一株乳酸乳球菌乳酸亞種及其在低溫青貯中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一株乳酸乳球菌乳酸亞種及其在低溫青貯中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 青貯是在乳酸菌的厭氧發(fā)酵作用下將碳水化合物轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸，從而使pH降低 達(dá)到長期貯存的目的。乳酸菌和溫度是青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)好壞的決定性因素。
[0003] 小麥秸桿是寒冷地區(qū)冬春飼補(bǔ)的飼料作物，由于寒冷地區(qū)溫度低，限制乳酸菌的 生長，很難發(fā)酵出品質(zhì)優(yōu)良并可以長期貯存的飼料。
[0004] 因此，篩選出耐高低溫、耐鹽、耐酸堿的抗逆性較強(qiáng)的菌株，并將其作為發(fā)酵劑添 加到低溫青貯小麥秸桿飼料中，將會對高寒地區(qū)的青貯飼料制作有著巨大的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個目的是提供一株乳酸乳球菌乳酸亞種。
[0006] 本發(fā)明所提供的乳酸乳球菌乳酸亞種具體為乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp. lactis)QHl_666,該菌株已于2015年4月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏 中心（簡稱CCTCC，地址為：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學(xué)校內(nèi)武漢大學(xué)保藏 中心），其保藏編號為CCTCC NO :M 2015255。
[0007] 所述乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666 從中國 青海省明察縣城油菜分離得到的，該菌株單菌落為圓形，革蘭氏染色陰性，不產(chǎn)過氧化氫； 該菌株不能夠發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣，為同型發(fā)酵。在5°C和KTC長勢良好，45°C環(huán)境生長微弱， 在50°C不生長，表明該菌株均有良好的耐低溫生長能力。該菌株在3. 00 %和6. 50%的NaCl 濃度中均生長良好微弱，表明該菌株具有一般的耐鹽能力。液體5°C培養(yǎng)7天，該菌株的上 清液PH降到4. 0,培養(yǎng)到10-14天時pH降到3. 5,表明其產(chǎn)酸能力較好。該菌株在pH4. 0-9. 0 的環(huán)境中生長良好，表明該菌株有較好的耐酸堿生長能力。其16S rDNA序列如序列表中序 列1所示。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種菌劑。
[0009] 本發(fā)明所提供的菌劑的活性成分為所述乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp.lactis)QH1-666。
[0010] 所述菌劑除了包含作為活性成的所述乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp. lactis)QHl-666外，還可包含輔料，如MRS固體培養(yǎng)基（溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度 如下：蛋白胨l〇g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，三水合乙酸鈉5g/L，吐溫 801g/L，磷酸氫二鉀2g/L，檸檬酸銨2g/L，硫酸鎂2g/L，硫酸錳0. 25g/L，瓊脂17g/L)等。 [0011] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種青貯飼料添加劑。
[0012] 本發(fā)明所提供的青貯飼料添加劑的活性成分為所述乳酸乳球菌乳酸亞種 (Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO ：M 2015255〇
[0013] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種青貯飼料。
[0014] 本發(fā)明所提供的青貯飼料中含有所述青貯飼料添加劑。
[0015] 所述乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255或所述菌劑在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0016] (al)抑制細(xì)菌；
[0017] (a2)制備細(xì)菌抑制劑；
[0018] (a3)制備所述青貯飼料添加劑；
[0019] (a4)制備所述青貯飼料。
[0020] 所述（al)的應(yīng)用為非疾病診斷或治療的應(yīng)用。
[0021] 在所述（al)和所述（a2)中，所述細(xì)菌具體可為藤黃微球菌和/或沙門氏菌。
