從豬分離的菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的第一方面涉及一種豬乳酸菌菌株，其中所述菌株的特征在于一種或多種以下特征：(i)展現(xiàn)出針對(duì)大腸桿菌的抗微生物活性的能力；(ii)展現(xiàn)出針對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的抗微生物活性的能力；(iii)抑制由12-氧-十四烷酰戟二萜醇-13-乙酸酯（PMA）誘導(dǎo)的IPEC細(xì)胞中的炎癥的能力；(iv)阻斷腸炎沙門(mén)氏菌附著或侵入IPEC細(xì)胞的能力；(v)阻斷大腸桿菌附著或侵入IPEC細(xì)胞的能力；(vi)沒(méi)有對(duì)選自以下的一種或多種抗生素的抗生素抗性：氨芐西林；頭孢噻肟；氯霉素；紅霉素；艮他霉素；四環(huán)素；萬(wàn)古霉素；甲硝唑；萘啶酸；和卡那霉素；和(vii)當(dāng)遭受三個(gè)循環(huán)的加熱時(shí)展現(xiàn)出熱穩(wěn)定性的能力，每個(gè)所述循環(huán)包括在70℃的溫度下加熱15分鐘。本發(fā)明的其他方面涉及包含所述菌株的組合物及所述菌株的治療用途。
【專利說(shuō)明】從豬分離的菌株

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及從豬分離的菌株。更具體地，本發(fā)明涉及從有機(jī)飼養(yǎng)的豬分離乳酸菌。所要求保護(hù)的乳酸菌具有有益的益生菌應(yīng)用和治療應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]豬的菌群組成，其消化道先天免疫功能和可能的對(duì)感染的易感性受到其生命早期飼養(yǎng)環(huán)境的極大影響(Mulder et al，2009)。室外飼養(yǎng)的豬通常比室內(nèi)飼養(yǎng)的豬具有更發(fā)達(dá)的消化道免疫系統(tǒng)，表現(xiàn)更好且更健康。戶外環(huán)境顯著地影響了消化道的微生物的多樣性，并且與高水平的硬壁菌門(mén)(Firmicutes)，尤其是乳酸菌[LAB]有關(guān)。
[0003]LAB包含一個(gè)進(jìn)化枝的革蘭氏陽(yáng)性、低GC、耐酸、通常不形成孢子、不呼吸的細(xì)菌，其與某些常見(jiàn)的代謝和生理特征有關(guān)。LAB是棒狀桿菌或球菌，其特征為對(duì)較低的pH范圍有增加的耐受性。LAB可產(chǎn)生乳酸，作為碳水化合物發(fā)酵的主要代謝終產(chǎn)物并且是食品工業(yè)中使用的最重要的微生物類群之一。
[0004]乳桿菌(Lactobacilli)在有機(jī)(室外)飼養(yǎng)的豬的消化道菌群中占優(yōu)勢(shì)地位。相比之下,在室內(nèi)飼養(yǎng)的豬中這些細(xì)菌的數(shù)量低,可能致病的種系型的水平高(Mulder etal, 2009) 0此外，已知室內(nèi)飼養(yǎng)的豬的消化道免疫發(fā)育和功能偏離了正常水平。具體地，已知I型干擾素基因、主要組織相容性復(fù)合體I類和若干趨化因子的表達(dá)增加(Mulder etal, 2009)。
[0005]乳酸菌可以以若干方式改變菌群以及消化道結(jié)構(gòu)和功能(Cotter et al, 2005 ；Ohashi and Ushida，2009)。例如，乳酸菌可以與有害細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)素或消化道上的附著位點(diǎn)，導(dǎo)致有害細(xì)菌被驅(qū)逐?；蛘撸樗峋僧a(chǎn)生生物活性物質(zhì)，其幫助或促進(jìn)有益細(xì)菌的定殖或殺死可能有害的細(xì)菌或致病菌或干擾其生長(zhǎng)?；蛘?，這些生物活性因子可以是促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育和消化道屏障完整性的免疫調(diào)節(jié)劑。LAB菌株的生物活性大不相同。本發(fā)明旨在提供具有在治療上有用的特性的LAB菌株。更具體地，本發(fā)明旨在提供能夠促進(jìn)消化道和免疫系統(tǒng)發(fā)育和健康的LAB菌株,從而作為益生菌具有可觀的治療潛力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本 申請(qǐng)人:已經(jīng)表明，室外飼養(yǎng)的豬的微生物叢含有可產(chǎn)生強(qiáng)效且特異性的抗微生物生物活性因子或細(xì)胞_/免疫-調(diào)節(jié)生物活性因子的LAB菌株。
[0007]本發(fā)明的多個(gè)方面與優(yōu)選的實(shí)施方案一起在所附的權(quán)利要求書(shū)中列出。
[0008]本發(fā)明的第一方面涉及一種豬乳酸菌菌株，其中所述菌株的特征在于一種或多種如下特征:
[0009](i)展現(xiàn)出針對(duì)大腸桿菌(E.coli)的抗微生物活性的能力；
[0010](ii)展現(xiàn)出針對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌(S.enteritidis)的抗微生物活性的能力；
[0011](iii)抑制由 12-氧-十四燒酰戟二職醇-13-乙酸酯(12-0-tetradecaboylphorbol-13-acetate (PMA))誘導(dǎo)的IPEC細(xì)胞中的炎癥的能力；
[0012](iv)阻斷腸炎沙門(mén)氏菌附著或侵入IPEC細(xì)胞的能力；
[0013](V)阻斷大腸桿菌附著或侵入IPEC細(xì)胞的能力；
[0014](vi)沒(méi)有對(duì)選自以下的一種或多種抗生素的抗生素抗性:氨芐西林；頭孢噻肟；氯霉素；紅霉素；艮他霉素；四環(huán)素；萬(wàn)古霉素；甲硝唑(metronizadole);萘唳酸；和卡那霉素；和
[0015](vii)當(dāng)遭受三個(gè)循環(huán)的加熱時(shí)展現(xiàn)出熱穩(wěn)定性的能力，每個(gè)循環(huán)包括在70°C的溫度下加熱15分鐘。
[0016]第二方面涉及一種包含一種或多種本發(fā)明的乳酸菌菌株和可藥用賦形劑、載體或稀釋劑的組合物。
[0017]第三方面涉及一種包含一種或多種本發(fā)明的乳酸菌菌株的益生菌組合物。
[0018]第四方面涉及一種或多種本發(fā)明的乳酸菌菌株用于藥物。
[0019]第五方面涉及一種或多種本發(fā)明的乳酸菌菌株用于治療受試者中的腸道病癥。
[0020]第六方面涉及一種或多種本發(fā)明的乳酸菌菌株在制備用于治療受試者中腸道病癥的藥物中的用途。
[0021]第七方面涉及一種治療受試者中的腸道病癥的方法，所述方法包括給予所述受試者治療有效量的一種或多種本發(fā)明的乳酸菌菌株或本發(fā)明的組合物。
[0022]本發(fā)明的第八方面涉及一種或多種本發(fā)明的乳酸菌菌株用于改善腸道微生物群。
[0023]本發(fā)明的第九方面涉及一種改善受試者中的腸道微生物群的方法，所述方法包括給予所述受試者一種或多種本發(fā)明的乳酸菌菌株或本發(fā)明的組合物。
[0024]第十方面涉及一種包含一種或多種本發(fā)明的乳酸菌菌株的飼料。
[0025]第H^一方面涉及一種包含一種或多種本發(fā)明的乳酸菌菌株的食品。
[0026]第十二方面涉及一種包含一種或多種本發(fā)明的乳酸菌菌株的飲食補(bǔ)充劑。
[0027]第十三方面涉及一種包含一種或多種本發(fā)明的乳酸菌菌株的食品添加劑。
[0028]第十四方面涉及一種產(chǎn)生益生菌的方法，所述方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的乳酸菌菌株。
[0029]本發(fā)明的第十五方面涉及一種獲得豬乳酸菌菌株的方法，所述方法包括從有機(jī)飼養(yǎng)的豬獲得糞便并從所述糞便提取一種或多種豬乳酸菌菌株。
[0030]本發(fā)明的第十六方面涉及通過(guò)上述方法獲得或可獲得的一種或多種豬乳酸菌菌株。

【具體實(shí)施方式】
[0031]如上所述，本發(fā)明涉及一種或多種豬乳酸菌菌株。所述乳酸菌菌株的特征在于一種或多種如下特征:
[0032](i)展現(xiàn)出針對(duì)大腸桿菌的抗微生物活性的能力；
[0033](ii)展現(xiàn)出針對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的抗微生物活性的能力；
[0034](iii)抑制由12-氧-十四烷酰戟二萜醇-13-乙酸酯(PMA)誘導(dǎo)的IPEC細(xì)胞中的炎癥的能力；
[0035](iv)阻斷腸炎沙門(mén)氏菌附著或侵入IPEC細(xì)胞的能力；
[0036](V)阻斷大腸桿菌附著或侵入IPEC細(xì)胞的能力；
[0037](vi)沒(méi)有對(duì)選自以下的一種或多種抗生素的抗生素抗性:氨芐西林；頭孢噻肟；氣霉素；紅霉素；艮他霉素；四環(huán)素；萬(wàn)古霉素；甲硝唑；奈淀酸；和卡那霉素；和
[0038](vii)當(dāng)遭受三個(gè)循環(huán)的加熱時(shí)展現(xiàn)出熱穩(wěn)定性的能力，每個(gè)循環(huán)包括在70°C的溫度下加熱15分鐘。
[0039]本文使用的術(shù)語(yǔ)“豬”意指“豬的或?qū)儆谪i”，即任一種豬科哺乳動(dòng)物的或?qū)儆谌我环N豬科哺乳動(dòng)物，尤其是年幼的或體積相對(duì)小的家養(yǎng)閹豬、馴化的歐洲中部野豬(Susscrofa domesticus)或家豬(Sus domesticus)。
[0040]優(yōu)選地，所述豬不到3個(gè)月大，優(yōu)選地，不到2個(gè)月大。
[0041]優(yōu)選地，所述豬乳酸菌菌株來(lái)自有機(jī)飼養(yǎng)的豬。在這一點(diǎn)上，優(yōu)選地，所述豬是在沒(méi)有抗生素、生長(zhǎng)促進(jìn)劑和/或生長(zhǎng)增強(qiáng)劑的情況下在外面自由放養(yǎng)的(同時(shí)暴露于土壤)。
[0042]優(yōu)選地，所述豬乳酸菌菌株來(lái)自室外飼養(yǎng)的豬。優(yōu)選地，所述豬生命的至少60 %是在外面飼養(yǎng)的。更優(yōu)選地，所述動(dòng)物生命的至少80%是在外面飼養(yǎng)的，更優(yōu)選地，所述動(dòng)物生命的至少90 %，甚至更優(yōu)選其生命的100 %是在外面飼養(yǎng)的。
[0043]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株選自約氏乳桿菌(L.johnsonii)、路氏乳桿菌(L.reuteri)、植物乳桿菌(L.plantarum)、加氏乳桿菌(L.gasseri)、戍糖乳桿菌(L.pentosus)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、陰道乳桿菌(L.vaginalis)和粘膜乳桿菌(L.mucosae)。
[0044]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株選自約氏乳桿菌、路氏乳桿菌和植物乳桿菌。
[0045]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株的形式是活的細(xì)菌群、凍干的細(xì)菌群、不活的細(xì)菌制劑或其細(xì)胞組分。優(yōu)選地，當(dāng)所述菌株的形式是不活的細(xì)菌制劑時(shí)，其選自熱滅活的細(xì)菌、輻照的細(xì)菌和裂解的細(xì)菌。
[0046]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株的形式是活細(xì)菌、死細(xì)菌或其細(xì)胞組分。
[0047]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株是分離的形式。本文使用的術(shù)語(yǔ)“分離的”意指從其天然環(huán)境分離出來(lái)。
[0048]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株是生物純的形式。本文使用的術(shù)語(yǔ)“生物純的”是指實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)物形式的菌株，其基本上不含其他種類的生物。優(yōu)選地，所述乳酸菌菌株的形式是單一生物種類的培養(yǎng)物。
[0049]本文使用的術(shù)語(yǔ)“乳酸菌菌株”還包括所述乳酸菌菌株的突變株。本文使用的術(shù)語(yǔ)“突變株”包括與參考株的多核苷酸序列有至少93%同源性，優(yōu)選至少96%同源性，更優(yōu)選98%同源性而在細(xì)菌基因組的其他序列中包含突變的衍生菌株。突變株可通過(guò)基因工程技術(shù)獲得，意味著有本發(fā)明的菌株遺傳物質(zhì)的改變或意味著有本發(fā)明菌株遺傳物質(zhì)與其他分子的重組。通常，為了獲得這樣的突變菌株，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用標(biāo)準(zhǔn)的誘變技術(shù)例如UV輻射或暴露于致誘變的化學(xué)制品。
[0050]本文使用的術(shù)語(yǔ)“突變”包括天然的或誘導(dǎo)的突變，所述突變包含至少一個(gè)堿基改變——包括缺失、插入、顛換和其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的修飾，所述修飾包括引入到親本核苷酸或氨基酸序列中同時(shí)保持與親本序列至少50%同源性的遺傳修飾。優(yōu)選地，包含所述一個(gè)或多個(gè)突變的序列具有與親本序列至少60%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選85%的同源性。本文使用的序列“同源性”可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定。例如，同源性可使用在線的同源性算法“BLAST”程序確定,所述程序可在http)://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/公開(kāi)獲得。
[0051]本文使用的術(shù)語(yǔ)“乳酸菌菌株”還包括乳酸菌菌株的同系物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“同系物”是指核苷酸序列與親本乳酸菌菌株的核苷酸序列有一定程度的序列同一性或序列同源性的乳酸菌菌株(此后稱作“同源序列”)。在本文中，術(shù)語(yǔ)“同源”意指實(shí)體與目標(biāo)核苷酸序列有一定同源性。在本文中，術(shù)語(yǔ)“同源性”可以等同于“同一性”。
[0052]在本發(fā)明的上下中，同源序列被理解為包括與親本乳酸菌菌株的核苷酸序列(目標(biāo)序列)有至少50、60、70、75、80、85或90%的同一性，優(yōu)選至少95%、97%、98%或99%的同一'I"生的核苷酸序列。
[0053]同源性比較可以用眼睛進(jìn)行，或更通常地，借助于容易獲得的序列比較程序進(jìn)行。這些可商購(gòu)的計(jì)算機(jī)程序可計(jì)算兩條或多條序列之間的同源性％?？稍谶B續(xù)序列上計(jì)算同源性％，即，一條序列與另一條序列比對(duì)，將一條序列中的每個(gè)氨基酸直接與另一條序列中對(duì)應(yīng)的氨基酸進(jìn)行比較，一次一個(gè)殘基。這被稱為“無(wú)空位”比對(duì)。通常，這種無(wú)空位比對(duì)僅在相對(duì)少量的殘基上進(jìn)行。
[0054]雖然這是一種非常簡(jiǎn)單且一致的方法，但是它不能顧及到，例如，在以其他方式具有同一性的序列對(duì)中，一個(gè)插入或缺失會(huì)使后面的氨基酸殘基被置于比對(duì)之外，從而在進(jìn)行總體比對(duì)時(shí)可能導(dǎo)致同源性％大大降低。
[0055]因此，計(jì)算同源性％最大值首先需要產(chǎn)生考慮到空位罰分的最佳比對(duì)。進(jìn)行這類比對(duì)的適合計(jì)算機(jī)程序是Vector NTI (Invitrogen Corp.)。可進(jìn)行序列比較的軟件的實(shí)例包括但不限于例如BLAST程序包(見(jiàn)于Ausubel et all999Short Protocols in MolecularB1logy,第 4 版-第 18 章)、BLAST2 (見(jiàn)于 FEMSMicrob1l Lettl999174 (2): 247-50 ；FEMSMicrob1l Lettl999177 (I):187-8)、FASTA(Altschul et all990J.Mol.B1l.403-410)和AlignX0至少BLAST、BLAST2和FASTA可獲得用于進(jìn)行離線和在線搜索(見(jiàn)于Ausubel etall999, 7-58 至 7-60 頁(yè))。
[0056]優(yōu)選地，在至少20個(gè)連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選在至少30個(gè)連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選在至少40個(gè)連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選在至少50個(gè)連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選在至少60個(gè)連續(xù)核苷酸上，優(yōu)選在至少100個(gè)連續(xù)核苷酸上，確定核苷酸序列的同一性程度。優(yōu)選地，可在全序列上確定核苷酸序列的同一'I"生程度。
[0057]慣用的基于表型特征的細(xì)菌鑒定通常不像基于基因型方法的鑒定那樣精確。細(xì)菌16S rRNA基因序列比較已經(jīng)作為優(yōu)選的遺傳技術(shù)出現(xiàn)并且使得能夠通過(guò)使用BLAT (http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與已知細(xì)菌 DNA 序列進(jìn)行序列比較來(lái)鑒定新菌株。16S rRNA基因序列在細(xì)菌中是普遍存在的，因此可測(cè)量許多不同細(xì)菌之間的關(guān)系。通常，除了在多個(gè)水平(包括種和亞種水平)上對(duì)菌株進(jìn)行分類以外，比較16S rRNA序列容許跨越所有主要的細(xì)菌門(mén)在屬水平上進(jìn)行生物區(qū)分。已經(jīng)確定了大量菌株的16SrRNA基因序列。GenBank，最大的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，有超過(guò)2000萬(wàn)條儲(chǔ)存的序列，其中超過(guò)90000條屬于16S rRNA基因。這意味著可將未知菌株的序列與許多之前儲(chǔ)存的序列進(jìn)行比較。
