋后菌懸液定量接種于培養(yǎng)基中，待枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)基內(nèi)長出菌落，計數(shù)枯草芽孢 桿菌菌落數(shù)，以測定樣品的單位重量活芽孢數(shù)。
[0012] 所述枯草芽孢桿菌，其中：所述菌種能夠用于制造孢子數(shù)為2000億活芽孢/克的 原粉，雜菌率< 5%。
[0013] 一種枯草芽孢桿菌的制備方法，其包括以下步驟：（1)配制菌種，即將10個克氏 瓶種子加無菌水做成菌懸液，在無菌條件下接種到大罐中；（2)發(fā)酵培養(yǎng)基，即將含量為 2. 0%~3. 2%且細度大于80目的啤酒酵母粉、含量為1. 0%~1. 6%的工業(yè)級玉米淀粉、 含量為0. 2 %~0. 6 %的工業(yè)級碳酸鈣、含量為0. 2 %~0. 6 %的工業(yè)級磷酸二氫鉀、含量為 0. 2%~0. 6%的工業(yè)級硫酸銨和含量為0. 02%~0. 04%的工業(yè)級消泡劑放入滅菌后體積 為發(fā)酵罐60 %容積的罐中，滅菌前pH7. 3~7. 5 ;然后在0~6h這段時間內(nèi)保持通氣量為 1 : 0.6,在6~IOh這段時間內(nèi)保持通氣量為1 : 0.7, IOh至放罐通氣量為I : 1;在0~ 24h這段時間內(nèi)溫度為31 °C~32 °C，24h至放罐這段時間內(nèi)溫度為30 °C~31 °C，罐內(nèi)壓力 為0. 05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min。
[0014] (3)后處理，即發(fā)酵38小時左右，鏡檢看到視野內(nèi)80%以上的成熟孢子，放罐至調(diào) 漿罐，調(diào)pH至5. 0,加入輔料后噴霧干燥；最后，按比例加入助劑形成制劑，加入助劑將原藥 稀釋為100億/克，助劑白炭黑為總質(zhì)量的8%~12%，茶皂素為總質(zhì)量的5%~8%，其余 為娃藻土。
[0015] 所述枯草芽孢桿菌的制備方法，其中，所述步驟（3)中所述輔料是由發(fā)酵液中干 物質(zhì)的質(zhì)量百分數(shù)為：3%的木質(zhì)素磺酸鈉、3%的十二烷基磺酸鈉、8%的氯化鈉和0.5% 的白炭黑組成。
[0016] 所述枯草芽孢桿菌的制備方法，其中：所述步驟（3)中噴霧干燥在進風(fēng)溫度為 140°C，出風(fēng)溫度為80°C下可制成孢子數(shù)為2000億活孢子數(shù)/克的原粉。
[0017] 一種枯草芽孢桿菌的用途，其中：所述菌種的搖培液對靶標菌水稻白葉枯病菌、靶 標菌煙草青枯病菌、靶標菌煙草野火病菌、靶標菌柑橘潰瘍病菌和靶標菌白菜軟腐病菌均 具有明顯的抑制作用。
[0018] 有益效果：
[0019] 本發(fā)明枯草芽孢桿菌具有有生長繁殖快、發(fā)酵周期短、下罐孢子數(shù)高和防治效果 好等優(yōu)點。
[0020] 本發(fā)明枯草芽孢桿菌的制備方法步驟簡單、操作方便，是由深度發(fā)酵、陶瓷膜濃縮 和噴霧干燥得到枯草芽孢桿菌，制備效率高、效果好；采用液體發(fā)酵取得發(fā)酵液，預(yù)處理后 用膜分離設(shè)備濃度，然后進行噴霧干燥得到原粉；膜分離設(shè)備收率高，可以得到2000億活 孢子數(shù)/克的原粉。
[0021] 本發(fā)明枯草芽孢桿菌可以防治多種細菌性病害，目前已登記在白菜軟腐病、柑橘 潰瘍病、煙草野火病、煙草青枯病和水稻白葉枯病上。
【具體實施方式】
[0022] 本發(fā)明枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的保藏號為CGMCC NO :9269,其 屬于細菌域（Bacteria)，厚壁菌門（Firmicutes)，芽孢桿菌綱（Bacilli)，芽孢桿菌 目（Baci Ilales)，芽抱桿菌科（Baci Ilaceae)，芽抱桿菌（Bacillus)，枯草芽抱桿菌 (B. subtilis)，菌種代號M22,在自然界中以活芽孢形式存在。
[0023] 本發(fā)明枯草芽孢桿菌原粉的有效成分含量為2000億活芽孢/克，雜菌率< 5%。
[0024] 本發(fā)明枯草芽孢桿菌制劑中其他組成成分名稱及含量，如下表1所示：
[0025] 表 1
[0026]
【主權(quán)項】
1. 一種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，其特征在于所述菌種的保藏號為CGMCC NO ：9269〇
