專利名稱：一種乳酸乳球菌誘變菌株及其培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種乳酸乳球菌誘變菌株， 為一種新的菌株品種，本發(fā)明還提供了該 菌株的培育方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳鏈菌肽是由乳酸乳球菌(lactococcus lactis)產(chǎn)生的一種小分子多肽物質(zhì)，對(duì) 許多革蘭氏陽(yáng)性菌，包括葡萄球菌、鏈球菌、微球菌、分枝桿菌、利斯特氏菌和乳桿菌等有強(qiáng) 烈的抑制作用。乳鏈菌肽作為一種高效、天然、無(wú)毒的食品防腐劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于肉類、魚 類、牛奶、干酪、蛋類、水果、蔬菜、果汁飲料、啤酒釀造和豆制品等食品的防腐處理。隨著應(yīng) 用研究的深入，乳鏈菌肽應(yīng)用范圍已擴(kuò)展到造紙、活性食品包裝、農(nóng)業(yè)飼料、生殖避孕和醫(yī) 學(xué)移植等領(lǐng)域。在國(guó)外，乳鏈菌肽早就開始了工業(yè)化大生產(chǎn)，乳鏈菌肽的應(yīng)用也很普遍。但我國(guó)在 此領(lǐng)域的研究比較落后，進(jìn)入20世紀(jì)90年代后才對(duì)乳鏈菌肽進(jìn)行系統(tǒng)研究，而且大多研究 集中在培養(yǎng)基和發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化方面，乳鏈菌肽效價(jià)較低，是制約乳鏈菌肽大規(guī)模生產(chǎn)的 瓶頸。在本發(fā)明中，選育了一株高產(chǎn)乳鏈菌肽的乳酸乳球菌誘變菌株，對(duì)乳鏈菌肽的深入研 究和廣泛應(yīng)用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種乳鏈菌肽的乳酸乳球菌誘變菌株，為一種新的菌株， 其產(chǎn)生的乳鏈菌肽效價(jià)和野生菌相比有顯著提高。本發(fā)明還提供了該菌株的培育方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的乳酸乳球菌誘變菌株在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心保藏，保藏日期2009年5月4日，登記號(hào)CGMCC NO. 3050，分類命名乳酸乳球菌乳亞 禾中，Lactoccuslactis subsp lactis。本發(fā)明所述的乳酸乳球菌菌株培育方法，包括以下步驟IMfLactococcus lactis subsp. lactis ATCCl 1454凍干粉末接入液體小試管培 養(yǎng)基中進(jìn)行活化后，轉(zhuǎn)接至液體搖瓶培養(yǎng)基中，30-38°C恒溫箱中培養(yǎng)8-24h，連續(xù)傳代5次 后，接種新的種子液，接種量為5% (ν/ν)，裝液量為IOOmL(搖瓶容量250mL)，將培養(yǎng)8h的 菌液，8000r/min離心lOmin，菌體用無(wú)菌水清洗兩遍，加30_50mL水，在有玻璃珠的三角瓶 中30°C振蕩lh，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)后，8000r/min離心10 min，取菌體沉淀；2)在菌體沉淀中加入-3% (ν/ν)的0. lmol/L的硫酸二乙酯磷酸鹽緩沖液(使 菌體濃度為1 X IO8個(gè)/mL)，pH 7. 0，放入150r/min搖床振搖15_40min ；3)采用25%硫代硫酸鈉進(jìn)行終止誘變反應(yīng)，將誘變菌液逐級(jí)稀釋至IX IO6倍，涂 布乳鏈菌肽抗性梯度平板，30-38°C恒溫箱中培養(yǎng)8-24h，對(duì)乳鏈菌肽高產(chǎn)菌株進(jìn)行初篩，采 用雙層瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行復(fù)篩；4)將篩選獲得的菌株在搖瓶中復(fù)蘇，30°C，150r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)8_24h，連續(xù)傳代10次，測(cè)定每代的乳鏈菌肽效價(jià)，即得。本發(fā)明所述的高產(chǎn)乳鏈菌肽突變株的特征為

1)誘變菌株 SYZXD2 在玉米漿80-90mL，糖醪 10-15mL，KH2P04 l_2g，NaC10. 1-0. 5g， 配制成的IOOmL廢料發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，乳鏈菌肽的效價(jià)為5000-7000IU/mL，比野生菌 提高 3. 94-5. 51 倍。2)誘變菌株SYZXD2在葡萄糖15_20g/L，蛋白胨20_30g/L，酵母浸粉22_28g/L， NaC14-7g/L,KH2PO4 8_12g/L，MgSO4 ·7Η20 0. 1-0. 5g/L 的化學(xué)試劑發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，乳 鏈菌肽的效價(jià)為8000-11000IU/mL，比野生菌提高6. 30-8. 66倍。3)誘變菌株SYZXD2最適發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度30-38 °C，搖瓶轉(zhuǎn)速120_180rpm， 裝液量80mL-110mL、接種量2_5%，初始pH值為6. 