[0058]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株具有選自SEQ ID N0:l_87的16S rRNA基因序列，或其同系物或變體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及包含選自SEQ ID N0:l-87的16S rRNA基因序列或其同系物或變體的乳酸菌菌株?？勺鬟m當(dāng)變動(dòng)將優(yōu)選的用途/方法應(yīng)用于該方面。
[0059]術(shù)語(yǔ)“同系物”是如上所定義的。本文使用的術(shù)語(yǔ)“變體”包括任何變化，其中:(a)一個(gè)或多個(gè)核苷酸被另外的核苷酸置換或被缺失，(b)兩個(gè)或多個(gè)核苷酸的順序顛倒，(C)(a)和(b) —起存在。優(yōu)選地，所述變體由(a)、(b)或(C)中的一項(xiàng)產(chǎn)生。更優(yōu)選地，一個(gè)或兩個(gè)核苷酸被置換或缺失。甚至更優(yōu)選地，一個(gè)核苷酸被另一個(gè)核苷酸置換。
[0060]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株的特征在于展現(xiàn)出針對(duì)大腸桿菌的抗微生物活性的能力。所觀察到的抗微生物活性最有可能是因?yàn)楸景l(fā)明的乳酸菌菌株產(chǎn)生的抗微生物物質(zhì)，雖然尚未確定這些抗微生物物質(zhì)的性質(zhì)。
[0061]在本發(fā)明的上下文中，展現(xiàn)出針對(duì)大腸桿菌的抗微生物活性的能力可以通過(guò)在體外孔擴(kuò)散測(cè)定中測(cè)量對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制而確定。孔擴(kuò)散測(cè)定的更多細(xì)節(jié)在所附的實(shí)施例中列出。所述測(cè)定在MacConkey No3瓊脂上使用大腸桿菌K88進(jìn)行，平板在37°C孵育16小時(shí)。更具體地，將大腸桿菌K88加入到所述瓊脂(在200ml瓊脂中加入1ml的1:1000稀釋的大腸桿菌K88過(guò)夜培養(yǎng)物，以得到相當(dāng)于106CFU/ml的濃度)。將所述瓊脂倒入培養(yǎng)皿中并使其凝固。將所述平板標(biāo)記分隔成四個(gè)象限，并在每個(gè)象限中切出約5_的孔。向所述孔加入條件培養(yǎng)基或MRS肉湯培養(yǎng)基的小份(60 μ I)。蓋上所述平板并將其在37°C孵育16小時(shí)。使用數(shù)字照相機(jī)給它們拍照。將圖像轉(zhuǎn)移到Photoshop，使用測(cè)量工具確定所述孔和抑菌圈的直徑。
[0062]在上述孔擴(kuò)散測(cè)定中殺死大腸桿菌的情況下，優(yōu)選地，本發(fā)明的乳酸菌菌株展現(xiàn)出〈20000單位的抑制，更優(yōu)選20000-40000單位，甚至更優(yōu)選40000-60000單位，更優(yōu)選60000-80000單位，更優(yōu)選80000-100000單位的抑制，甚至更優(yōu)選>100000單位的抑制。
[0063] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株的特征在于展現(xiàn)出針對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的抗微生物活性的能力。同樣地，所觀察到的抗微生物活性最有可能是因?yàn)楸景l(fā)明的乳酸菌菌株產(chǎn)生的抗微生物物質(zhì)，雖然尚未確定這些抗微生物物質(zhì)的性質(zhì)。
[0064]在本發(fā)明的上下文中，展現(xiàn)出針對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的抗微生物活性的能力是通過(guò)在體外孔擴(kuò)散測(cè)定中測(cè)量抑制腸炎沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)的能力而確定?？讛U(kuò)散測(cè)定的更多細(xì)節(jié)在所附的實(shí)施例中列出。所述測(cè)定在XLD瓊脂上使用腸炎沙門(mén)氏菌S1400進(jìn)行，平板在37°C孵育16小時(shí)。XLD瓊脂按照制造商的說(shuō)明書(shū)制備并冷卻到45°C。將腸炎沙門(mén)氏菌S1400加入到所述XLD瓊脂(在200ml瓊脂中加入1ml的1:1000稀釋的腸炎沙門(mén)氏菌S1400過(guò)夜培養(yǎng)物，以得到相當(dāng)于106CFU/ml的濃度)。將所述XLD瓊脂倒入培養(yǎng)皿中并使其凝固。將所述平板標(biāo)記分隔成四個(gè)象限，并在每個(gè)象限中切出約5mm的孔。向所述孔加入條件培養(yǎng)基或MRS肉湯培養(yǎng)基的小份(60 μ I)。蓋上所述平板并將其在37°C孵育16小時(shí)，如上文所述對(duì)大腸桿菌測(cè)定分析所述數(shù)據(jù)。
[0065]在上述孔擴(kuò)散測(cè)定中殺死腸炎沙門(mén)氏菌的情況下，優(yōu)選地，本發(fā)明的乳酸菌菌株展現(xiàn)出〈20000單位的抑制，更優(yōu)選20000-40000單位，甚至更優(yōu)選40000-60000單位，更優(yōu)選60000-80000單位，更優(yōu)選80000-100000單位的抑制，甚至更優(yōu)選>100000單位的抑制。
[0066]在替代的實(shí)施方案中，展現(xiàn)出針對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的抗微生物活性的能力可通過(guò)在C3H/HeN或C57B1/6小鼠中在體內(nèi)測(cè)量抑制腸炎沙門(mén)氏菌的能力而確定。適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)測(cè)定的更多細(xì)節(jié)在所附的實(shí)施例中列出。
[0067]具體地，在用腸炎沙門(mén)氏菌攻擊之前和之后，用本發(fā)明的乳酸菌菌株處理C3H/HeN和C57B1/6小鼠。在感染后6天(C57B1/6)或10天(C3H/HeN)對(duì)所述小鼠實(shí)施安樂(lè)死并進(jìn)行解剖，與適當(dāng)?shù)膶?duì)照相比，在全身多個(gè)組織(例如腸系膜淋巴結(jié)、肝和脾)中，在腸(例如盲腸、結(jié)腸)中以及在糞便中，檢測(cè)到了活沙門(mén)氏菌。本發(fā)明乳酸菌菌株的體內(nèi)活性還可通過(guò)在用沙門(mén)氏菌或沙門(mén)氏菌加上LAB處理的C3H/HeN小鼠的腸中確定髓過(guò)氧化物酶[ΜΡ0]水平來(lái)測(cè)量，所述髓過(guò)氧化物酶是中性白細(xì)胞的標(biāo)志物。沙門(mén)氏菌感染大大地增加了腸中的ΜΡ0，這是由于在針對(duì)感染的宿主反應(yīng)中中性白細(xì)胞被募集到腸部分。用本發(fā)明的乳酸菌菌株進(jìn)行共處理降低了感染沙門(mén)氏菌的小鼠的腸中的MPO活性，表明相對(duì)于對(duì)照實(shí)驗(yàn)，在這些動(dòng)物中對(duì)感染的腸炎癥應(yīng)答減弱了。
[0068]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株的特征在于抑制由12-氧-十四烷酰戟二萜醇-13-乙酸酯(PMA)誘導(dǎo)的IPEC細(xì)胞中的炎癥的能力。在本發(fā)明的上下文中，這是指乳酸菌菌株阻斷由PMA觸發(fā)的白細(xì)胞介素-8(IL-8)基因表達(dá)的能力。更具體地，其可通過(guò)在IPEC-J2細(xì)胞中在37°C，5% C02，95%濕度下孵育2小時(shí)時(shí)測(cè)量對(duì)由PMA誘導(dǎo)的炎癥的抑制來(lái)確定。在RNA反轉(zhuǎn)錄后，使用針對(duì)豬IL-8和TNF- α (由SigmaAldrich 制備)的引物,在運(yùn)行7500Fast System vl.4.0Sequence Detect1n Software 1.4版的 7500Fast Real-time PCR 系統(tǒng)(Applied B1system)上進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR。
[0069]反應(yīng)混合物是:10μ1Power Sybergreen Master mix, 2.5 μ I 正向引物，2.5 μ I反向引物和5μ I cDNA，然后實(shí)時(shí)PCR根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的7500方案運(yùn)行(95°C，lOmin，I個(gè)循環(huán)。95°C，15sec，40 個(gè)循環(huán)。60°C，lmin，40 個(gè)循環(huán)。95°C，15sec，I 個(gè)循環(huán)。60°C，lmin，I 個(gè)循環(huán)。95°C，15sec，l個(gè)循環(huán)。60°C，15sec，I個(gè)循環(huán))。分析IL-8和TNF-α基因的表達(dá)并將其與“持家”基因β_肌動(dòng)蛋白的表達(dá)作比較。為了進(jìn)行比較，數(shù)值以IL-8/β-肌動(dòng)蛋白和TNF- α/β-肌動(dòng)蛋白的比例或倍數(shù)變化給出。該測(cè)定的更多細(xì)節(jié)在所附的實(shí)施例中給出。
[0070] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株的特征在于阻斷腸炎沙門(mén)氏菌附著或侵入IPEC細(xì)胞的能力。這可通過(guò)所附實(shí)施例中列出的測(cè)定來(lái)測(cè)量。具體地，在24孔板中培養(yǎng)單層IPEC-J2細(xì)胞至匯合后3天，在使用前24小時(shí)通過(guò)加入DTS培養(yǎng)基進(jìn)行同步化。將豬LAB(1ml)的過(guò)夜培養(yǎng)物離心，所述細(xì)菌重懸于磷酸鹽緩沖鹽水[PBS]。向所述孔加入LAB的小份(50 μ I)。平板在37°C、5% C02、95%濕度下孵育2小時(shí)。將腸炎沙門(mén)氏菌血清變型Enteritidis S1400 [腸炎沙門(mén)氏菌S1400]的過(guò)夜培養(yǎng)物繼代培養(yǎng)(1ml中0.5ml)至Luria Bertani (LB)培養(yǎng)基中，并在37°C有氧孵育2_3小時(shí)直至光密度(560nm)達(dá)到0.8 (等價(jià)于I X 108CFU/ml的濃度)。將所述培養(yǎng)物離心，所述細(xì)菌重懸于PBS。將小份(50 μ I) 加入到IPEC-J2細(xì)胞的孔。所述平板在37°C、5%C02、95%濕度下再孵育2小時(shí)。IPEC-J2細(xì)胞單層用HBSS洗滌。每孔加入含Triton-XlOO (10ml/L)的PBS溶液(0.5ml)，刮下所述單細(xì)胞層并使其分散。通過(guò)Miles和Misra法在XLD瓊脂平板上(在37°C孵育24小時(shí))估計(jì)活沙門(mén)氏菌。乳酸菌通過(guò)相同的步驟確定(在37°C厭氧孵育48小時(shí))。
[0071]優(yōu)選地，如通過(guò)上述測(cè)定所測(cè)量的，在腸炎沙門(mén)氏菌附著/侵入IPEC細(xì)胞的情況下，本發(fā)明的乳酸菌菌株展現(xiàn)出，對(duì)附著/侵入的0-20 %的抑制，更優(yōu)選對(duì)附著/侵入的20-40 %，甚至更優(yōu)選40-60 %，更優(yōu)選60-80 %，甚至更優(yōu)選80-100 %的抑制。
[0072]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株的特征在于阻斷大腸桿菌附著或侵入IPEC細(xì)胞的能力。這可以通過(guò)與上述用于腸炎沙門(mén)氏菌的測(cè)定類似且在所附的實(shí)施例中列出的測(cè)定來(lái)測(cè)量。
[0073]優(yōu)選地，如通過(guò)上述測(cè)定所測(cè)量的，在大腸桿菌K88附著/侵入IPEC細(xì)胞的情況下，本發(fā)明的乳酸菌菌株展現(xiàn)出，對(duì)附著/侵入的0-20 %的抑制，更優(yōu)選對(duì)附著/侵入的20-40 %，甚至更優(yōu)選40-60 %，更優(yōu)選60-80 %，甚至更優(yōu)選80-100 %的抑制。
[0074]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株的特征在于沒(méi)有對(duì)選自以下的一種或多種抗生素的抗生素抗性:氨芐西林；頭孢噻肟；氯霉素；紅霉素；艮他霉素；四環(huán)素；萬(wàn)古霉素；甲硝唑；萘啶酸；和卡那霉素。在本發(fā)明的上下文中，抗生素抗性可以通過(guò)，在置于厭氧培養(yǎng)罐并在37°C孵育24小時(shí)時(shí)測(cè)量各種含抗生素的圓片對(duì)所述乳酸菌菌株的MRS瓊脂平板培養(yǎng)物的效應(yīng)來(lái)確定。所述測(cè)定的更多細(xì)節(jié)在所附實(shí)施例中列出。更具體地，將豬LAB [0.5ml的1:100稀釋的過(guò)夜培養(yǎng)物]涂布在MRS瓊脂平板的表面上并干燥。將所述平板標(biāo)記分隔成四個(gè)象限，并在每個(gè)象限中放置含抗生素的圓片[氨芐西林，10 μ g。頭孢噻廂，30 μ g。氯霉素，10 μ g。紅霉素，15 μ g。艮他霉素，10 μ g?？敲顾?30 μ g。甲硝唑，50 μ g。萘啶酸,30 μ g。四環(huán)素,30 μ g。萬(wàn)古霉素,30 μ g]。將所述平板蓋上，置于厭氧培養(yǎng)罐中并在37°C孵育24小時(shí)。使用數(shù)字照相機(jī)給所述平板拍照。將圖像轉(zhuǎn)移到Photoshop，使用測(cè)量工具確定抑菌圈的直徑。對(duì)于每種抗生素，量取所述測(cè)試菌株的排斥面積(exclus1n area)，并將其除以用該抗生素所獲得的最大排斥面積。
[0075]優(yōu)選地，本發(fā)明的LAB的特征在于沒(méi)有對(duì)抗生素氨芐西林、頭孢噻肟、氯霉素、紅霉素、艮他霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、甲硝唑、萘啶酸和卡那霉素的抗性。更優(yōu)選地，本發(fā)明的LAB的特征在于沒(méi)有對(duì)抗生素氨芐西林、頭孢噻肟、氯霉素、紅霉素、艮他霉素、四環(huán)素和萬(wàn)古霉素的抗性。
[0076]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株的特征在于當(dāng)遭受三個(gè)循環(huán)的加熱時(shí)展現(xiàn)出熱穩(wěn)定性的能力，每個(gè)循環(huán)包括在70°C的溫度下加熱15分鐘的時(shí)間。熱穩(wěn)定性研究的更多細(xì)節(jié)在所附的實(shí)施例中列出。更具體地，在本發(fā)明的上下文中，熱穩(wěn)定性通過(guò)將分離的豬LAB的過(guò)夜培養(yǎng)物(1ml)離心并將片狀沉淀物重懸于新鮮的MRS肉湯培養(yǎng)基(1ml)中而測(cè)量。將小份(Iml)在70°C加熱15分鐘，然后在MRS瓊脂上鋪板(0.5ml)并在厭氧培養(yǎng)罐中在37°C孵育48小時(shí)。檢測(cè)到少量的菌落，將這些菌落挑出，接種到含MRS肉湯培養(yǎng)基的Hungate管中并在37°C孵育48小時(shí)。將該培養(yǎng)物離心,重懸于MRS肉湯培養(yǎng)基，在70°C再次加熱15分鐘，鋪板在MRS瓊脂上，在厭氧培養(yǎng)罐中在37°C孵育48小時(shí)，將菌落挑出并接種到含MRS肉湯培養(yǎng)基的Hungate管中并在37°C孵育48小時(shí)。將該培養(yǎng)物離心，重懸于MRS肉湯培養(yǎng)基，在70°C再次加熱15分鐘，鋪板(0.5ml)在MRS瓊脂上，在厭氧培養(yǎng)罐中在37°C孵育48小時(shí)，將菌落挑出并接種到含MRS肉湯培養(yǎng)基的Hungate管中并在37°C孵育48小時(shí)。
[0077]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株具有選自上文列出的(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)的任意兩種表征特征。
[0078]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株具有選自上文列出的(i)、(ii)、
(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)的任意三種表征特征。
[0079]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株具有選自上文列出的(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)的任意四種表征特征。
[0080]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株具有選自上文列出的(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)的任意五種表征特征。
[0081]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株具有選自上文列出的(i)、(ii)、
(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)的任意六種表征特征。
[0082]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株具有上文列出的全部七種特征:(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)。
[0083]在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，(A)，所述乳酸菌菌株的特征在于上述特征(i)和(ii)。
[0084]在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，(B)，所述乳酸菌菌株的特征在于上述特征(iv)和(V)。
[0085]在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，(C)，所述乳酸菌菌株的特征在于上述特征(iv)和(V)。