[0022] 其中，所述乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255或所述菌劑對所述細(xì)菌的抑制具體為30°C條件下的抑制。
[0023] 所述青貯飼料添加劑在制備所述青貯飼料中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024] 本發(fā)明的第五個目的是提供一種制備所述青貯飼料的方法。
[0025] 本發(fā)明所提供的制備所述青貯飼料的方法，具體可包括：將青貯原料與所述乳酸 乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255混合， 進(jìn)行固體厭氧發(fā)酵，收集所有發(fā)酵產(chǎn)物，得到所述青貯飼料；
[0026] 在本發(fā)明中，所述青貯原料為小麥秸桿；具體為乳熟期小麥秸桿，水分含量 73. 27%，切割成l-2cm小段。
[0027] 在所述方法中，所述小麥稻桿和所述乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255 的配比可為 100g :105cfu ;所述發(fā)酵為低溫發(fā) 酵；所述低溫可為5°C ;所述發(fā)酵的時間可為30天。
[0028] 本發(fā)明所提供的乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC Ν0:Μ 2015255具有耐低溫、耐鹽、耐酸堿等抗逆性，并在低溫青貯（5°C )過 程中迅速繁殖并產(chǎn)酸降PH，有效的抑制有害雜菌的生長或產(chǎn)生，粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維 等營養(yǎng)成分有效保留，達(dá)到長期保存青貯飼料的效果。
[0029] 保藏說明
[0030] 菌種名稱：乳酸乳球菌乳酸亞種
[0031] 拉丁名：（Lactococcus lactis subsp. lactis)
[0032] 菌株編號：QH1-666
[0033] 保藏機(jī)構(gòu)：中國典型培養(yǎng)物保藏中心
[0034] 保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CCTCC
[0035] 地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學(xué)校內(nèi)武漢大學(xué)保藏中心
[0036] 保藏日期：2015年4月28日
[0037] 保藏中心登記入冊編號：CCTCC NO :M 2015255
【具體實施方式】
[0038] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0039] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040] 實施例 1、乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666 的 分離與鑒定
[0041] 一、菌株QH1-666的分尚與篩選
[0042] 取中國青海省明察縣城油菜10g，放入90mL無菌水，震蕩10秒，吸取ImL液體放 于I. 5mL離心管，依次稀釋101，103, IO5倍，取稀釋液體20 μ L分別涂布到MRS瓊脂培養(yǎng)基 上，30°C厭氧培養(yǎng)48小時，取單菌落MRS固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，將獲得的其中一株菌編號為 QH1-666。
[0043] 其中，所述MRS固體培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下：蛋白胨10g/L，牛肉膏 10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，三水合乙酸鈉5g/L，吐溫801g/L，磷酸氫二鉀2g/L，檸檬 酸銨2g/L，硫酸鎂2g/L，硫酸錳0. 25g/L，瓊脂17g/L。
[0044] 二、菌株QH1-666的鑒定
[0045] 從以下幾個方面對步驟一分離并篩選得到的菌株QH1-666進(jìn)行鑒定。
[0046] 1、形態(tài)學(xué)鑒定
[0047] 步驟一分離并篩選得到的菌株QH1-666單菌落革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察單菌 落形狀呈圓形。
[0048] 2、生理生化特征鑒定
[0049] 步驟一分離并篩選得到的菌株QH1-666革蘭氏染色陰性，不產(chǎn)過氧化氫，不能夠 發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣，為同型發(fā)酵。
[0050] 利用API 50CH檢測菌株QH1-666對不同碳源的發(fā)酵情況。結(jié)果如表1所不?？?見，菌株QH1-666可以利用苦杏仁戒，熊果苷，七葉靈，水楊苷，纖維二糖，麥芽糖，乳糖，葡 萄糖，核糖，果糖，L-樹膠醛醣，蔗糖，蜜二糖，海藻糖，D-木糖，半乳糖，甘露糖，甘露醇做碳 源進(jìn)行發(fā)酵；不能利用D-來蘇糖，D-阿拉伯糖醇，糖原，木糖醇，松三糖，山梨醇，D-阿拉伯 糖，L-阿拉伯糖，纖維糖，L-木糖，核糖醇，山梨糖，半乳糖醇，β -甲基-木糖苷，甘油，赤蘚 糖醇，2-酮