2. 如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于：所述菌種屬于細菌域 (Bacteria)~厚壁菌門（Firmicutes)~芽抱桿菌綱（Bacilli)~芽抱桿菌目 (Bacillales)~芽抱桿菌科（Bacillaceae)~芽抱桿菌（Bacillus)~枯草芽抱桿菌 (B. subtilis)，菌種代號為M22,在自然界中以活芽孢形式存在。
3. 如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述菌種的有效成分分析方法為： 采用稀釋平板法，將稀釋后菌懸液定量接種于培養(yǎng)基中，待枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)基內(nèi)長出 菌落，計數(shù)枯草芽孢桿菌菌落數(shù)，以測定樣品的單位重量活芽孢數(shù)。
4. 如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于：所述菌種能夠用于制造孢子數(shù)為 2000億活芽孢/克的原粉，雜菌率< 5%。
5. -種如權(quán)利要求1至4任意一項所述的枯草芽孢桿菌的制備方法，其特征在于包括 以下步驟： (1) 配制菌種 即將10個克氏瓶種子加無菌水做成菌懸液，在無菌條件下接種到大罐中； (2) 發(fā)酵培養(yǎng)基 將含量為2. 0%~3. 2%且細度大于80目的啤酒酵母粉、含量為1. 0%~1. 6%的工業(yè) 級玉米淀粉、含量為〇. 2 %~0. 6 %的工業(yè)級碳酸鈣、含量為0. 2 %~0. 6 %的工業(yè)級磷酸二 氫鉀、含量為〇. 2%~0. 6%的工業(yè)級硫酸銨和含量為0. 02%~0. 04%的工業(yè)級消泡劑放 入滅菌后體積為發(fā)酵罐60%容積的罐中，滅菌前pH7. 3~7. 5 ;然后在0~6h這段時間內(nèi) 保持通氣量為1 : 0.6,在6~IOh這段時間內(nèi)保持通氣量為1 : 0.7, IOh至放罐通氣量 為I : 1;在0~24h這段時間內(nèi)溫度為31°C~32°C，24h至放罐這段時間內(nèi)溫度為30°C~ 31°C，罐內(nèi)壓力為0? 05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min。 (3) 后處理 即發(fā)酵38小時左右，鏡檢看到視野內(nèi)80%以上的成熟孢子，放罐至調(diào)漿罐，調(diào)pH至 5.0,加入輔料后噴霧干燥； 最后，按比例加入助劑形成制劑，加入助劑將原藥稀釋為100億/克，助劑白炭黑為總 質(zhì)量的8%~12%，茶皂素為總質(zhì)量的5%~8%，其余為硅藻土。
6. 如權(quán)利要求5所述的枯草芽孢桿菌的制備方法，其特征在于，所述步驟⑶中所述輔 料是由發(fā)酵液中干物質(zhì)的質(zhì)量百分數(shù)為：3 %的木質(zhì)素磺酸鈉、3 %的十二烷基磺酸鈉、8 % 的氯化鈉和〇. 5%的白炭黑組成。
7. 如權(quán)利要求5所述的枯草芽孢桿菌的制備方法，其特征在于：所述步驟（3)中噴霧 干燥在進風(fēng)溫度為140°C，出風(fēng)溫度為80°C下可制成孢子數(shù)為2000億活孢子數(shù)/克的原 粉。
8. -種如權(quán)利要求1至4任意一項所述的枯草芽孢桿菌的用途，其特征在于：所述菌 種的搖培液對靶標菌水稻白葉枯病菌、靶標菌煙草青枯病菌、靶標菌煙草野火病菌、靶標菌 柑橘潰瘍病菌和靶標菌白菜軟腐病菌均具有明顯的抑制作用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，該菌種的保藏號為CGMCC NO：9269。該菌種是由深度發(fā)酵、陶瓷膜濃縮、噴霧干燥得到。該菌種的搖培液對靶標菌水稻白葉枯病菌、靶標菌煙草青枯病菌、靶標菌煙草野火病菌、靶標菌柑橘潰瘍病菌和靶標菌白菜軟腐病菌均具有明顯的抑制作用。本發(fā)明枯草芽孢桿菌具有生長繁殖快、發(fā)酵周期短、下罐孢子數(shù)高和防治效果好等優(yōu)點；同時，該菌種的制備方法步驟簡單、操作方便，是由深度發(fā)酵、陶瓷膜濃縮和噴霧干燥得到枯草芽孢桿菌，制備效率高、效果好；該菌種可以防治多種細菌性病害，目前已登記在白菜軟腐病、柑橘潰瘍病、煙草野火病、煙草青枯病和水稻白葉枯病上。
【IPC分類】C12N1-20, A01P1-00, A01N63-02, C12R1-125
【公開號】CN104805031
【申請?zhí)枴緾N201410473208
【發(fā)明人】易虹, 王敏, 楊文亮, 章麗, 田利, 崔占東, 穆春, 董蕾, 余滿
【申請人】德強生物股份有限公司
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2014年9月17日