[0086]在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株的特征在于如下由(D)至(G)表示的特征:
[0087](D)⑴和(iv); 或
[0088](E)⑴和(V);或
[0089](F) (ii)和(iv);或
[0090](G) (ii)和(V)；
[0091]更優(yōu)選地，除了上述實(shí)施方案(A)至(G)任一項(xiàng)中列舉的那些特征以外，所述乳酸菌菌株的特征還在于特征(vi)。
[0092]甚至更優(yōu)選地，除了上述實(shí)施方案(A)至(G)任一項(xiàng)中列舉的那些特征以外，所述乳酸菌菌株的特征還在于特征(iii)。
[0093]甚至更優(yōu)選地，除了上述實(shí)施方案(A)至(G)任一項(xiàng)中列舉的那些特征以外，所述乳酸菌菌株的特征還在于特征(vii)。
[0094]生物保藏
[0095]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及從有機(jī)飼養(yǎng)的豬的糞便中分離的乳酸菌菌株并且所述乳酸菌菌株選自在2011年6月27日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款在英國(guó)蘇格蘭阿伯丁巴克斯本 Craibstone Estate 弗格森大廈，AB219YA(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, UK, AB219YA)的NCIMB Ltd的英國(guó)工業(yè)、食品和海洋細(xì)菌保藏中心(Nat1nal Collect1ns of Industrial, Food and Marine Bacteria(NCIMB))以如下登錄號(hào)保藏的菌株:
[0096]NCIMB41846:路氏乳桿菌 GGDK31 ；
[0097]NCIMB41847:植物 / 戍糖 / 類植物乳桿菌(Lactobacillus paraplantarum)GGDK161 ；
[0098]NCIMB41848:約氏 / 臺(tái)灣(Lactobacillus taiwanensis) / 嗜酸 / 加氏乳桿菌GGDK255 ；
[0099]NCIMB41849:植物 / 戍糖 / 瑞士 (Lactobacillus helveticus)/ 類植物乳桿菌GGDK258 ；
[0100]NCIMB41850:約氏乳桿菌 GGDK266。
[0101]上述保藏NCMB41846、NCIMB41847, NCIMB41848, NCIMB41849 和 NCMB41850，由阿伯丁 Greenburn路，AB219SB,阿伯丁大學(xué)Rowett營(yíng)養(yǎng)與健康研究所(Rowett Instituteof Nutrit1n and Health, University of Aberdeen)的 George Grant 博士代表 申請(qǐng)人:GT生物制劑有限公司，完成。
[0102]本 申請(qǐng)人:后續(xù)的研究表明，以NCIMB41847保藏的菌株是類植物乳桿菌和路氏乳桿菌的混合物。本 申請(qǐng)人:后續(xù)的研究表明，以NCMB41850保藏的菌株是約氏乳桿菌和路氏乳桿菌的混合物。本 申請(qǐng)人:后續(xù)的研究表明，以NCMB41848保藏的菌株是路氏乳桿菌。隨后保藏了菌株NCMB41847和NCMB41850各個(gè)組分的分離菌株(見(jiàn)下文)。
[0103]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及從有機(jī)飼養(yǎng)的豬的糞便中分離的乳酸菌菌株并且所述乳酸菌菌株選自在2012年7月11日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款在英國(guó)蘇格蘭阿伯丁巴克斯本 Craibstone Estate 弗格森大廈，AB219YA(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, UK, AB219YA)的NCIMB Ltd的英國(guó)家工業(yè)、食品和海洋細(xì)菌保藏中心(Nat1nal Collect1ns of Industrial, Food and Marine Bacteria(NCIMB))以如下登錄號(hào)保藏的菌株:
[0104]NCIMB42008 約氏乳桿菌；
[0105]NCMB42009 路氏乳桿菌；
[0106]NCMB42010 植物乳桿菌；
[0107]NCIMB42011 路氏乳桿菌；
[0108]NCMB42012路氏乳桿菌
[0109]上述保藏Ν(ΠΜΒ42008、Ν(ΠΜΒ42009、Ν(ΠΜΒ42010、Ν(ΠΜΒ42011 和 NCMB42012，由 GT生物制劑有限公司，c/olnstitute of Medical Sciences, University of Aberdeen, Foresterhill, Aberdeen, Aberdeensshire, AB252ZD, UK 的 Denise Kelly 教授代表 申請(qǐng)人: GT 生物制劑有限公司完成。
[0110]本發(fā)明還包括可從所述菌株獲得的突變株以及與選自以上述登錄號(hào)保藏的那些菌株的菌株有至少70%的DNA-DNA同源性和/或至少99.5%的16S RNA同一性的菌株。
[0111]本文使用的術(shù)語(yǔ)“ 16S rRNA同一性”是指與已知菌株的同一性百分?jǐn)?shù)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株與選自以上述登錄號(hào)保藏的那些菌株的菌株具有至少85%或至少90%，或至少95、96、97、98或99%的16S rRNA同一性。在一個(gè)高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株與選自以上述登錄號(hào)保藏的那些菌株的菌株具有至少99.5%的16SrRNA 同一f生。
[0112]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“DNA-DNA”同源性是指兩條或多條單獨(dú)的DNA鏈，基于其核苷酸序列，彼此之間緊密相關(guān)的程度。通常，這以其同一性％的方式測(cè)量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株與選自以上述登錄號(hào)保藏的那些菌株的菌株具有至少70%的DNA-DNA同源性，更優(yōu)選地，與選自以上述登錄號(hào)保藏的那些菌株的菌株具有至少80%，或至少85%，更優(yōu)選至少90、95、97、98或99%的同源性。
[0113]在一個(gè)高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述乳酸菌菌株與選自以上述登錄號(hào)保藏的那些菌株的菌株具有至少70%的DNA-DNA同源性和至少99.5%的16S rRNA同一性。
[0114]組合物
[0115]本發(fā)明的另一方面涉及一種包含一種或多種如上所述的乳酸菌菌株以及可藥用賦形劑、載體或稀釋劑的組合物。合適的賦形劑、稀釋劑、載體如下所述。
[0116]所述組合物可以是任何組合物，但優(yōu)選是口服、經(jīng)腸或經(jīng)直腸給予的組合物。例如，所述組合物可以是可食用的組合物?！翱墒秤玫摹币庵附?jīng)批準(zhǔn)用于人或動(dòng)物消費(fèi)的材料。
[0117]本發(fā)明的另一方面涉及一種包含如上所述的乳酸菌菌株的益生菌組合物。
[0118]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及多于兩種的如本文所述的乳酸菌菌株的結(jié)合物。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種結(jié)合物展現(xiàn)出協(xié)同作用，例如所述結(jié)合物是協(xié)同的，即，所產(chǎn)生的效應(yīng)強(qiáng)于所述結(jié)合物中各個(gè)乳酸菌組分產(chǎn)生的簡(jiǎn)單累積的效應(yīng)。
[0119]本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及二、三、四或五種不同乳酸菌的結(jié)合物，更優(yōu)選二、三或四種不同乳酸菌的結(jié)合物 ，更優(yōu)選二或三種不同乳酸菌的結(jié)合物。當(dāng)本發(fā)明涉及多于一種乳酸菌菌株的結(jié)合物時(shí)，所述結(jié)合物的各個(gè)組分可以以任意比例存在。
[0120]更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及兩種不同乳酸菌的結(jié)合物。優(yōu)選地，所述兩種不同的乳酸菌，按重量計(jì)，以1/99.9-99.9/1的比例存在，例如1/99-99/1或10/90-90/10,或20/80-80/20，或 30/70-70/30 等。
[0121]在一個(gè)高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述結(jié)合物是約氏乳桿菌和路氏乳桿菌的結(jié)合物。甚至更優(yōu)選地，所述結(jié)合物是如上所述的NCMB41850:約氏乳桿菌和路氏乳桿菌GGDK266。出人意料的是，這種特定的乳酸菌結(jié)合物意外地在早期斷奶的豬中產(chǎn)生了有益的體內(nèi)應(yīng)答(見(jiàn)實(shí)施例)。
[0122]在另一個(gè)高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述結(jié)合物是植物乳桿菌和路氏乳桿菌的結(jié)合物。甚至更優(yōu)選地，所述結(jié)合物是如上所述的NCMB41847:植物/戊糖/類植物乳桿菌和路氏乳桿菌GGDK161。
[0123]本文使用的術(shù)語(yǔ)“益生菌”意指對(duì)宿主的健康或健康幸福有有益效果的微生物細(xì)胞制劑或微生物細(xì)胞的組分。(Salminen S，Ouwehand A.Benno Y.et al〃Prob1tics:howshould they be defined"Trends Food Sc1.Technol.1999:10107-10)。
[0124]優(yōu)選地，所述益生菌組合物是可口服給予的組合物，其含有有代謝活性的(即活的)和/或凍干的，或不活的經(jīng)熱滅活的、輻照的或裂解的益生菌。所述益生菌組合物可含有其他成分。本發(fā)明的益生菌組合物可以口服給予，即為片劑、膠囊劑或粉劑的形式?；蛘撸景l(fā)明的益生菌組合物可以作為食品或營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品例如基于乳或乳清的發(fā)酵乳制品，或作為藥品口服給予。
[0125]合適的益生菌每日劑量是約IXlO3-約IX 111個(gè)菌落形成單位(CFU)，更優(yōu)選約I X 17-約 I X 110CFU,更優(yōu)選約 IXlO6 -約 I X 110CFUo
[0126]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物以相對(duì)于所述組合物的重量約IXlO6-約I X 1012CFU/g,優(yōu)選約I X 18 -約I X 1010CFU/g的量含有菌株和/或其細(xì)胞組分作為活性成分。舉例來(lái)說(shuō)，所述劑量可以是lg、3g、5g和10g。
[0127]通常,將益生菌任選地與至少一種合適的益生元(preb1tic)化合物結(jié)合。益生元常常是非消化性的碳水化合物例如寡糖或多糖，或不能在上消化道中被降解或吸收的糖醇。已知的益生元包括商業(yè)化的產(chǎn)品例如菊粉和反式低聚半乳糖。
[0128]優(yōu)選地，相對(duì)于組合物總重量，本發(fā)明的組合物包括的益生元的量為以重量計(jì)約1-約30%，優(yōu)選以重量計(jì)5-20%。優(yōu)選的碳水化合物選自低聚果糖(或F0S)、短鏈低聚果糖(fructo-oligosaccharlde)、菊粉、低聚異麥芽糖、果膠、低聚木糖(或XOS)、低聚殼聚糖(或COS)、β -葡聚糖、改性阿拉伯膠和抗性淀粉、聚葡萄糖、D-塔格糖、阿拉伯膠纖維、卡羅布膠、燕麥和柑橘纖維。尤其優(yōu)選的益生元是短鏈低聚果糖(為了簡(jiǎn)單起見(jiàn)，下文顯示為FOSs-c.c);所述FOSs-c.c.不是可消化的糖類，通常通過(guò)轉(zhuǎn)化甜菜糖獲得并且包括與三個(gè)葡萄糖分子鍵合的蔗糖分子。
[0129]乳酸菌的制備
[0130]本發(fā)明的另一方面涉及一種用于產(chǎn)生益生菌的方法，所述方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的乳酸菌菌株。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉適合用于培養(yǎng)本發(fā)明的菌株的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和條件。
[0131]本發(fā)明的另一方面涉及一種制備一種或多種本發(fā)明的菌株的方法，所述方法包括以下步驟:
[0132](i)從有機(jī)飼養(yǎng)的豬獲得糞便；
[0133](ii)冷凍所述糞便并使其在合適的稀釋劑中分散；
[0134](iii)任選在補(bǔ)充的豬初乳碳水化合物的存在下，將在步驟(ii)中獲得的分散的糞便施加到合適的瓊脂，并在厭氧條件下孵育；
[0135](V)選擇步驟(iv)期間形成的不同細(xì)菌菌落，任選在補(bǔ)充的豬初乳碳水化合物的存在下，接種到合適的肉湯培養(yǎng)基中；
[0136](vi)孵育在步驟(V)中獲得的接種的菌落。
[0137]合適的瓊脂包括例如MRS或LAMVAB瓊脂平板。然而,其他合適的瓊脂也可以使用并且它們對(duì)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟悉的。
[0138]合適的肉湯培養(yǎng)基包括例如MRS肉湯培養(yǎng)基。然而,其他合適的肉湯培養(yǎng)基也可以使用并且它們對(duì)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟悉的。
[0139]優(yōu)選地，步驟(iii)包括將所述瓊脂在約37°C的溫度孵育至少72小時(shí)。
[0140]優(yōu)選地，步驟(vi)包括將所接種的菌落在約37°C的溫度孵育至少48小時(shí)。
[0141]本發(fā)明的另一方面涉及一種獲得豬乳酸菌菌株的方法，所述方法包括從有機(jī)飼養(yǎng)的豬獲得糞便并從所述糞便提取一種或多種豬乳酸菌菌株。
[0142]優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟:
[0143](i)從有機(jī)飼養(yǎng)的豬獲得糞便；
[0144](ii)冷凍所述糞便并使其在合適的稀釋劑中分散；
[0145](iii)任選在補(bǔ)充的豬初乳碳水化合物的存在下，將在步驟(ii)中獲得的分散的糞便施加到合適的瓊脂，并在厭氧條件下孵育；
[0146] (V)選擇步驟(iv)期間形成的不同細(xì)菌菌落，任選在補(bǔ)充的豬初乳碳水化合物的存在下，接種到合適的肉湯培養(yǎng)基中；
[0147](vi)孵育在步驟(V)中獲得的接種的菌落。
[0148]本發(fā)明的另一方面涉及通過(guò)上述方法獲得或可獲得的豬乳酸菌菌株。
[0149]治療應(yīng)用
[0150]本發(fā)明的另一方面涉及如上所定義的一種或多種乳酸菌菌株用于醫(yī)藥。
[0151]本發(fā)明的另一方面涉及如上所定義的一種或多種乳酸菌菌株用于治療腸病癥。
[0152]本發(fā)明的另一方面涉及如上所定義的一種或多種乳酸菌菌株或組合物在制備用于治療腸病癥的藥物中的用途。
[0153]本文使用的術(shù)語(yǔ)“藥物”包括在人醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)中用于人和動(dòng)物的藥物。另外，本文使用的術(shù)語(yǔ)“藥物”意指提供治療和/或有益的效果的任何物質(zhì)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“藥物”不一定僅限于需要上市許可的物質(zhì)，還可包括可在化妝品、營(yíng)養(yǎng)制品、食物(包括例如食物(feed)和飲料)、益生菌培養(yǎng)物和天然藥物中使用的物質(zhì)。另外，本文使用的術(shù)語(yǔ)“藥物”包括被設(shè)計(jì)用于摻在動(dòng)物飼料例如家畜飼料和/或?qū)櫸锸称分械漠a(chǎn)品。
[0154]本發(fā)明的另一方面涉及一種治療受試者中的腸病癥的方法，所述方法包括給予所述受試者藥學(xué)有效量的如上所述的一種或多種乳酸菌菌株或藥物組合物或益生菌組合物。
[0155]優(yōu)選地，所述腸病癥選自腸易激綜合征(IBS)、炎性腸道病癥(IBD)、功能性消化不良、功能性便秘、功能性腹瀉(包括抗生素相關(guān)性腹瀉、旅行者腹瀉(traveller’ sdiarrhoea)和小兒腹瀉)、功能性腹痛、功能性胃氣脹、上腹痛綜合征、餐后不適綜合征、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、胃腸反流性疾病(GERD)、變態(tài)反應(yīng)、特應(yīng)性疾病例如特應(yīng)性皮炎、壞死性小腸結(jié)腸炎、其他感染以及其組合。
[0156]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腸病癥是IBS。IBS的精確病理生理學(xué)仍有待闡明。最近的研究記載了 IBS患者和腸感染相關(guān)疾病中的粘膜炎癥和腸道微生物群變化。
[0157]在一個(gè)高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述病癥是沙門(mén)氏菌病。沙門(mén)氏菌病是一種由多種沙門(mén)氏菌菌株引起的疾病，其特征在于發(fā)熱和腸病癥。
[0158]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種或多種如上所定義的乳酸菌菌株用于改善腸道微生物群。
[0159]本發(fā)明的另一方面涉及一種改善受試者中腸道微生物群的方法，所述方法包括給予所述受試者本發(fā)明的包含一種或多種乳酸菌菌株的組合物或藥物組合物或益生菌組合物。
[0160]本發(fā)明的乳酸菌菌株還可用于預(yù)防性應(yīng)用。在預(yù)防性應(yīng)用中，給予對(duì)具體疾病易感或有患上該疾病的風(fēng)險(xiǎn)的患者足以至少部分地降低患病風(fēng)險(xiǎn)的量的本發(fā)明的組合物。這種量被定義為“預(yù)防有效劑量”。精確量取決于多種患者特異性因素例如患者的健康狀況和體重。