2-7. 5。本發(fā)明的積極效果在于誘變的乳酸乳球菌新菌株經(jīng)10次以上傳代培養(yǎng)不退化， 具有遺傳穩(wěn)定性，并且乳鏈菌肽的效價(jià)遠(yuǎn)遠(yuǎn)比野生菌高出許多倍。具體實(shí)施方法為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實(shí)施例。其作用被理解為是對(duì)本發(fā)明的闡釋而 非對(duì)本發(fā)明的任何形式的限制。實(shí)施例1 (1)乳酸乳球菌的誘變將Lactococcus lactis subsp. Iactis ATCC11454 凍干粉末接入液體小試管培 養(yǎng)基中進(jìn)行活化后，轉(zhuǎn)接至液體搖瓶培養(yǎng)基中，37°C恒溫箱中培養(yǎng)12h，連續(xù)傳代5次后，接 種新的種子液，接種量為5% (ν/ν)，裝液量為IOOmL(搖瓶容量250mL)，將培養(yǎng)8h的菌液， 8000r/min離心lOmin，菌體用無(wú)菌水清洗兩遍，加入30mL水，在有玻璃珠的三角瓶中30°C 振蕩lh，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)后，8000r/min離心lOmin，取菌體沉淀，加入2% (使菌體 濃度為IX IO8個(gè)/mL,)的0. lmol/L的硫酸二乙酯磷酸鹽緩沖液，pH 7. 0，放入150r/min 搖床振搖30min ；采用25%硫代硫酸鈉進(jìn)行終止誘變反應(yīng)，將誘變菌液逐級(jí)稀釋至IXlO6 倍，涂布乳鏈菌肽抗性梯度平板，37 °C恒溫箱中培養(yǎng)12h。(2)乳鏈菌肽高產(chǎn)菌株的篩選乳鏈菌肽抗性梯度平板的制備在無(wú)菌的平板中倒入15mL左右的下層固體培養(yǎng) 基，將平板的一端墊起，使培養(yǎng)基在平板上凝固成斜面，再倒入12. 5mL含乳鏈菌肽的上層 發(fā)酵固體培養(yǎng)基，將平板平放，等待凝固。含有乳鏈菌肽的上層固體發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值用 2mol/L的HCl調(diào)到3. 5，105°C滅菌lOmin。待乳鏈菌肽抗性梯度平板上的菌落生長(zhǎng)成熟后， 挑選乳鏈菌肽高濃度區(qū)的菌落挑到小試管液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，活化后經(jīng)250mL搖瓶發(fā) 酵(裝液量為IOOmL)，雙層瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定乳鏈菌肽效價(jià)。將乳鏈菌肽高產(chǎn)菌株挑選出來(lái) 并立即制成甘油管保存。再采用雙層瓊脂擴(kuò)散法復(fù)篩。實(shí)施例2 以 Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC11454 為出發(fā)菌株，利用 2%的硫酸 二乙酯進(jìn)行誘變處理，采用25%硫代硫酸鈉進(jìn)行終止誘變反應(yīng)。利用乳鏈菌肽抗性梯度平 板法對(duì)誘變菌株進(jìn)行篩選，獲得乳鏈菌肽高產(chǎn)誘變菌株SYZXD2。用工業(yè)廢料對(duì)乳鏈菌肽高 產(chǎn)菌株SYZXD2進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化。通過(guò)單因素試驗(yàn)方法確定工業(yè)廢料酒糟、玉米漿、糖 醪發(fā)酵生產(chǎn)乳鏈菌肽的最佳濃度，然后采用Box-Behnken設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法確定乳鏈菌肽的最佳廢料培養(yǎng) 基組分為玉米漿88mL，糖醪12mL，KH2PO4 1. 56g，NaCl 0. 25g，配制成 IOOmL的培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下乳鏈菌肽的效價(jià)為5590IU/mL。 實(shí)施例3 以 Lactococcus lactis subsp. Iactis ATCC11454 為出發(fā)菌株，利用 2%的硫酸 二乙酯進(jìn)行誘變處理，采用25%硫代硫酸鈉進(jìn)行終止誘變反應(yīng)。利用乳鏈菌肽抗性梯度平 板法對(duì)誘變菌株進(jìn)行篩選，獲得乳鏈菌肽高產(chǎn)誘變菌株SYZXD2。利用化學(xué)試劑對(duì)乳鏈菌肽 高產(chǎn)菌株SYZXD2的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。將Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，最陡爬坡試驗(yàn)和 響應(yīng)面分析法三種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法綜合應(yīng)用于乳鏈菌肽高產(chǎn)菌株SYZXD2發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化， 確定最佳的化學(xué)試劑培養(yǎng)基組分為葡萄糖19. 3g/L，蛋白胨28. 