[0161]本發(fā)明的乳酸菌菌株和益生菌組合物還可用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)品(例如用于豬營(yíng)養(yǎng)品)，尤其是在早期斷奶期和育肥期(growing fattening per1d)。預(yù)期所述益生菌會(huì)增強(qiáng)免疫功能，減少并預(yù)防感染性疾病，有益地改變微生物群組成，并改善動(dòng)物的生長(zhǎng)和表現(xiàn)，例如通過(guò)提高飼料轉(zhuǎn)化效率。術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”包括所有動(dòng)物，包括人。動(dòng)物的實(shí)例是非反芻類和反芻類。反芻類動(dòng)物包括例如綿羊、山羊和牛例如母牛，如肉牛和奶牛。在具體的實(shí)施方案中，所述動(dòng)物是非反芻類動(dòng)物。非反芻類動(dòng)物包括寵物，例如馬、貓和狗；單胃動(dòng)物例如豬(pig)或豬類(swine)(包括但不限于仔豬、生長(zhǎng)豬和母豬)；家禽例如火雞、鴨和雞(包括但不限于肉仔雞、產(chǎn)蛋雞)；魚(yú)(包括但不限于鮭魚(yú)、鱒魚(yú)、羅非魚(yú)、鯰魚(yú)和鯉魚(yú))；和甲殼類(包括但不限于河蝦和對(duì)蝦)。
[0162]飼料(Feedstuff)/產(chǎn)品
[0163]本發(fā)明的另一方面涉及含有一種或多種本發(fā)明的菌株的食品、飲食補(bǔ)充劑、營(yíng)養(yǎng)制品、營(yíng)養(yǎng)配方物、飲料和藥物。
[0164]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物另外包含至少一種其他種類的其他食品級(jí)細(xì)菌，其中所述食品級(jí)細(xì)菌優(yōu)選選自乳酸菌、雙歧桿菌、丙酸桿菌或其混合物。
[0165]本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包含一種或多種本發(fā)明的乳酸菌菌株的食品。術(shù)語(yǔ)“食品”意欲包括所有可以食用的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品可以是固體、凝膠狀的或液體。合適的食品可包括例如功能性食品、食品組合物、寵物食品、家禽飼料、保健食品、飼料等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述食品是保健食品。
[0166]本文使用的術(shù)語(yǔ)“功能性食品”意指不僅能夠提供營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)還能夠?yàn)槭秤谜咛峁┢渌幸嫘?yīng)的食品。因此，功能性食品是其中納入了可賦予食品特定功能(例如醫(yī)學(xué)或生理學(xué)益處)而不是純粹的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)的組分或成分(例如本文記載的那些)的普通食品。
[0167]可適用于本發(fā)明的具體食品的實(shí)例包括給基于乳的產(chǎn)品，即食點(diǎn)心、用例如乳或水復(fù)原的粉劑、巧克力乳飲料、麥芽飲料、即食食品、人用的速溶食品或飲料或者提供意欲用于寵物或家禽的全部或部分飲食的食物組合物。
[0168]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物是意欲用于人、寵物或家禽的食品。所述組合物可意欲用于選自狗、貓、豬、牛、馬、山羊、綿羊或家禽的動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物是意欲用于成年物種尤其是成人的食品。
[0169]在本發(fā)明中，“基于乳的產(chǎn)品”是指脂肪含量不同的任何基于液體或半固體乳或乳清的產(chǎn)品。所述基于乳的產(chǎn)品可以是例如牛乳、山羊乳、綿羊乳、脫脂乳、全脂乳、不經(jīng)任何加工從奶粉和乳清調(diào)配的乳或者加工產(chǎn)品，例如酸乳酪、凝固乳(curdled milk)、凝乳、酸乳、全脂酸乳、酪乳和其他酸乳制品。另一個(gè)重要的類別包括乳飲料，例如乳清飲料、發(fā)酵乳、煉乳、嬰兒或?qū)殞毴椋徽{(diào)味乳、冰激淋；含乳食品例如糖果。
[0170]本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包含一種或多種本發(fā)明的菌株的飼料或動(dòng)物飼料。
[0171]飼料可以是食品添加劑、飼料預(yù)混物或動(dòng)物飼料。本發(fā)明的飼料的的具體實(shí)例包括如下:動(dòng)物飼料添加劑，其包含(a)本發(fā)明的豬乳酸菌(b)至少一種脂溶性維生素(C)至少一種水溶性維生素(d)至少一種微量礦物質(zhì)和/或至少一種大量礦物質(zhì)；動(dòng)物飼料組合物，其包含本發(fā)明的豬乳酸菌，粗蛋白質(zhì)含量為50_88g/kg飼料。所謂的預(yù)混物是本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑的實(shí)例。預(yù)混物優(yōu)選是指一種或多種微量成分與稀釋劑和/或載體的均勻混合物。預(yù)混物用于幫助微量成分在較大混合物中均勻分散。
[0172]此外，任選的飼料添加劑成分是著色劑例如類胡蘿卜素(例如β_胡蘿卜素)、蝦青素和葉黃素；芳香化合物；穩(wěn)定劑；抗微生物肽；多不飽和脂肪酸；產(chǎn)生活性氧的物質(zhì)；和/或至少一種選自以下的酶:植酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26);木聚糖酶(EC3.2.1.8);半乳聚糖酶(EC3.2.1.89) ; α -半乳糖苷酶(EC3.2.1.22);蛋白酶(EC3.4.)、磷脂酶 A1(EC3.1.1.32);磷脂酶 A2 (EC3.1.1.4);溶血磷脂酶(EC3.1.1.5);磷脂酶C(EC3.1.4.3);磷脂酶D(EC3.1.4.4);淀粉酶例如α -淀粉酶(EC3.2.1.1);和/或β葡聚糖酶(EC3.2.1.4 或 EC3.2.1.6)。
[0173]多不飽和脂肪酸的實(shí)例是C18、C20和C22多不飽和脂肪酸，例如花生四烯酸、二十二碳六烯酸(docosohexaenoic acid)、二十碳五烯酸和Y-亞油酸。
[0174]產(chǎn)生活性氧的物質(zhì)的實(shí)例是化學(xué)品例如過(guò)硼酸鹽、過(guò)硫酸鹽或過(guò)碳酸鹽；和酶例如氧化酶、加氧酶或合成酶(syntethase)。
[0175]通常，脂溶性和水溶性維生素，以及微量礦物質(zhì)可形成所謂的意欲添加到所述飼料中的預(yù)混物的一部分，而大量礦物質(zhì)通常單獨(dú)地添加到所述飼料中。當(dāng)富含本發(fā)明的豬乳酸菌時(shí)，這些組合物類型中的任一種都是本發(fā)明范圍內(nèi)的動(dòng)物飼料添加劑。
[0176]這些組分的實(shí)例的非排他性列表如下:脂溶性維生素的實(shí)例是維生素A、維生素D3、維生素E和維生素K例如維生素K3。水溶性維生素的實(shí)例是維生素B12、生物素和膽堿、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、葉酸和泛酸鹽(panthothenate)例如Ca-D-泛酸鹽。微量礦物質(zhì)的實(shí)例是錳、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。大量礦物質(zhì)的實(shí)例是鈣、磷、鈉。
[0177]這些組分的營(yíng)養(yǎng)需要量(用家禽和仔豬/豬舉例)列于WOO1/58275的表A中。營(yíng)養(yǎng)需要量意指這些組分應(yīng)在飲食中以指示的濃度提供。
[0178]或者，本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑包含至少一種在W001/58275表A中指定的單獨(dú)組分。至少一種意指任一種、一種或多種、一種、或兩種、或三種、或四種依次類推直至所有13種，或直至所有15種單獨(dú)組分。更具體地，該至少一種單獨(dú)組分以這樣的量被包含在本發(fā)明的添加劑中，使得提供WOO1/58275表A的第4列、第5列或第6列所示的范圍之內(nèi)的飼料中的濃度(in-feed concentrat1n)。
[0179]動(dòng)物飼料組合物或飲食通常具有相對(duì)高的蛋白質(zhì)含量。家禽和豬的飲食可以如WOO1/58275表B第2-3列所示進(jìn)行表征。魚(yú)類飲食可以如該表B的第4列所示進(jìn)行表征。另外這種魚(yú)類飲食通常具有200 - 310g/kg的粗脂肪含量。W001/58275對(duì)應(yīng)于US09/779334，其以引用的方式納入本文。
[0180]本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物通常具有50 - 800g/kg的粗蛋白含量，還包含本文記載和/或要求保護(hù)的本發(fā)明的豬乳酸菌。
[0181]并且，或者作為(上述粗蛋白含量的)替代，本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物可具有10-30MJ/kg的可代謝能量含量；和/或0.l-200g/kg的鈣含量；和/或0.l_200g/kg的有效磷含量；和/或0.l-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.l-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的賴氨酸含量。
[0182]在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述可代謝能量、粗蛋白、鈣、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或賴氨酸的含量在W001/58275表B的范圍2、3、4或5 (R.2_5)的任一范圍內(nèi)。粗蛋白是用氮(N)乘以因數(shù)6.25來(lái)計(jì)算的，即，粗蛋白(g/kg) = N(g/kg) X6.25。氮含量是用凱氏(Kjeldahl)方法(A.0.A.C., 1984, OfficialMethods of Analysis 第
14IK, Associat1n of Official Analytical Chemists, Washington DC)來(lái)石角定的?？纱x能量可以根據(jù)下列文獻(xiàn)來(lái)計(jì)算:NRC publicat1n Nutrient requirements inswine, 1988 年第九次修訂版，subcommittee on swinenutrit1n, committee on animalnutrit1n, board of agriculture, nat1nal research council.Nat1nal AcademyPress, Washington, D.C.，pp.2-6 ;和 European Table of Energy Values for PoultryFeed-stuffs,Spelderholt centre for poultry research and extens1n, 7361DABeekbergen, The Netherlands.Grafisch bedrijf Ponsen&looijen bv,ffageningen.1SBN90-71463-12-5。
[0183]鈣、有效磷和氨基酸在完全動(dòng)物飲食中的飲食含量根據(jù)例如VeevoedertabeI1997,gegevens over chemische samenstelling， verteerbaarheid envoederwaarde van voedermiddelen, Central VeevoederbureaujRunderweg6, 8219pkLelystad.1SBN90-72839-13-7 等飼料表來(lái)計(jì)算。
[0184]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物含有至少一種植物蛋白或蛋白源。其還可含有動(dòng)物蛋白例如肉骨粉(Meat and Bone Meal)和/或魚(yú)粉(Fish Meal)，通常其量為0-25%。本文使用的術(shù)語(yǔ)植物蛋白是指包含至少一種衍生自或源自植物的蛋白(包括修飾蛋白和蛋白衍生物)的任何化合物、組合物、制劑或混合物。在某些尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物蛋白的蛋白含量為至少10、20、30、40、50或60% (w/w) 0
[0185]植物蛋白可以衍生自植物蛋白源，例如豆類和谷物，例如來(lái)自豆科(Fabaceae (Leguminosae))、十字花科(Cruciferaceae)、黎科(Chenopodiaceae)和禾本科(Poaceae)植物的物質(zhì),如大豆粉(soy bean meal)、羽扇豆粉(lupin meal)和油菜粉(rapeseed meal)。在具體實(shí)施方案中，植物蛋白源是來(lái)自豆科的一種或多種植物例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆(bean)的材料。植物蛋白源的其他實(shí)例是油菜籽、向日葵籽、棉籽和甘藍(lán)。植物蛋白源的其他實(shí)例是谷物，例如大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米(maize/corn)、水稻、黑小麥和高粱。
[0186]動(dòng)物飲食可以例如制成粉狀飼料(非顆粒狀的)或顆粒飼料。通常，將磨碎的飼料原料混合，并根據(jù)所述物種所用的規(guī)范加入足夠量的必需維生素和礦物質(zhì)。本發(fā)明的豬乳酸菌可以作為固體或液體制劑加入。
[0187]本發(fā)明的組合物可以是食品補(bǔ)充劑或可以添加到食品補(bǔ)充劑中，所述食品補(bǔ)充劑在本文中還稱為飲食補(bǔ)充劑或食品添加劑。因此，本發(fā)明的另一方面涉及包含一種或多種本發(fā)明的菌株的飲食補(bǔ)充劑或食品添加劑。
[0188]本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及如上所述的飼料用于改善動(dòng)物生長(zhǎng)表現(xiàn)的用途，所述動(dòng)物生長(zhǎng)表現(xiàn)通過(guò)每日體重增加和/或飼料轉(zhuǎn)化率測(cè)量。
[0189]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在動(dòng)物飼料中使用包含一種或多種本發(fā)明的豬乳酸菌的飼料以改善每日體重增加、改善飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)和/或調(diào)節(jié)消化道微生物群的方法。
[0190] 在替代的優(yōu)選實(shí)施方案中，包含一種或多種本發(fā)明的豬乳酸菌的飼料可改善動(dòng)物飼料消化吸收率，并且/或者通過(guò)幫助適當(dāng)消化而保持動(dòng)物健康，并且/或者支持免疫系統(tǒng)功能。
[0191]FCR可根據(jù)仔豬生長(zhǎng)試驗(yàn)確定，所述仔豬生長(zhǎng)試驗(yàn)包括將其中包含本發(fā)明的豬乳酸菌的飼料以合適的濃度(每kg飼料)添加到動(dòng)物飼料中的第一處理和不向動(dòng)物飼料添加本發(fā)明的豬乳酸菌的第二處理(對(duì)照)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)飼料轉(zhuǎn)化率或FCR與術(shù)語(yǔ)飼料轉(zhuǎn)化率(feed convers1n)同義。FCR被計(jì)算為相對(duì)于體重增加(以g/動(dòng)物表示)的飼料攝入量(以g/動(dòng)物表示)。如通常所知的，改善的FCR比對(duì)照FCR低。在具體實(shí)施方案中，與對(duì)照相比，F(xiàn)CR改善(即，減少)了至少1.0%，優(yōu)選至少1.5%、1.6%、1.7%、1.8%U.9%,2.0%,2.1%,2.2%,2.3%,2.4%或至少 2.5%。
[0192]本文中使用的術(shù)語(yǔ)“消化道(gut)”是指胃腸道或消化管(還稱為消化通道(alimentary canal)),其是指在多細(xì)胞動(dòng)物中攝取食物、消化食物從而吸取能量和營(yíng)養(yǎng)素并排出殘余廢物的器官系統(tǒng)。
[0193]本文使用的術(shù)語(yǔ)消化道“微生物群”是指駐留在消化道中并通過(guò)幫助適當(dāng)?shù)南?或支持免疫系統(tǒng)功能來(lái)保持健康的天然微生物培養(yǎng)物。
[0194]本文使用的與消化道微生物群相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”通常意指變化、操縱、改變或調(diào)整健康且機(jī)能正常的動(dòng)物的機(jī)能或其狀態(tài)，即非治療使用。
[0195]稀釋劑、賦形劑和載體
[0196]如上文所提及的，本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的乳酸菌菌株的組合物，更優(yōu)選藥物組合物。本發(fā)明的乳酸菌菌株通常在與藥用載體、賦形劑或稀釋劑的混合物中給予，尤其是用于人治療。所述藥物組合物可以在人醫(yī)學(xué)或是獸醫(yī)學(xué)中用于人或動(dòng)物使用。
[0197]對(duì)于本文記載的多種不同形式的藥物組合物而言，這種合適的賦形劑的實(shí)例可以在A Wade和PJ Weller編輯的“Handbook of Pharmaceutical Excipients,第2版，(1994)中找到。
[0198]用于治療用途的可接受的載體或稀釋劑在制藥領(lǐng)域是熟知的，記載于例如 Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing C0.(A.R.Gennaroedit.1985)。
[0199]合適的載體的實(shí)例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露醇、山梨醇等。合適的稀釋劑的實(shí)例包括乙醇、甘油和水。
[0200]可根據(jù)預(yù)定給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)實(shí)踐選擇藥用載體、賦形劑或稀釋劑。藥物組合物可包括作為或除所述載體、賦形劑或稀釋劑之外的任何合適的一種或多種粘合劑、一種或多種潤(rùn)滑劑、一種或多種懸浮劑、一種或多種包衣劑、一種或多種增溶劑。
[0201]合適的粘合劑的實(shí)例包括淀粉、明膠、天然糖如葡萄糖、無(wú)水乳糖、自由流動(dòng)乳糖、β -乳糖、玉米甜味劑、天然和合成膠如阿拉伯膠、黃蓍膠或海藻酸鈉、羧甲基纖維素和聚乙二醇。
[0202]合適的潤(rùn)滑劑的實(shí)例包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。
[0203]在藥物組合物中可提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和甚至調(diào)味劑。防腐劑的實(shí)例包括苯甲酸鈉、山梨酸和對(duì)羥基苯甲酸的酯。還可使用抗氧化劑和懸浮劑。
[0204]給藥
[0205]本發(fā)明的組合物可適于口服、直腸、陰道、腸胃外、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、支氣管內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻、口腔或舌下給藥途徑。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物適于口服、直腸、陰道、腸胃外、鼻、口腔或舌下給藥途徑。
[0206]對(duì)于口服給藥，特別是使用壓制片劑、丸劑、片劑、凝膠劑(gellule)、滴劑和膠囊劑。
[0207]其他給藥形式包括溶液或乳液，它們可通過(guò)靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射，并由無(wú)菌或可滅菌溶液制備。本發(fā)明的藥物組合物還可為栓劑、陰道栓劑、混懸劑、乳劑、洗劑、軟膏劑、乳膏劑、凝膠劑、噴霧劑、溶液或撲粉劑的形式。
[0208]經(jīng)皮給藥的替代方式是通過(guò)使用皮膚貼片。例如，可將有效成分納入到由聚乙二醇水性乳液或液體石蠟組成的乳膏劑內(nèi)。還可以將乳酸菌菌株納入到由白蠟或白色軟石蠟基質(zhì)與可能需要的穩(wěn)定劑和防腐劑共同組成的軟膏劑內(nèi)。
[0209]組合物可被配制成單位劑型，即形式是包含單位劑量的離散部分或者單位劑量的多重單位或亞單位。
[0210]劑量
[0211]本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員不用過(guò)度實(shí)驗(yàn)就可容易地確定一種速溶組合物的適宜劑量以給予受試者。通常，醫(yī)師會(huì)確定對(duì)個(gè)體患者最適合的實(shí)際劑量，其取決于多種因素，包括所使用的具體菌株的活性、該菌株的新陳代謝穩(wěn)定性和作用長(zhǎng)短、年齡、體重、平常健康狀況、性別、飲食、給藥方式和時(shí)間、排泄速度、藥物組合、具體病癥的嚴(yán)重程度和個(gè)體正進(jìn)行的治療。本文公開(kāi)的劑量是一般情況的示例。當(dāng)然也可有使用更高或更低劑量范圍的個(gè)別情況，這都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0212]人或動(dòng)物中通常有效的每日劑量是約I X 13-約I X 1011，更優(yōu)選約IXlO7-約I X 111，甚至更優(yōu)選約 IXlO6-約 I X 110CFU0
[0213]組合
[0214]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物以任意組合給予，例如兩種或多種所述乳酸菌可以任何組合或比例給予。
[0215]在另一尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與一種或多種其他活性劑組合給予。在這樣的情況中，本發(fā)明的組合物可以與所述一種或多種其他活性劑連續(xù)、同時(shí)或相繼給予。
[0216]菌株的分離和表征
[0217]從有機(jī)飼養(yǎng)的豬的糞便分離的LAB菌株(挑選了總共436個(gè)單獨(dú)的菌落)主要是路氏乳桿菌、約氏乳桿菌、加氏乳桿菌、戊糖乳桿菌菌株，還有少量的植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、陰道乳桿菌，和一株粘膜乳桿菌，以及若干未培養(yǎng)的菌株。
[0218]大多數(shù)所述LAB產(chǎn)生可在體外抑制腸炎沙門(mén)氏菌和/或大腸桿菌K88生長(zhǎng)的物質(zhì)。這些抗病原體效應(yīng)的效能在個(gè)體菌株之間大不相同。
[0219]根據(jù)在體外確定的抗微生物效能選擇了一些菌株。對(duì)這些細(xì)菌在體外阻斷病原體附著/侵入豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC)的能力和其對(duì)抗生素的敏感性進(jìn)行進(jìn)一步篩選。
[0220]對(duì)一些菌株的底物范圍和特異性以及其在體外抑制IPEC細(xì)胞中的炎癥的能力進(jìn)行測(cè)定。從這些菌株中鑒定出十四種具有有利特性的LAB(5種約氏乳桿菌、6種路氏乳桿菌和3種植物乳桿菌)。將這些菌株中的兩種[GGDK266和GGDK31]大量制備，用于在新斷奶的仔豬中進(jìn)行體內(nèi)評(píng)估。在這組14種LAB中存在其他可能重要的候選者。
[0221]當(dāng)進(jìn)行冷凍干燥并將干燥的LAB保存在脫脂奶粉中時(shí)，生存力的少量損失是明顯的。脫脂奶粉與單糖結(jié)合會(huì)稍微好一些，但是難以保持。將GGDK266和GGDK31的大量制備物冷凍干燥并保存在該介質(zhì)中。
[0222]獲得了五種熱條件下的LAB培養(yǎng)物。然而，三種菌株的體外生物特性和益生菌潛能受到熱處理的不利影響。雖然如此，所述細(xì)菌中的兩種仍保留了天然未加熱處理形式的生物特性。
[0223]使小鼠口服豬LAB (路氏乳桿菌或粘膜乳桿菌)的處理極大地降低了急性(C57B1/6小鼠)和慢性((C3H/HeN小鼠)形式的沙門(mén)氏菌病中腸炎沙門(mén)氏菌的致病性。
[0224]所述數(shù)據(jù)表明，來(lái)自有機(jī)飼養(yǎng)的豬的LAB有相當(dāng)?shù)臐摿ψ鳛樾虑矣行ЯΦ囊嫔膩?lái)源。
[0225]本 申請(qǐng)人:進(jìn)行的研究包括從有機(jī)飼養(yǎng)的豬分離大量的LAB和通過(guò)在體外和體內(nèi)評(píng)估其生物效能和作用方式篩選有效力的益生性LAB菌株。
[0226]更具體地，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以建立源自有機(jī)飼養(yǎng)的豬的糞便的LAB的培養(yǎng)物。對(duì)所述LAB菌株在體外對(duì)多種病原體的抗微生物活性進(jìn)行了篩選。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定所述LAB菌株在體外是否可阻斷病原體附著到豬上皮細(xì)胞上。還進(jìn)行研究以評(píng)估LAB在體外阻斷豬上皮細(xì)胞中的炎癥應(yīng)答的能力。選擇在體外展示出良好的生物活性譜的菌株并大量培養(yǎng)用于體內(nèi)大規(guī)模研究。
[0227]實(shí)驗(yàn)技術(shù)的更多細(xì)節(jié)記載于所附的實(shí)施例部分。簡(jiǎn)言之，使用選擇性微生物培養(yǎng)基從豬糞便分離LAB菌株并培養(yǎng)。分離單獨(dú)的菌落并分析16S rRNA基因序列以使得能夠?qū)赀M(jìn)行基因型鑒定。在測(cè)量附著、抗細(xì)菌和抗炎活性、抗生素敏感性和最終的熱穩(wěn)定性之后進(jìn)一步確定潛在益生菌的表型特征。使用孔擴(kuò)散測(cè)定評(píng)估了衍生自LAB的條件培養(yǎng)基的抗細(xì)菌活性，以確定對(duì)腸道病原體腸炎沙門(mén)氏菌和大腸桿菌K88的殺死活性。還評(píng)估了LAB菌株阻斷或干擾腸炎沙門(mén)氏菌和大腸桿菌K88附著/侵入豬上皮細(xì)胞(IPEC)的能力，以及LAB菌株抑制由12-氧-十四烷酰戟二萜醇-13-乙酸酯[PMA]誘導(dǎo)的IPEC細(xì)胞中的炎癥的能力。另外，還確定了 LAB菌株的代謝特性(API CH50試劑盒)和其對(duì)抗生素的敏感性。建立了基于對(duì)LAB的生物特性進(jìn)行評(píng)分的分級(jí)系統(tǒng)，所述分級(jí)系統(tǒng)用于選擇候選LAB菌株，用于體內(nèi)益生菌評(píng)估。
[0228]上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的更多細(xì)節(jié)記載于所附的實(shí)施例中。
[0229]從有機(jī)飼養(yǎng)的豬的糞便分離的LAB(挑選了 436個(gè)單獨(dú)的菌落)主要是約氏乳桿菌或約氏乳桿菌相關(guān)的菌株以及路氏乳桿菌或路氏乳桿菌相關(guān)的菌株，以及少量的植物乳桿菌相關(guān)的菌株和未培養(yǎng)的菌株。這表示比其他人的報(bào)道(Martin et al, 2009 ；Yunet al,2009 ； Liihtei?en et al, 2010 ；Yao et al，2011)更窄的豬相關(guān) LAB 的范圍。然而，與常規(guī)/集中飼養(yǎng)的豬相比，室外有機(jī)飼養(yǎng)的豬具有高水平的LAB和更發(fā)達(dá)的腸免疫功能(Mulder et al, 2009) 0本發(fā)明的細(xì)菌數(shù)據(jù)表明，約氏乳桿菌和路氏乳桿菌菌株在幼豬消化道和免疫系統(tǒng)的恰當(dāng)發(fā)育中尤其重要。另外，包含衍生自有機(jī)飼養(yǎng)的豬的消化道或糞便的其他乳酸菌，尤其是德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)和食淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorous),可增強(qiáng)路氏乳桿菌、植物乳桿菌和約氏乳桿菌的免疫穩(wěn)態(tài)特性。
[0230]在孔擴(kuò)散測(cè)定中所有分離的豬LAB產(chǎn)生可殺死腸炎沙門(mén)氏菌或干擾其生長(zhǎng)并且殺死大部分大腸桿菌K88或抑制其生長(zhǎng)的物質(zhì)。在個(gè)體菌落之間抗微生物活性的效能大不相同，不論其是否是路氏乳桿菌、約氏乳桿菌或植物乳桿菌。各LAB的抗沙門(mén)氏菌和抗大腸桿菌K88效能之間沒(méi)有普遍相關(guān)性。已知，LAB可產(chǎn)生一系列的活性因子，包括有機(jī)酸、小的抗微生物化合物和抗細(xì)菌肽(Cintas et al, 2001) 0由來(lái)自有機(jī)飼養(yǎng)的豬的LAB產(chǎn)生的這些抗微生物物質(zhì)的性質(zhì)尚未確定。
[0231]測(cè)試了基于抗病原體活性選擇的三十三種豬LAB菌株阻斷腸炎沙門(mén)氏菌和大腸桿菌K88附著/侵入IPEC細(xì)胞的能力。它們都能夠顯著地減少沙門(mén)氏菌附著/侵入IPEC細(xì)胞。大多數(shù)還可阻斷大腸桿菌K88。就病原體殺死而言，在所述LAB阻斷沙門(mén)氏菌和大腸桿菌K88的能力之間沒(méi)有普遍相關(guān)性。不希望囿于理論，現(xiàn)認(rèn)為L(zhǎng)AB可通過(guò)占據(jù)單層細(xì)胞上的結(jié)合位點(diǎn)或通過(guò)產(chǎn)生可干擾病原體附著到上皮細(xì)胞上(例如阻斷表面粘附素的結(jié)合位點(diǎn))的因子，來(lái)限制所述病原體接觸上皮細(xì)胞層(Ljungh and Wadstrom, 2006 ；Blandinoet al, 2008 ；ffilliams, 2010)。
[0232]豬LAB還可阻斷或抑制IPEC細(xì)胞中由PMA觸發(fā)的炎性基因(白細(xì)胞介素_8:1L-8)表達(dá)。各個(gè)培養(yǎng)物影響炎癥的能力大不相同，但是五種菌株(RINH瓶編號(hào)29、30、31、86和266)具有強(qiáng)的抗炎特性。已知，一些LAB菌株具有免疫調(diào)節(jié)或抗炎特性(Cotter etal, 2005 ；Blandino et al, 2008 ；0hashi and Ushidaj2009 ；Elmadfa et al, 2010 ；Liu etal, 2010)。所涉及的機(jī)制仍然不清楚，但是很可能涉及通過(guò)所述LAB產(chǎn)生的生物活性因子來(lái)調(diào)節(jié)分子信號(hào)傳遞系統(tǒng)。
[0233]抗生素抗性是越來(lái)越嚴(yán)重的問(wèn)題，并且可通過(guò)基因轉(zhuǎn)移在細(xì)菌間傳播(Korhonenet al, 2007 ；Gousia et al，2011 ;Nicolau，2011)。理想的是，候選益生菌應(yīng)幾乎沒(méi)有或沒(méi)有對(duì)抗生素的抗性，以使抗性基因轉(zhuǎn)移至宿主菌群的風(fēng)險(xiǎn)最小。對(duì)豬LAB(33種菌株)針對(duì)10種單獨(dú)抗生素的抗性進(jìn)行了篩選。一種菌株(RINH瓶編號(hào)266)對(duì)所有測(cè)試的抗生素敏感。大部分對(duì)氨芐西林、頭孢噻肟、氯霉素、紅霉素、艮他霉素、四環(huán)素和萬(wàn)古霉素敏感。然而，大部分展現(xiàn)出對(duì)甲硝唑、萘啶酸的抗性以及對(duì)卡那霉素的較小程度的抗性。在這些LAB分離株中這種相對(duì)低的抗生素抗性發(fā)生率可能與源仔豬飼養(yǎng)的環(huán)境[有機(jī)室外飼養(yǎng)]有關(guān)(Mulder et al, 2009)。
[0234]如所預(yù)期的那樣，當(dāng)使用API CH50試劑盒進(jìn)行測(cè)定時(shí)，約氏乳桿菌、路氏乳桿菌和植物乳桿菌展現(xiàn)出菌株特異性的一般底物反應(yīng)譜。然而，大多數(shù)基因型菌株的底物反應(yīng)性展現(xiàn)出細(xì)微差異。這表明它們是屬于所述基因型的獨(dú)特個(gè)體菌株。
[0235]基于其體外生物活性，經(jīng)鑒定14種LAB [4種植物乳桿菌相關(guān)菌株，3種約氏乳桿菌相關(guān)菌株和I種路氏乳桿菌]有潛力用于體內(nèi)測(cè)試。大量制備這些LAB菌株中的兩種[GGDK266和GGDK31]。有趣的是，所述14種LAB中的7種(RINH瓶編號(hào)85、86、131、230、255,266)已從補(bǔ)充有來(lái)自豬初乳的碳水化合物級(jí)分的LAB選擇性瓊脂中分離出來(lái)。LAB的生長(zhǎng)和生物活性譜部分地取決于其在其中生長(zhǎng)的碳水化合物底物(Gopal et al, 2001 ；Tzortzis et al, 2004)。本發(fā)明的數(shù)據(jù)可表明所述LAB中的一些是宿主適應(yīng)性的并且需要某些豬相關(guān)碳水化合物用于最佳生長(zhǎng)或生物活性。
[0236]如果所述LAB可以經(jīng)受住冷凍干燥以使它們作為益生菌可被處理或加工，那么這是有利的。然而，在進(jìn)行冷凍和干燥的過(guò)程中，它們的生存力可極大地降低(Tomaset al, 2009 ；Strasser et al, 2009 ；Reddy et al, 2009)。常常單獨(dú)地或結(jié)合單糖使用脫脂奶粉，作為冷凍保護(hù)劑以保持所述細(xì)菌的生存力(Tomas et al, 2009 ；Strasser etal，2009)。在本發(fā)明的研究中，將豬LAB干燥并僅保存在脫脂奶粉中時(shí)，生存力的少量損失是明顯的。蔗糖或乳糖結(jié)合脫脂奶粉的保護(hù)性略好一些。然而，所述產(chǎn)品是易潮濕的并且難以保存或處理。因此，決定將豬LAB干燥并保存在脫脂奶粉中。
[0237]用于動(dòng)物的補(bǔ)充飼料常常作為丸粒給予，所述丸粒的產(chǎn)生涉及高溫(De Angeliset al, 2006)。因此，要加入動(dòng)物飼料的LAB應(yīng)該具有很大程度的熱穩(wěn)定性，以使加工期間生存力的損失最小。在本發(fā)明的研究中，使五種LAB經(jīng)受三次在70°C持續(xù)15分鐘的加熱。在第三次加熱處理后回收的所述細(xì)菌全部都是活的并且在大多數(shù)情況下，所述細(xì)菌以類似于所述細(xì)菌的天然形式的速率生長(zhǎng)。所述細(xì)菌中的兩種保留了天然的未加熱處理形式的生物特性。然而，所述加熱處理的菌株中的一種喪失了在體外阻斷病原體附著至上皮細(xì)胞上的能力，而另一種的阻斷活性大大減小。還有一種菌株不能在體外阻斷上皮細(xì)胞中PMA誘導(dǎo)的炎癥，雖然其天然形式是強(qiáng)的炎癥抑制劑。因此，加熱處理可差別化地影響個(gè)體LAB的生物活性。當(dāng)考慮將LAB包括在壓成丸粒的動(dòng)物飼料中時(shí)，需要將此納入到考量之中。
[0238] 實(shí)驗(yàn)證明，如果用衍生自有機(jī)飼養(yǎng)的豬的LAB共處理小鼠，那么腸炎沙門(mén)氏菌的致病性被減弱。RINH瓶編號(hào)323 (粘膜乳桿菌)大大降低了急性(C57B1/6小鼠)和慢性(C3H/Hen小鼠)沙門(mén)氏菌病中腸炎沙門(mén)氏菌侵入、傳播到全身性組織并在其中增殖的能力。此外，RINH瓶編號(hào)31 [GGDK31] ,RINH瓶編號(hào)32、RINH瓶編號(hào)46或RINH瓶編號(hào)47 (均為路氏乳桿菌)在C3H/HeN小鼠中減少了腸炎沙門(mén)氏菌的大腸定殖、侵入和全身性擴(kuò)散以及增殖。總之，RINH瓶編號(hào)31 [GGDK31]和RINH瓶編號(hào)32在該沙門(mén)氏菌病慢性模型中最有效。這些LAB有潛力作為新的益生菌，以在體內(nèi)改善消化道健康并增加對(duì)感染的抵抗力。
[0239]由沙門(mén)氏菌引起的感染是多因素過(guò)程(Naughton and Grant, 2005)。腸炎沙門(mén)氏菌在整個(gè)胃腸道定殖，移動(dòng)穿過(guò)粘液層并附著到粘膜上。大腸充當(dāng)所述病原體的容器，但侵入主要經(jīng)M細(xì)胞進(jìn)行,所述M細(xì)胞存在于回腸的派伊爾淋巴集結(jié)(Peyer’ s patches)。大多數(shù)侵入的沙門(mén)氏菌傳播到腸系膜淋巴結(jié)，然后出來(lái)傳播至肝和脾(Naughton andGrant, 2005)。不希望囿于理論,現(xiàn)認(rèn)為L(zhǎng)AB可在感染的多個(gè)階段阻斷沙門(mén)氏菌(Cintas etal, 2001 ；Cotter et al, 2005 ；0hashi and Ushida, 2009)。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)素、殺死病原體或阻斷附著位點(diǎn)，LAB可限制所述大腸容器中沙門(mén)氏菌的數(shù)量。LAB還可以以與本文中用IPEC-J2細(xì)胞和用Caco-2細(xì)胞(Neeser et al, 2000)所觀察到的方式類似的方式防止附著到回腸粘膜細(xì)胞上，從而限制侵入?；蛘撸琇AB可直接調(diào)節(jié)對(duì)感染的宿主應(yīng)答，尤其是抑制炎癥。通過(guò)限制消化道損傷和保留屏障完整性(Smith et al, 2008 ；Schreiber et al, 2009),大大地降低了沙門(mén)氏菌侵入和傳播的能力。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0240]本發(fā)明通過(guò)非限制性實(shí)施例并參考以下非限制性附圖進(jìn)一步描述，其中:
[0241]圖1示出了來(lái)自乳酸菌的條件培養(yǎng)基的抗細(xì)菌活性測(cè)定。
[0242]圖2a和b示出了從有機(jī)飼養(yǎng)的豬的糞便培養(yǎng)的所有個(gè)體LAB的條件培養(yǎng)基對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌S1400的抑制活性(以孔擴(kuò)散測(cè)定中的抑制面積表示)。
[0243]圖3a和b示出了從有機(jī)飼養(yǎng)的豬的糞便培養(yǎng)的所有個(gè)體LAB的條件培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌K88的抑制活性(以孔擴(kuò)散測(cè)定中的抑制面積表示)。
[0244]圖3c和d示出了從有機(jī)飼養(yǎng)的豬的糞便培養(yǎng)的所有個(gè)體LAB的條件培養(yǎng)基的抑制活性(以孔擴(kuò)散測(cè)定中的抑制的面積表示)。
[0245]圖4a、b、c示出了從有機(jī)飼養(yǎng)的豬的糞便培養(yǎng)的LAB對(duì)(a)腸炎沙門(mén)氏菌S1400，和(b)大腸桿菌K88粘附到培養(yǎng)物中的IPEC細(xì)胞的抑制；(c)對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌S1400和(b)大腸桿菌K88的抑制的比較。
[0246]圖5示出了使用以確定量的抗生素浸透的圓片進(jìn)行的乳酸菌抗生素敏感性測(cè)定。
[0247]圖6示出了使用API CH50試劑盒進(jìn)行的對(duì)LAB底物譜的評(píng)估[49種底物，淡色表示陽(yáng)性反應(yīng)，除了 25中陽(yáng)性反應(yīng)是黑色以外，深色表示沒(méi)有反應(yīng)]。
[0248]圖7示出了用PMA和豬LAB處理的IPEC細(xì)胞中IL-8基因表達(dá)的Λ Ct (a)，比例(b)和倍數(shù)變化(C)。
[0249]圖8示出了在脫脂奶粉SKP，(100g/l)、SKP+乳糖(均為100g/l)、SKP+蔗糖(均為100g/l)或SKP(200g/l)中冷凍干燥之后豬LAB的穩(wěn)定性。
[0250]圖9示出了分離的LAB對(duì)熱處理的穩(wěn)定性(a)，在用PMA和天然的或加熱處理的豬LAB處理的IPEC細(xì)胞中IL-8基因表達(dá)的比例(b)和倍數(shù)變化(c) ； (d)天然的和熱處理的RINH瓶編號(hào)31的抗生素敏感性。
[0251]圖10示出了進(jìn)行C3H/HeN小鼠研究的方案，以在體內(nèi)評(píng)估瓶編號(hào)323(粘膜乳桿菌)抗沙門(mén)氏菌感染的效能。
[0252]圖lla-c示出了在已用或未用323 (粘膜乳桿菌，LM)共處理的C3H/HeN小鼠中在感染后第10天腸炎沙門(mén)氏菌S1400在組織中的分布。
[0253]圖12a_b示出了已用或未用瓶編號(hào)323 (粘膜乳桿菌)共處理的C3H/HeN小鼠在感染后第10天的脾重(mg/100g Bff)和腸(回腸)髓過(guò)氧化物酶(μ g)。
[0254]圖13示出了進(jìn)行C57B1/6小鼠研究的方案，以在體內(nèi)評(píng)估瓶編號(hào)323 (粘膜乳桿菌)抗急性沙門(mén)氏菌感染的效能。
[0255]圖14a_c示出了在已用或未用RINH瓶編號(hào)323共處理的C57B1/6小鼠中在感染后第6天腸炎沙門(mén)氏菌S1400在組織中的分布。
[0256]圖15示出了已用或未用瓶編號(hào)323 (粘膜乳桿菌)共處理的C57B1/6小鼠在感染后第6天的脾重(mg/100g Bff) ο
[0257]圖16示出了進(jìn)行C3H/HeN小鼠研究的方案，以在體內(nèi)評(píng)估從有機(jī)飼養(yǎng)豬的糞便選出的LAB抗沙門(mén)氏菌感染的效能。
[0258]圖17a和b示出了已用或未用選擇的LAB共處理的C3H/HeN小鼠在感染后第7_8天的糞便中腸炎沙門(mén)氏菌的排泄。
[0259]圖18a_b示出了已用或未用選擇的LAB共處理的C3H/HeN小鼠在感染后第10天回腸(a)、盲腸(b)和結(jié)腸(c)中腸炎沙門(mén)氏菌的分布(LoglOCFU/g)。
[0260]圖19a_c示出了已用或未用選擇的LAB共處理的C3H/HeN小鼠在感染后第10天腸系膜淋巴結(jié)(a)、肝(b)和脾(c)中腸炎沙門(mén)氏菌的分布(LoglOCFU/g)。
[0261]圖20示出了喂食GGDK266和GGDK31的豬與對(duì)照在第0_7、7_14和0_14天的表現(xiàn)(日體重增加，DWG,以g/天表示)。
[0262]圖21示出了使用變性凝膠梯度電泳(DGGE，試驗(yàn)I)進(jìn)行的微生物多樣性分析。使用通用引物進(jìn)行的DGGE表明在所述處理和安慰劑之間總微生物多樣性沒(méi)有差異。通過(guò)銀染色法使凝膠上的帶可見(jiàn)。
[0263]圖22示出了使用DGGE進(jìn)行的微生物多樣性分析。使用乳酸菌(LAB)特異性引物進(jìn)行的DGGE表明在盲腸和回腸樣品中在用GGDK266和安慰劑進(jìn)行的處理之間有LAB多樣性的顯著差異。通過(guò)銀染色法使凝膠上的帶可見(jiàn)。
[0264]圖23示出了使用DGGE進(jìn)行的微生物多樣性分析。使用乳酸菌(LAB)特異性引物進(jìn)行的DGGE表明在回腸樣品中在用GGDK266和安慰劑進(jìn)行的處理之間有LAB多樣性的顯著差異。通過(guò)銀染色法使凝膠上的帶可見(jiàn)。
[0265]圖24示出了使用DGGE進(jìn)行的微生物多樣性分析。使用乳酸菌(LAB)特異性引物進(jìn)行的DGGE表明在盲腸樣品中在用GGDK266和安慰劑進(jìn)行的處理之間有LAB多樣性的顯著差異。通過(guò)銀染色法使凝膠上的帶可見(jiàn)。
[0266]圖25示出了口服給予GGDK266顯著下調(diào)的基因本體論生物學(xué)過(guò)程。
[0267]圖26示出了在用GGDK266處理的動(dòng)物與用安慰劑處理的動(dòng)物中免疫應(yīng)答和對(duì)刺激的應(yīng)答的變化(基因的百分?jǐn)?shù)與一系列不同的GO注釋)。
[0268]圖27示出了口服給予GGDK266顯著富集的基因本體論生物學(xué)過(guò)程。
[0269]實(shí)施例
[0270]材料和方法
[0271]材料:這些研究使用了在室外和室內(nèi)飼養(yǎng)的豬的研究過(guò)程中收集的豬糞便樣品(Mulder et al, 2009) 0培養(yǎng)物保藏主要基于從冷凍樣品411、412和416收集的LAB，所述冷凍樣品411、412和416來(lái)自其糞便中LAB水平尤其高的室外飼養(yǎng)豬。
[0272]MRS肉湯培養(yǎng)基預(yù)混物、瓊脂和萬(wàn)古霉素、厭氧菌氣體組件(gas pack)和指示器以及抗生素圓片購(gòu)自O(shè)xoid,厭氧菌催化劑購(gòu)自Fisher Scientific,半胱氨酸-HCL、溴甲酹綠和脫脂奶粉購(gòu)自Sigma-Aldrich。豬初乳碳水化合物級(jí)分作為D.Kelly的SMART163計(jì)劃的一部分制備。DNA提取試劑盒購(gòu)自MP B1medicals, PCR試劑和提純?cè)噭┖?clean-upkit)購(gòu)自 Promega。API CH50 試劑盒購(gòu)自 B1merieux UK Ltd。
[0273]標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基:MRS肉湯培養(yǎng)基和MRS瓊脂根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)制備。LAMVAB瓊脂根據(jù)Jackson et al.(2002)的方法制備。瓊脂平板在使用前立即制備。在厭氧條件下將MRS肉湯培養(yǎng)基慢慢倒入(1ml/管)至無(wú)菌的Hungate管中并在室溫下保存。
[0274]補(bǔ)充碳水化合物的培養(yǎng)基:將豬初乳的SMART163硫酸銨沉淀物(在0、20、25、30、35、45、50、55或65%飽和度下沉淀或在65%飽和度下可溶)與從15ml或50ml初乳中回收的量成比例地稱出。將碳水化合物級(jí)分各自分散在15ml的MRS或LAMVAB瓊脂中，維持在45°C，然后向各個(gè)平板倒入每種級(jí)分。還將它們分散在MRS肉湯培養(yǎng)基(50ml)中，所述補(bǔ)充的肉湯培養(yǎng)基在厭氧條件下被慢慢倒入到8根(6ml/管)無(wú)菌Hungate管中。
[0275]動(dòng)物:雌性C3H/HeN和C57 B1/6小鼠(5_6周齡)購(gòu)自Harlan UK。將它們?cè)谥糜?級(jí)防范設(shè)施中的HEPA-過(guò)濾的fIexifilm隔離器內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)籠子(caging)中成組或成對(duì)飼養(yǎng)。它們一直自由獲得高質(zhì)量的嚙齒動(dòng)物食物和無(wú)菌去離子水，并且容許它們?cè)陂_(kāi)始實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)新環(huán)境 7_10 天。根據(jù) UK Animals (Scientific Procedures) Actl986, RowettInstitute of Nutrit1n and Health (RINH)獲得了許可。本文的研究由持有 Home OfficePersonal Licence的職員在經(jīng)批準(zhǔn)的Home Office Project Licence的支持下進(jìn)行(如UK Animals (Scientific Procedures) Actl986 中所定義和列出的)，并且由 RINH EthicalReview Committee 審查和批準(zhǔn)。
[0276]方法
[0277]LAB的培養(yǎng):在最初的研究中，將少量的冷凍糞便(10mg)分散在Iml的最大恢復(fù)稀釋劑(MRD)中。制備了兩種進(jìn)一步連續(xù)10倍的稀釋液。將所有三種懸浮物在MRS或LAMVAB瓊脂平板上劃線。在之后的研究中，將所述糞便樣品分散在5ml的MRD中，進(jìn)一步在MRD中稀釋(1:40)，將該稀釋液的0.5ml涂布在含或不含補(bǔ)充的豬初乳碳水化合物的MRS或LAMVAB瓊脂平板的表面上。在所有情況中，將所述平板在厭氧培養(yǎng)罐中在37°C孵育72小時(shí)。從所述瓊脂平板挑出不同的菌落(至少8個(gè)/平板)并將其接種到含有MRS肉湯培養(yǎng)基的Hungate管中或含有豬初乳碳水化合物的合適MRS肉湯培養(yǎng)基的Hungate管中。將所述管在37°C孵育48小時(shí)。
[0278]冷凍原種:將每種培養(yǎng)物的小份(0.7ml)用無(wú)菌注射器和針頭吸出并加至塑料管中，所述塑料管用CO2吹洗，含有0.3ml甘油和2mg L-半胱氨酸。將所述管用塑料塞子密封、標(biāo)記、混合內(nèi)容物、冷凍并保存在_80°C。
[0279]條件培養(yǎng)基:將剩余的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至Corningl5ml離心管中，在室溫、100g下離心5分鐘，慢慢倒出上清液，分裝并冷凍。將片狀沉淀物立即提取用于16S rRNA基因分析或冷凍。
[0280]16S rRNA 基因分析(Clarridge, 2004):使用FastDN'A暴 Spin kit for Soil結(jié)合Fastprepl20珠磨(bead beater)系統(tǒng)根據(jù)所述試劑盒提供的方案提取細(xì)菌DNA。進(jìn)行 PCR (反應(yīng)混合物:緩沖液，10 μ I。dNTP(2mM)，5y I。27F 引物(20pmol/μ I)，2 μ I。1492R 引物(20pmol/yl)。2 μ I Go Taq Flexi 聚合酶，0.5 μ I。MgC12，5 μ 1.Η20，23.5 μ I 和 2 μ I 提取的 DNA)，使用 MJ Research PTC-200Peltier Thermal Cycler 運(yùn)行35個(gè)循環(huán):95°C持續(xù)3分鐘，95°C持續(xù)30秒，57°C持續(xù)30秒和72°C持續(xù)2分鐘。引物:27F (FOl) AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ； 1492R (RP2) ACGGCTACCTTGTTACGACTT。PCR 產(chǎn)物提純使用Wizard? SV Gel和PCR Clean-up試劑盒(Promega)根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)完成。對(duì)16SPCR產(chǎn)物使用基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的全自動(dòng)基因分析儀(Genomics Sect1n, RINH, UoA)，使用反向引物和正向引物519R和926F進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)使用BLAST (http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將序列與已知細(xì)菌DNA序列進(jìn)行比較來(lái)鑒定菌株。
[0281]抗微生物活性:XLD瓊脂按照制造商的說(shuō)明書(shū)制備并冷卻至45°C。將腸炎沙門(mén)氏菌S1400加入至所述XLD瓊脂(在200mlXLD瓊脂中加入1ml的1:1000稀釋的沙門(mén)氏菌過(guò)夜培養(yǎng)物，以得到相當(dāng)于106CFU/ml的濃度)。將所述瓊脂倒入培養(yǎng)皿中并使其凝固。將所述平板標(biāo)記分隔成四個(gè)象限，并在每個(gè)象限中切出約5mm的孔。向所述孔加入條件培養(yǎng)基或MRS肉湯培養(yǎng)基的小份(60 μ I)。蓋上所述平板并將其在37°C孵育16小時(shí)。使用數(shù)字照相機(jī)給它們拍照。將圖像轉(zhuǎn)移到Photoshop，使用測(cè)量工具確定所述孔和抑菌圈的直徑。計(jì)算數(shù)值并將其存儲(chǔ)于Excel電子表格。除了使用MacConkey No3瓊脂以外,對(duì)大腸桿菌K88進(jìn)行相同的操作。
[0282]抗生素敏感性:將豬LAB[0.5ml的1:100稀釋的過(guò)夜培養(yǎng)物]涂布在MRS瓊脂[90mm]平板的表面上并干燥。將所述平板標(biāo)記分隔成四個(gè)象限，并在每個(gè)象限中放置含抗生素的圓片[氨卡西林，10 μ g。頭孢噻I虧,30 μ g。氯霉素，10 μ g。紅霉素，15 μ g。艮他霉素，10 μ g?？敲顾?30 μ g。甲硝唑,50 μ g。萘啶酸,30 μ g。四環(huán)素,30 μ g。萬(wàn)古霉素，30 μ g]。將所述平板蓋上，置于厭氧培養(yǎng)罐中并在37°C孵育24小時(shí)。使用數(shù)字照相機(jī)給所述平板拍照。將圖像轉(zhuǎn)移到Photoshop，使用測(cè)量工具確定抑菌圈的直徑。計(jì)算數(shù)值并將其存儲(chǔ)于Excel電子表格。
[0283]在體外防止沙門(mén)氏菌的附著/侵入:在24孔板中培養(yǎng)單層IPEC-J2細(xì)胞至匯合后3天，在使用前24小時(shí)加入DTS培養(yǎng)基進(jìn)行同步化。將豬LAB的過(guò)夜培養(yǎng)物(1ml)離心[在室溫下100gX 5分鐘]，將所述細(xì)菌重懸于Iml磷酸鹽緩沖鹽水[PBS]。向所述孔加入LAB的小份(50 μ I)。將平板在37°C、5% C02、95%濕度下孵育2小時(shí)。將腸炎沙門(mén)氏菌血清變型Enteritidis S1400 [腸炎沙門(mén)氏菌S1400]的過(guò)夜培養(yǎng)物繼代培養(yǎng)(1ml中0.5ml)至Luria Bertani (LB)培養(yǎng)基中，并在37°C有氧孵育2_3小時(shí)直至光密度(560nm)達(dá)到0.8。這給出了等價(jià)于lX108CFU/ml的濃度。將所述培養(yǎng)物離心[在室溫下100gX 5分鐘]，所述細(xì)菌重懸于10ml PBS0向IPEC-J2細(xì)胞的孔加入小份(50 μ I)。以用PBS處理的孔作為對(duì)照。將所述平板在37°C、5% C02、95%濕度下再孵育2小時(shí)。IPEC-J2細(xì)胞單層用HBSS洗滌5次。每孔加入含Triton-XlOO (10ml/L)的PBS溶液(0.5ml)，刮下所述單細(xì)胞層并使其分散。通過(guò)Miles and Misra法[Robertson et al, 2003]在XLD瓊脂平板上(在37°C孵育24小時(shí))估計(jì)活沙門(mén)氏菌。LAB通過(guò)所述相同的方法確定(在37°C厭氧孵育48小時(shí))。