6g/L，酵母浸粉24. lg/L， NaCl 5. 9g/L，KH2PO4 10g/L, MgSO4 · 7H20 0. 2g/L，在此培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，乳鏈菌肽效價(jià)為 10070IU/mL。實(shí)施例4 以Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC11454為出發(fā)菌株，利用 2%的硫酸二 乙酯進(jìn)行誘變處理，采用25%硫代硫酸鈉進(jìn)行終止誘變反應(yīng)。利用乳鏈菌肽抗性梯度平板 法對(duì)誘變菌株進(jìn)行篩選，獲得乳鏈菌肽高產(chǎn)誘變菌株SYZXD2。利用單因素試驗(yàn)法對(duì)該菌株 的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。在廢料培養(yǎng)基中，該菌株的最佳培養(yǎng)條件為裝液量lOOmL、接種 量5%、培養(yǎng)溫度37°C、轉(zhuǎn)速160rpm、初始pH值為6. 5，乳鏈菌肽發(fā)酵時(shí)間為10h，在此培養(yǎng) 基條件下，乳鏈菌肽的效價(jià)為6500IU/mL。在化學(xué)試劑培養(yǎng)基中，該菌株的最佳培養(yǎng)條件為 裝液量lOOmL、接種量3%、培養(yǎng)溫度37°C、轉(zhuǎn)速150rpm、初始pH值為6. 8，乳鏈菌肽發(fā)酵時(shí) 間為8h，在此培養(yǎng)基條件下，乳鏈菌肽的效價(jià)為10100IU/mL。
權(quán)利要求
1.一種乳酸乳球菌誘變菌株，其保藏號(hào)為CGMCC NO. 3050。
2.獲得權(quán)利要求1所述乳酸乳球菌菌株的方法，包括以下步驟完成 IMfLactococcus lactis subsp. Iactis ATCCl 14M凍干粉末接入液體小試管培養(yǎng)基中進(jìn)行活化后，轉(zhuǎn)接至液體搖瓶培養(yǎng)基中，30-38°C恒溫箱中培養(yǎng)8-Mh，連續(xù)傳代5次后， 接種新的種子液，接種量為5% (ν/ν)，裝液量為IOOmL(搖瓶容量250mL)，將培養(yǎng)他的菌 液，8000r/min離心lOmin，菌體用無(wú)菌水清洗兩遍，加一定體積水，在有玻璃珠的三角瓶中 30°C振蕩lh，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)后，8000r/min離心lOmin，取菌體沉淀；2)在菌體沉淀中加入-3%(ν/ν)的0. lmol/L的硫酸二乙酯磷酸鹽緩沖液(調(diào)節(jié) 使菌體濃度為1 X IO8個(gè)/mL)，pH 7. 0，放入150r/min搖床振搖15_40min ；3)采用25%硫代硫酸鈉進(jìn)行終止誘變反應(yīng)，將誘變菌液逐級(jí)稀釋至IXIO6倍，涂布乳 鏈菌肽抗性梯度平板，30-38°C恒溫箱中培養(yǎng)8-Mh，對(duì)乳鏈菌肽高產(chǎn)菌株進(jìn)行初篩，采用雙 層瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行復(fù)篩；4)將篩選獲得的菌株在搖瓶中復(fù)蘇，30°C，150r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)8_Mh，連續(xù)傳代 10次，即得。
全文摘要
本發(fā)明提供一種乳鏈菌肽的乳酸乳球菌誘變菌株及其培育方法，以Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC11454為出發(fā)菌株，通過(guò)硫酸二乙酯進(jìn)行誘變處理，篩選獲得乳鏈菌肽高產(chǎn)誘變菌株，其保藏號(hào)為CGMCC NO.3050。該菌株在玉米漿、糖醪、KH2PO4、NaCl配制成的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，乳鏈菌肽的效價(jià)為5000-7000IU/mL，比野生菌提高3.94-5.51倍。在葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、NaCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O的化學(xué)試劑發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，乳鏈菌肽的效價(jià)為8000-11000IU/mL，比野生菌提高6.30-8.66倍。本發(fā)明的乳酸乳球菌新菌株經(jīng)10次以上傳代培養(yǎng)不退化，具有遺傳穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102093962SQ20091006745
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2009年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月28日
發(fā)明者任曉冬, 蘭鵬飛, 姜麗艷, 孟慶繁, 李雪, 滕利榮, 王貞佐, 程瑛琨, 逯家輝, 馬富強(qiáng) 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)