[0284]抑制炎癥應(yīng)答:在24孔板中培養(yǎng)單層IPEC-J2細(xì)胞至匯合后3天，在使用前24小時(shí)通過(guò)加入DTS培養(yǎng)基進(jìn)行同步化。將豬LAB的過(guò)夜培養(yǎng)物(1ml)離心[在室溫下100gX 5分鐘]，所述細(xì)菌重懸于Iml的PBS。向每個(gè)孔[每個(gè)樣品3個(gè)孔]加入LAB的小份(50 μ I)和每孔220ng的12-氧-十四烷酰戟二萜醇_13_乙酸酯[PMA]。僅PMA或PBS作為對(duì)照。將所述平板在37°C、5% C02、95%濕度下孵育2小時(shí)。從所述培養(yǎng)皿除去培養(yǎng)基，并將所述細(xì)胞用PBS洗滌2次。向每個(gè)孔加入含巰基乙醇的RLT緩沖液(0.5ml)，將所述細(xì)胞刮下并轉(zhuǎn)移至eppendorf管[將從3個(gè)孔刮下的每個(gè)樣品合并]。RNA提取使用IRNfiiSiV必Mini試劑盒根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄用高容量cDNA ReverseTranscript1n Kit (Applied B1systems)進(jìn)行。實(shí)時(shí) PCR 在運(yùn)行 7500Fast Systemvl.4.0Sequence Detect1n Softwarel.4 版的 7500Fast Real-time PCR 系統(tǒng)(AppliedB1system)上進(jìn)行。用于豬 IL-8 和 TNF-α 的引物[IPEC-J2，SY100604186-096IL-8-2 反向，SY100604186-090TNFla 反向，SY100604186-095IL-82 正向，SY100604186_089TNFal 正向，和 SY100604186-093]由 Sigma Aldrich 制備。反應(yīng)混合物是:10 μ I Power SybergreenMaster mix，2.5 μ I正向引物，2.5 μ I反向引物和5 μ I cDNA，然后實(shí)時(shí)PCR根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的7500 方案運(yùn)行(95°C，10min，l 個(gè)循環(huán)。95°C，15sec，40 個(gè)循環(huán)。60°C，lmin，40 個(gè)循環(huán)。95°C，15sec，l 個(gè)循環(huán)。60°C，lmin，I 個(gè)循環(huán)。95°C，15sec，I 個(gè)循環(huán)。60°C，15sec，I 個(gè)循環(huán))。分析IL-8和TNF-α基因的表達(dá)并將其與“持家”基因β -肌動(dòng)蛋白的表達(dá)作比較。為了進(jìn)行比較，數(shù)值以IL-8/ β -肌動(dòng)蛋白和TNF- a / β -肌動(dòng)蛋白的比例或倍數(shù)變化給出。
[0285]例如:
[0286]a.計(jì)算 IL- 8 的 Δ Ct (2h) [Ct IL-8 減去 Ct β -肌動(dòng)蛋白]
[0287]b.計(jì)算 PMA 的 Λ Ct (2h) [Ct PMA 減去 Ct β -肌動(dòng)蛋白]
[0288]c.將 ACt(IL-8)除以 Δ Ct (PMA)
[0289]d.將數(shù)值向上取整
[0290]底物反應(yīng)性:使用API CH試劑盒(B1merieux UK Ltd)確定個(gè)體LAB的碳水化合物反應(yīng)性。測(cè)定根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，在37°C孵育24小時(shí)和48小時(shí)后記錄反應(yīng)。在API CH50平板上有50個(gè)小囊(capule)。這些小囊含有各種可能的底物和陰性對(duì)照。底物的范圍如下:單糖16種、單糖/醇4種、二糖8種、三糖2種、多糖3種、醇6種、其他7種。對(duì)于每個(gè)底物組，計(jì)數(shù)陽(yáng)性反應(yīng)的數(shù)量。將該數(shù)量除以可能的最大值以給出該底物組的排名。對(duì)所述細(xì)菌而言，所有底物得分的總和給出了總排名。高排名指示了廣譜的底物反應(yīng)性。
[0291]LAB的熱處理:將少量的冷凍糞便(10mg)分散在5ml的最大恢復(fù)稀釋劑(MRD)中。使沉積物沉降并將上層倒入印pendorf管中(lml/管)。將所述管在50°C、60°C或70°C加熱10分鐘。將各小份(0.4ml)鋪在MRS瓊脂上，并在厭氧培養(yǎng)罐中在37°C孵育72小時(shí)。在70°C加熱后檢測(cè)到少量的菌落。將不同的菌落挑出，接種到含MRS肉湯培養(yǎng)基的Hungate管中并在37°C孵育48小時(shí)。
[0292]在第二個(gè)研究中，將少量的冷凍糞便(10mg)分散在5ml的最大恢復(fù)稀釋劑(MRD)中。使沉積物沉降并將上層倒入印pendorf管中(lml/管)。將所述管在50°C加熱持續(xù)20分鐘、在50°C持續(xù)20分鐘加60°C持續(xù)20分鐘或者在50°C持續(xù)20分鐘加60°C持續(xù)20分鐘加70°C持續(xù)20分鐘。將各小份(0.5ml)鋪在MRS瓊脂上，并在厭氧培養(yǎng)罐中在37°C孵育48小時(shí)。檢測(cè)到少量的菌落，并將其挑出，接種到含MRS肉湯培養(yǎng)基的Hungate管中并在37°C孵育48小時(shí)。
[0293]在第三次研究中，將分離的豬LAB的過(guò)夜培養(yǎng)物(1ml)離心(在室溫下100gX 5分鐘)，片狀沉淀物重懸于新鮮的MRS肉湯培養(yǎng)基(1ml)。將小份(Iml)在70°C加熱15分鐘，然后鋪在MRS瓊脂上(0.5ml)并在厭氧培養(yǎng)罐中在37°C孵育48小時(shí)。檢測(cè)到少量的菌落，并將其挑出，接種到含MRS肉湯培養(yǎng)基的Hungate管中并在37°C孵育48小時(shí)。將該培養(yǎng)物離心，重懸于MRS肉湯培養(yǎng)基，在70°C再次加熱15分鐘，鋪在MRS瓊脂上，在厭氧培養(yǎng)罐中在37°C孵育48小時(shí)，將菌落挑出，接種到含MRS肉湯培養(yǎng)基的Hungate管中并在37°C孵育48小時(shí)。同先前一樣，將該培養(yǎng)物離心，重懸于MRS肉湯培養(yǎng)基,在70°C再加熱15分鐘，鋪在MRS瓊脂上(0.5ml)，在厭氧培養(yǎng)罐中在37°C孵育48小時(shí)，將菌落挑出，接種到含MRS肉湯培養(yǎng)基的Hungate管中并在37°C孵育48小時(shí)。
[0294]冷凍干燥的細(xì)菌的穩(wěn)定性:將LAB的過(guò)夜培養(yǎng)物離心(在室溫下100gX 5分鐘)。片狀沉淀物重懸于2ml無(wú)菌PBS中并再次離心。然后，將隨后的片狀沉淀物重懸于5ml冷凍溶液中[脫脂的脫脂奶粉(SKP)，100g/l ;SKP+乳糖，均為100g/l ;SKP+蔗糖，均為10g/I ;*SKP，200g/l]。將所述樣品在_20°C冷凍(2-3小時(shí))，然后在-80°C過(guò)夜保存。將它們冷凍干燥48小時(shí)并將干燥的材料保存在室溫下。在完成冷凍干燥后第O和約第40天和約第80天測(cè)定所述樣品中活細(xì)菌。將它們鋪在MRS瓊脂上并在37°C厭氧孵育48小時(shí)。
[0295]GGDK31和GGDK266的大量制備:在500ml玻璃螺旋蓋瓶中制備兩個(gè)500ml批次的MRS肉湯培養(yǎng)基，將其高壓滅菌(autclaved)并使其冷卻至室溫(接近氣火焰)同時(shí)用CO2吹洗。將4ml的GGDK31或GGDK266的24小時(shí)培養(yǎng)物加入到每個(gè)含MRS的瓶子中并輕輕地蓋上蓋。將所述瓶子置于厭氧培養(yǎng)罐中并在37°C孵育24小時(shí)。將所述培養(yǎng)物在6個(gè)無(wú)菌50ml離心管中離心[在室溫下100gX 5min]。丟棄上清液，用培養(yǎng)物再次填滿管并再次離心直至回收所有的細(xì)菌。所述6個(gè)管各自含有幾乎相等量的細(xì)菌。將每個(gè)管中的細(xì)菌重懸于40ml無(wú)菌PBS中，再次離心并丟棄上清液。將每個(gè)管中的細(xì)菌重懸于20ml的SKM(100g/1)，在-20°C冷凍(2-3小時(shí))，然后在-80°C過(guò)夜，冷凍干燥48-72小時(shí)，在4°C保存。為了評(píng)估所述樣品中活細(xì)菌，將一管凍干材料重懸于20ml MRS肉湯培養(yǎng)基中，在室溫孵育2小時(shí)，稀釋，鋪在MRS瓊脂上并在37°C厭氧孵育48小時(shí)。
[0296]粘膜乳桿菌體內(nèi)研究1:在第-7、-4、-2和O天給予16只出周齡)雌性C3H/HeN小鼠瓶編號(hào)323的過(guò)夜培養(yǎng)物(粘膜乳桿菌；50μ I ;>109CFU)，此后每日給予直至第+9天。給予另外16只小鼠(對(duì)照)培養(yǎng)基。在第O天，通過(guò)強(qiáng)飼法給予8只小鼠(粘膜乳桿菌處理的)和8只對(duì)照小鼠單次劑量的腸炎沙門(mén)氏菌S1400(50y I 108CFU)。另外，給予8只小鼠(粘膜乳桿菌處理的)和8只對(duì)照小鼠單次劑量的培養(yǎng)基。在沙門(mén)氏菌感染后每日兩次監(jiān)測(cè)體重和健康得分。在沙門(mén)氏菌感染后第10天對(duì)所述小鼠實(shí)施安樂(lè)死(過(guò)量異氟烷和驅(qū)血法)并解剖。在接近微生物學(xué)無(wú)菌條件下收集胃、空腸和回腸的代表性部分、盲腸加內(nèi)容物、結(jié)腸加內(nèi)容物、脾和肝和一個(gè)腎以及腸系膜淋巴結(jié)。將上段空腸、中段空腸、回腸、盲腸以及上行結(jié)腸和下行結(jié)腸的代表性部分置于中性緩沖福爾馬林或RNA-1ater中并保存用于以后的分析。
[0297] 粘膜乳桿菌體內(nèi)研究2:在第-7、-4、-2和O天給予5只(6周齡)雌性C57B1/6小鼠瓶編號(hào)323的過(guò)夜培養(yǎng)物(粘膜乳桿菌；50μ I ;>109CFU)，此后每日給予直至第+5天。給予另外5只小鼠培養(yǎng)基。在第O天，通過(guò)強(qiáng)飼法給予所有10只小鼠單次劑量的腸炎沙門(mén)氏菌S1400(50l.! I 107CFU)。在第6天，根據(jù)用于研究I的方法，對(duì)所述小鼠實(shí)施安樂(lè)死并解剖。
[0298]體內(nèi)新的豬LAB:給予4只(6周齡)雌性C3H/HeN小鼠RINH瓶編號(hào)31的過(guò)夜培養(yǎng)物(路氏乳桿菌；50 μ I ；>109CFU)，四只被給予RINH瓶編號(hào)32 (路氏乳桿菌)的培養(yǎng)物。四只被給予瓶編號(hào)323 (粘膜乳桿菌)的培養(yǎng)物，4只被給予RINH瓶編號(hào)46 (路氏乳桿菌)的培養(yǎng)物，4只被給予RINH瓶編號(hào)47 (路氏乳桿菌)的培養(yǎng)物，8只被給予MRS。這在第-6、-4、-2和O天完成，并在此后每日給予直至第+9天。在第O天，通過(guò)強(qiáng)飼法給予所有經(jīng)乳桿菌處理的小鼠和4只對(duì)照小鼠單次劑量的沙門(mén)氏菌S1400(50y I 108CFU)。另外，給予剩余4只對(duì)照小鼠單次劑量的培養(yǎng)基。在第10天，根據(jù)用于研究I的方法，對(duì)所述小鼠實(shí)施安樂(lè)死并解剖。
[0299]微生物學(xué):使用Janke-Kunkel Ultra-Turrax T25組織勻衆(zhòng)器在20000rpm下將組織在MRD中[l:100w/v]均質(zhì)化，持續(xù)30秒，空腸和回腸內(nèi)容物也是如此。將最初的勻漿連續(xù)稀釋(I: 10v/v)最高達(dá)8次，鋪在XLD瓊脂和MacConkey N0.3瓊脂上，并在37°C過(guò)夜孵育。同先前一樣評(píng)估活計(jì)數(shù)[Robertson et al, 2003]。
[0300]統(tǒng)計(jì)分析:在合適時(shí)通過(guò)與處理結(jié)果有關(guān)的單因素方差分析(ANOVA)來(lái)初步評(píng)估數(shù)據(jù)。如果ANOVA表明在所有組之間有顯著差異(p〈0.05)，那么隨后根據(jù)需要通過(guò)Tukey-Kramer多重比較檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis多重比較檢驗(yàn)分析所述數(shù)據(jù)。這使用Instat Statistical Package (GraphPad Software Inc., San Diego, USA)進(jìn)行。
[0301]基于來(lái)自所述多重比較檢驗(yàn)的輸出信息，表或圖中的均值用上標(biāo)字母標(biāo)記。給彼此顯著不同的均值(p〈0.05)分配了不同的上標(biāo)字母。給彼此沒(méi)有顯著不同的均值分配了常見(jiàn)的上標(biāo)字母。
[0302]結(jié)果
[0303]1.LAB 的分離
[0304]將來(lái)自有機(jī)飼養(yǎng)豬的糞便在選擇性瓊脂上鋪板并在厭氧條件下孵育。從所有研究中，挑出總計(jì)436個(gè)單獨(dú)的乳酸菌[LAB]菌落，接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中并在厭氧條件下孵育。給予每種培養(yǎng)物獨(dú)特的RINH瓶編號(hào)，將小份冷凍在含30%甘油和L-半胱氨酸(約2mg/ml)的MRS培養(yǎng)基中并在_80°C保存。進(jìn)行16S rRNA基因分析，通過(guò)與已知細(xì)菌DNA序列進(jìn)行比較來(lái)鑒定菌株(表1)。
[0305]培養(yǎng)的LAB菌落大多數(shù)是約氏乳桿菌和約氏乳桿菌相關(guān)菌株[約氏乳桿菌、約氏/加氏乳桿菌、約氏/臺(tái)灣乳桿菌](240/436)和路氏乳桿菌或路氏乳桿菌相關(guān)菌株[路氏乳桿菌、路氏/橋(Lactobacillus pontis)乳桿菌、路氏/陰道乳桿菌、路氏/嗜酸乳桿菌(169/436)]。有7種植物/戊糖乳桿菌菌落，19種其他種和5種未培養(yǎng)的菌株。
[0306]2.體外抗沙門(mén)氏菌活性
[0307]使用孔擴(kuò)散測(cè)定篩選來(lái)自分離的LAB的條件培養(yǎng)基對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌S1400的抗細(xì)菌活性(圖1)。
[0308]來(lái)自個(gè)體LAB菌落的條件培養(yǎng)基抗腸炎沙門(mén)氏菌的活性大不相同(圖2a)。這不是菌株依賴性的。約氏乳桿菌中抗沙門(mén)氏菌活性的范圍與路氏乳桿菌中的類似。將所述培養(yǎng)物基于其在體外抑制沙門(mén)氏菌的能力任意分組(圖2b)。組I具有〈20000單位的抑制，組2有20000-40000單位的抑制，組3有40000-60000單位的抑制，組4有60000-80000單位的抑制，組5有80000-100000單位的抑制，組6?100000單位的抑制(圖2b)。組I由14種菌株組成(總數(shù)的3.4% )，組2有95種菌株(22.8% )，組3有99種菌株(23.7%)，組4有99種菌株(23.7% )，組5有86種菌株(20.6% )，組6有24種菌株(5.8% )。后面的這一組由17種約氏乳桿菌和約氏乳桿菌相關(guān)菌株、6種路氏乳桿菌或路氏乳桿菌相關(guān)菌株以及一種未培養(yǎng)的菌株組成。
[0309]3.體外抗大腸桿菌K88的活性
[0310]同樣，通過(guò)孔擴(kuò)散測(cè)定篩選來(lái)自LAB的條件培養(yǎng)基抗大腸桿菌K88的活性。與沙門(mén)氏菌一樣，抗大腸桿菌K88的活性在個(gè)體LAB菌落之間大不相同(圖3a)。所述活性的范圍和變化在約氏乳桿菌和路氏乳桿菌菌株中是類似的。一般而言，任何個(gè)體LAB的抗沙門(mén)氏菌活性和抗大腸桿菌K88活性之間沒(méi)有直接關(guān)聯(lián)(圖3c、3d)。然而，在大腸桿菌K88組5的10種菌株中(圖3b)，7種對(duì)所述兩種病原體都有相對(duì)高的活性，兩種對(duì)大腸桿菌K88有高活性但是對(duì)沙門(mén)氏菌有中等活性，一種主要對(duì)大腸桿菌K88有活性。
[0311]4.候選LAB的初步選擇
[0312]鑒定了 33種菌株用于進(jìn)一步的體外測(cè)試(表2)。這些菌株包含18種約氏乳桿菌和約氏乳桿菌相關(guān)菌株，11種路氏乳桿菌或路氏乳桿菌相關(guān)菌株，和4種植物乳桿菌和植物乳桿菌相關(guān)菌株(表2a)。
[0313]5.豬腸上皮[IPEC-J2]細(xì)胞的附著/侵入
[0314]評(píng)估了 LAB阻斷腸炎沙門(mén)氏菌和大腸桿菌K88附著/侵入IPEC細(xì)胞的能力(圖4a.4b.4c)。所述候選LAB均大大地減少了沙門(mén)氏菌對(duì)IPEC細(xì)胞的附著和侵入。它們中的大多數(shù)還非常有效地抗大腸桿菌K88。然而，所述菌株中的3種僅對(duì)大腸桿菌K88對(duì)IPEC細(xì)胞的附著/侵入有有限影響。
[0315]6.LAB對(duì)抗生素的敏感性
[0316]評(píng)估了所述候選LAB對(duì)一系列抗生素的敏感性(表4、圖5)。除了一種菌株(RINH瓶編號(hào)266)以外，所有菌株都展現(xiàn)出一定程度的對(duì)單獨(dú)抗生素的抗性。所有菌株對(duì)氨芐西林(10 μ g)、頭孢噻肟(30 μ g)和氯霉素(10 μ g)是敏感的。大多數(shù)對(duì)紅霉素(15 μ g)、艮他霉素(10 μ g)、四環(huán)素(30 μ g)和萬(wàn)古霉素(30 μ g)是敏感的。幾乎全部菌株對(duì)甲硝唑(50 μ g)和萘啶酸(30 μ g)有抗性并且對(duì)卡那霉素(30 μ g)有較低程度的抗性。23
[0317]7.候選LAB的精選
[0318]鑒定了 23種高排名的菌株用于進(jìn)一步的體外測(cè)試。
[0319]8.LAB的底物特異性
[0320]使用API CH50試劑盒篩選所述候選LAB的底物反應(yīng)性(表5、表6、圖6)。約氏乳桿菌、路氏乳桿菌和植物乳桿菌均展現(xiàn)出菌株特異性的普遍的底物反應(yīng)譜。另外，每種基因型的大多數(shù)菌株展現(xiàn)出其底物反應(yīng)性的細(xì)微差異，表明它們是獨(dú)特的個(gè)體菌株。
[0321]9.豬腸上皮[IPEC-J2]細(xì)胞中炎癥的抑制
[0322]測(cè)試了候選LAB阻斷或抑制由12-氧-十四烷酰戟二萜醇_13_乙酸酯[PMA]在IPEC細(xì)胞中觸發(fā)的炎癥應(yīng)答的能力(圖7、表7)。所述候選菌株阻斷由PMA觸發(fā)的白細(xì)胞介素-8(IL-8)基因表達(dá)的能力大不相同。5種菌株(RINH瓶編號(hào)29、30、31、86和266)具有強(qiáng)的抗炎效應(yīng)。
[0323]10.候選LAB的最終選擇
[0324]經(jīng)鑒定，14種菌株具有針對(duì)沙門(mén)氏菌和大腸桿菌K88的殺死和阻斷活性，具有對(duì)抗生素的敏感性、碳水化合物反應(yīng)性和在體外抑制炎癥的能力。這些菌株中的7種是尤其優(yōu)選的。所述后一組包含4種植物乳桿菌相關(guān)菌株、3種約氏乳桿菌相關(guān)菌株和一種路氏乳桿菌。將這些LAB菌株中的兩種[GGDK266和GGDK31]大量制備，用于在使用新斷奶的仔豬的試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估(表8)。
[0325]11.LAB的冷凍干燥和保存
[0326]評(píng)估了在脫脂奶粉[SKP]、SKP加乳糖或SKP加蔗糖中冷凍干燥后LAB的存活和生存力(圖8)。當(dāng)在SKP中干燥的樣品在室溫保存42天和84天時(shí)，生存力的少量損失是明顯的。這在脫脂奶粉和結(jié)合使用糖時(shí)沒(méi)那么顯著。然而，24后者的制劑趨向于易潮濕并難以保持。因此，通過(guò)在脫脂奶粉中干燥所述細(xì)菌[100g/l]來(lái)制備GGDK266和GGDK31的大量制備物(表8)。
[0327]12.熱處理研究
[0328]將來(lái)自有機(jī)飼養(yǎng)豬的糞便的懸浮物在50_70°C加熱處理不同的時(shí)間，鋪在MRS瓊脂上，將菌落挑出并在MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)[RINH瓶編號(hào)417-506]。回收的菌株類型是不同的，梭菌種的比例高并且所分離的菌株對(duì)熱保持敏感。
[0329]在70°C對(duì)分離的LAB培養(yǎng)物加熱15分鐘，進(jìn)行3次(圖9)。在第一次加熱處理后，活細(xì)菌減少達(dá)3-4個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。然而，存活的細(xì)菌有一定程度的熱抗性。當(dāng)將活細(xì)菌再培養(yǎng)并再加熱兩次時(shí)，除了一個(gè)例外外，所述細(xì)菌的損失低。
[0330]在70°C加熱處理3次改變了所述菌株的生物活性圖9。RINH瓶編號(hào)521 (經(jīng)加熱處理的瓶編號(hào)255)不能阻斷病原體附著到IPEC細(xì)胞上，RINH瓶編號(hào)520 (經(jīng)加熱處理的瓶編號(hào)230)阻止附著的能力降低。RINH瓶編號(hào)517 (經(jīng)加熱處理的瓶編號(hào)31)消除IPEC細(xì)胞中觸發(fā)的炎癥應(yīng)答的能力消失。相反，RINH瓶編號(hào)518 (經(jīng)加熱處理的瓶編號(hào)85)和RINH瓶編號(hào)519 (經(jīng)加熱處理的瓶編號(hào)86)的生物學(xué)特性與天然菌株的類似。
[0331]13.小鼠感染研究
[0332]13.1粘膜乳桿菌(RINH瓶編號(hào)323)
[0333]當(dāng)用高水平的腸炎沙門(mén)氏菌S1400攻擊時(shí)，C3H/HeN小鼠患上持續(xù)性的但非致死性的腸和全身性感染，其具有人沙門(mén)氏菌病主要形式的許多特征。相反，當(dāng)用相同的病原體攻擊時(shí)，C57B1/6小鼠患上讓人想到人急性感染的主要是全身性的嚴(yán)重感染。為了評(píng)估粘膜乳桿菌(瓶編號(hào)323)減輕沙門(mén)氏菌病的能力，在用腸炎沙門(mén)氏菌攻擊之前和之后用粘膜乳桿菌處理 C3H/HeN 和 C57B1/6 小鼠(圖 10、13)。在感染后第 6 (C57B1/6)或 10 (C3H/HeN)天，對(duì)所述小鼠實(shí)施安樂(lè)死并解剖。
[0334]全身性組織:口服給予粘膜乳桿菌限制了腸炎沙門(mén)氏菌在C3H/HeN和C57B1/6小鼠中引起全身性感染的能力(圖lla-c;14a-c)。在小鼠的腸系膜淋巴結(jié)、肝和脾中檢測(cè)到大量的活沙門(mén)氏菌。相反，如果所述小鼠已用RINH瓶編號(hào)323 (粘膜乳桿菌)共處理，那么這些組織中存在的沙門(mén)氏菌數(shù)量大大減少。沙門(mén)氏菌感染導(dǎo)致脾增大(圖12a ;15)。在用RINH瓶編號(hào)323 (粘膜乳桿菌)和沙門(mén)氏菌兩者處理的小鼠中，這種組織應(yīng)答顯著減弱。
[0335]腸:在用沙門(mén)氏菌或沙門(mén)氏菌加RINH瓶編號(hào)323 (粘膜乳桿菌)處理的C3H/HeN小鼠中測(cè)定了腸髓過(guò)氧化物酶[ΜΡ0]，所述髓過(guò)氧化物酶是中性粒細(xì)胞的標(biāo)志物。沙門(mén)氏菌感染大大地增加了腸中的MPO，這是因?yàn)橹行粤＜?xì)胞被募集到針對(duì)感染的宿主應(yīng)答的腸部分(圖12b)。用RINH瓶編號(hào)323(粘膜乳桿菌)進(jìn)行共處理降低了感染沙門(mén)氏菌的小鼠腸中的MPO活性，表明在這些動(dòng)物中針對(duì)感染的腸炎癥應(yīng)答削弱。
[0336]13.2 新的豬 LAB
[0337]選擇了 4種LAB:RINH瓶編號(hào)31、RINH瓶編號(hào)32、RINH瓶編號(hào)46和RINH瓶編號(hào)47 (均為路氏乳桿菌；分別為L(zhǎng)R31、LR32、LR36和LR47)。為了評(píng)估它們減輕病原體感染的效能，在用腸炎沙門(mén)氏菌攻擊之前和之后，用這些LAB或RINH瓶編號(hào)323 (粘膜乳桿菌，LM)處理C3H/HeN小鼠(圖16)。在感染后第10天，對(duì)所述小鼠實(shí)施安樂(lè)死并解剖。如果所述小鼠已用LAB共處理，那么腸炎沙門(mén)氏菌的糞便排泄減少(圖17a、b)。LR31和LR32趨向于對(duì)糞便沙門(mén)氏菌排出量有最大影響。
[0338]腸:用LR31、LR32、LM、LR46或LR47處理顯著地減少了盲腸中沙門(mén)氏菌的數(shù)量(圖18a)。此外，LR31、LR32、LR46和LR47使結(jié)腸中沙門(mén)氏菌的數(shù)量減少，而LM不能(圖18b)。用LR31和LR32時(shí)，所述減少趨向于更大。與大腸相比，所述LAB對(duì)小腸中沙門(mén)氏菌的數(shù)量沒(méi)有明顯影響。
[0339]全身組織:用LR31、LR32、LM、LR46或LR47進(jìn)行處理大大減少了在脾和肝中檢測(cè)到的沙門(mén)氏菌的數(shù)量(圖19a-c)。用LR31和LR32時(shí)，所述減少比用LM、LR46或LR47時(shí)更明顯。在用LR31、LR32和LR46處理，而不是用LM或LR47處理后，腸系膜淋巴結(jié)中沙門(mén)氏菌數(shù)量降低。
[0340]討論
[0341]從有機(jī)飼養(yǎng)豬的糞便分離的LAB菌株(挑選了總共436個(gè)單獨(dú)的菌落)主要是路氏乳桿菌、約氏乳桿菌、加氏乳桿菌、戊糖乳桿菌菌株，還有少量的植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、陰道乳桿菌和單株粘膜乳桿菌，以及若干未培養(yǎng)的菌株。所述LAB的大多數(shù)產(chǎn)生可在體外抑制腸炎沙門(mén)氏菌和/或大腸桿菌K88生長(zhǎng)的物質(zhì)。個(gè)體菌株之間這些抗病原體物質(zhì)的效能大有不同。一部分LAB抗腸炎沙門(mén)氏菌的活性高而抗大腸桿菌K88的活性低，反之亦然，但是大多數(shù)抗所述兩種病原體的活性類似。
[0342]基于體外確定的抗微生物效能選擇出33株菌株。進(jìn)一步篩選這些細(xì)菌在體外阻斷病原體附著/侵入豬腸上皮細(xì)胞(IPEC)的能力和其對(duì)抗生素的敏感性。
[0343]測(cè)定了 23種菌株的底物范圍和特異性以及其在體外抑制IPEC細(xì)胞中的炎癥的能力。通過(guò)這，鑒定了 14種具有尤其有利的特性的LAB(5種約氏乳桿菌、6種路氏乳桿菌和3種植物乳桿菌)。
[0344]大量制備了兩種LAB菌株[GGDK266和GGDK31]，用于在新斷奶的仔豬中進(jìn)行體內(nèi)評(píng)估。其他可能重要的候選菌株存在于該含有14種LAB的組中。
[0345]還評(píng)估了在多種溶液中冷凍干燥后LAB的存活和生存力。長(zhǎng)期保存用脫脂奶粉干燥的樣品時(shí)，生存力的少量損失是明顯的。當(dāng)使用脫脂奶粉和糖時(shí)，這種損失會(huì)不那么明顯。然而，后者的制備物是易潮濕的并且難以保持。因此，決定使用脫脂奶粉懸浮物進(jìn)行LAB的冷凍干燥和保存。將GGDK266和GGDK31的大量制備物在該介質(zhì)中冷凍干燥。
[0346] 對(duì)于要在丸粒狀動(dòng)物飼料中使用的LAB而言，熱穩(wěn)定性是有用的特性。獲得了 5種加熱條件下活的分離豬LAB。然而，所述菌株中3種菌株的體外生物學(xué)特性和益生菌潛能受到加熱處理的不利影響。雖然如此，所述細(xì)菌有2種保留了其天然未加熱處理形式的生物學(xué)特性。
[0347]測(cè)試5種豬LAB(路氏乳桿菌[4]或粘膜乳桿菌[I])在體內(nèi)減輕沙門(mén)氏菌病的能力。用這些LAB處理小鼠可大大地降低腸炎沙門(mén)氏菌的致病性。
[0348]14.評(píng)估口服給予有機(jī)乳桿菌益生菌菌株對(duì)消化道微生物群的調(diào)節(jié)和早期斷奶豬的表現(xiàn)
[0349]在早期斷奶仔豬上進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，以測(cè)試本發(fā)明的兩種益牛菌菌株,乳桿菌菌株GGDK266 和 GGDK31,的效應(yīng)。
[0350]試駘設(shè)計(jì)
[0351]動(dòng)物:
[0352].24只大的-白色XRedon仔豬
[0353].早期斷奶(21日齡，& 7_8kg)，在當(dāng)?shù)剞r(nóng)場(chǎng)出生
[0354]?稱重，然后在不同的組之間均勻分配
[0355].3種實(shí)驗(yàn)處理(η = 8):
[0356]A -基礎(chǔ)飲食+安慰劑
[0357]B -基礎(chǔ)飲食+益生菌⑶DK266，劑量10 X 112
[0358]C -基礎(chǔ)飲食+益生菌⑶DK31，劑量1X 112
[0359]?觀察期:14天
[0360]飲食:
[0361]基于大麥、小麥和大豆粉的飲食
[0362].飼料組成(％ ):
[0363]

【權(quán)利要求】
1.一種豬乳酸菌菌株，其中所述菌株的特征在于一種或多種以下特征: (i)展現(xiàn)出針對(duì)大腸桿菌(E.coli)的抗微生物活性的能力； (ii)展現(xiàn)出針對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌(S.enteritidis)的抗微生物活性的能力； (iii)抑制由12-氧-十四烷酰戟二萜醇-13-乙酸酯(PMA)誘導(dǎo)的IPEC細(xì)胞中的炎癥的能力； (iv)阻斷腸炎沙門(mén)氏菌附著或侵入IPEC細(xì)胞的能力； (v)阻斷大腸桿菌附著或侵入IPEC細(xì)胞的能力； (vi)沒(méi)有對(duì)選自以下的一種或多種抗生素的抗生素抗性:氨芐西林；頭孢噻肟；氯霉素；紅霉素；艮他霉素；四環(huán)素；萬(wàn)古霉素；甲硝唑；萘啶酸；和卡那霉素；和 (vii)當(dāng)遭受三個(gè)循環(huán)的加熱時(shí)展現(xiàn)出熱穩(wěn)定性的能力，每個(gè)循環(huán)包括在70°C的溫度下加熱15分鐘的時(shí)間。
2.權(quán)利要求1的乳酸菌菌株，其具有選自(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)和(vii)的任意兩種特征。
3.權(quán)利要求1的乳酸菌菌株，其具有選自(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)和(vii)的任意三種特征。
4.權(quán)利要求1的乳酸菌菌株，其具有選自(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)和(vii)的任意四種特征。
5.權(quán)利要求1的乳酸菌菌株，其具有選自(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)和(vii)的任意五種特征。
6.權(quán)利要求1的乳酸菌菌株，其具有選自(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)和(vii)的任意六種特征。
7.權(quán)利要求1的乳酸菌菌株，其具有所有七種特征:(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)和(vii)。
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的乳酸菌菌株，選自約氏乳桿菌(L.johnsonii)、路氏乳桿菌(L.reuteri)>植物乳桿菌(L.plantarum)、加氏乳桿菌(L.gasseri)、戍糖乳桿菌(L.pentosus)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、陰道乳桿菌(L.vaginalis)和粘膜乳桿菌(L.mucosae)。
9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的乳酸菌菌株，選自約氏乳桿菌、路氏乳桿菌和植物乳桿菌。
10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的乳酸菌菌株，選自: NCIMB41846:路氏乳桿菌 GGDK31 ； NCIMB41847:類植物乳桿菌(Lactobacillus paraplantarum)和路氏乳桿菌 GGDK161 ； NCIMB41848:路氏乳桿菌 GGDK255 ； NCIMB41849:植物 / 戍糖 / 瑞士(Lactobacillus helveticus) / 類植物乳桿菌GGDK258 ； NCIMB41850:約氏乳桿菌和路氏乳桿菌GGDK266 ； NCIMB42008約氏乳桿菌； NCIMB42009:路氏乳桿菌； NCIMB42010:植物乳桿菌； NCIMB42011路氏乳桿菌；和NCIMB42012:路氏乳桿菌。
11.一種組合物，其包含一種或多種權(quán)利要求ι-?ο任一項(xiàng)的乳酸菌菌株以及可藥用賦形劑、載體或稀釋劑。
12.—種益生菌組合物，其包含一種或多種權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的乳酸菌菌株。
13.—種或多種權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的乳酸菌菌株用于醫(yī)藥。
14.一種或多種權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的乳酸菌菌株用于治療受試者中的腸病癥。
15.—種或多種權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的乳酸菌菌株在制備用于治療受試者中腸病癥的藥物中的用途。
16.權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的一種或多種乳酸桿菌的用途，其中所述受試者是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。
17.權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的一種或多種乳酸桿菌的用途，其中所述腸病癥是沙門(mén)氏菌病、腸易激綜合征(IBS )、炎性腸道病癥(IBD )、功能性消化不良、功能性便秘、功能性腹瀉(包括抗生素相關(guān)性腹瀉、旅行者腹瀉和小兒腹瀉)、功能性腹痛、功能性胃氣脹、上腹痛綜合征、餐后不適綜合征、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、胃腸反流性疾病(GERD)、變態(tài)反應(yīng)、特應(yīng)性疾病例如特應(yīng)性皮炎、壞死性小腸結(jié)腸炎、其他感染以及其組合。
18.一種治療受試者中腸病癥的方法，所述方法包括給予所述受試者藥物有效量的一種或多種權(quán)利要求1-10任一 項(xiàng)的乳酸菌菌株或權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的組合物。
19.一種或多種權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的乳酸菌菌株用于改善腸道微生物群。
20.一種改善受試者中腸道微生物群的方法，所述方法包括給予所述受試者包含一種或多種權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的乳酸菌菌株的組合物或者權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的組合物。
21.—種或多種權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的乳酸菌菌株在制備用于改善腸道微生物群的藥物中的用途。
22.—種飼料,其包含一種或多種權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的菌株。
23.—種食品,其包含一種或多種權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的菌株。
24.一種飲食補(bǔ)充物，其包含一種或多種權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的菌株。
25.—種食品添加劑,其包含一種或多種權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的菌株。
26.—種產(chǎn)生益生菌的方法,所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的菌株。
27.—種制備一種或多種權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的菌株的方法,所述方法包括以下步驟: (i)從有機(jī)飼養(yǎng)的豬獲得糞便； (?)冷凍所述糞便并使其在合適的稀釋劑中分散； (iii)任選在補(bǔ)充的豬初乳碳水化合物的存在下，將在步驟(ii)中獲得的分散的糞便施加到合適的瓊脂，并在厭氧條件下孵育； (v)選擇步驟(iv)期間形成的不同菌落，任選在補(bǔ)充的豬初乳碳水化合物的存在下，接種到合適的肉湯培養(yǎng)基中； (vi)孵育步驟(V)中獲得的接種的菌落。
28.一種獲得豬乳酸菌菌株的方法，所述方法包括從有機(jī)飼養(yǎng)的豬獲得糞便并從所述糞便提取一種或多種豬乳酸菌菌株。
29.權(quán)利要求28的方法，其包括以下步驟: (i)從有機(jī)飼養(yǎng)的豬獲得糞便； (?)冷凍所述糞便并使其在合適的稀釋劑中分散； (iii)任選在補(bǔ)充的豬初乳碳水化合物的存在下，將在步驟(ii)中獲得的分散的糞便施加到合適的瓊脂，并在厭氧條件下孵育； (v)選擇步驟(iv)期間形成的不同細(xì)菌菌落，任選在補(bǔ)充的豬初乳碳水化合物的存在下，接種到合適的肉湯培養(yǎng)基中； (vi)孵育步驟(V)中獲得的接種的菌落。
30.通過(guò)權(quán)利要求28或權(quán)利要求29的方法獲得或可獲得的一種或多種豬乳酸菌菌株。
31.一種乳酸菌菌株，其包含選自SEQ ID勵(lì):1-87的163 rRNA基因序列或者所述序列的變體或同系物 。
【文檔編號(hào)】C12R1/23GK104080903SQ201280044674
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2012年7月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月14日
【發(fā)明者】D·凱利 申請(qǐng)人:Gt生物制劑有限公司