一種快速鑒別胎兒彎曲菌和性病亞種的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種快速鑒別胎兒彎曲菌和性病亞種的方法和試劑盒。該方法通過以待檢樣品的基因組DNA為模板，在qPCR反應(yīng)體系中還加入如SEQ?ID?NO.1、2、4和5所示的引物和如SEQ?ID?NO.3和6所示的探針進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR，Ct值<35為陽性；35～40為可疑，需要重復(fù)試驗(yàn)一次；>40為陰性。實(shí)現(xiàn)該方法的試劑盒主要包括上述引物和探針。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：能極大地縮短檢測(cè)時(shí)間，只需要1天時(shí)間即可完成整個(gè)檢測(cè)；操作更加簡(jiǎn)單，只需要提取核酸和熒光PCR，無需額外操作；一次性能對(duì)待檢樣品進(jìn)行胎兒彎曲菌和性病亞種的定性和定量檢測(cè)；靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
【專利說明】一種快速鑒別胎兒彎曲菌和性病亞種的方法和試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種快速鑒別胎兒彎曲菌和性病亞種的方法和試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]胎兒彎曲菌是一類革蘭染色陰性、氧化酶陽性、觸媒陽性、呈逗點(diǎn)或S形彎曲、動(dòng)力活潑、嗜微需氧菌的人獸共患傳染病病原體。胎兒彎曲菌常定居在野生動(dòng)物、家禽、家畜及寵物的腸道或泌尿生殖道內(nèi)，通過“糞-口”途徑的方式感染人類，常導(dǎo)致人類腸外感染，如菌血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、蜂窩組織炎、動(dòng)脈瘤感染等疾病。胎兒彎曲菌可分為胎兒亞種和性病亞種，性病亞種常存在于動(dòng)物生殖道中，通過交配和人工授精等傳播，常導(dǎo)致牛羊不育、流產(chǎn)和生殖道炎癥。目前，胎兒彎曲菌國(guó)內(nèi)有《GB/T18653-2002》對(duì)綿羊、牛的冷凍精液中胎兒彎曲菌的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，這種方法僅適用于液體樣品，對(duì)固體樣品具有一定局限性；同時(shí)，彎曲菌培養(yǎng)條件苛刻、生長(zhǎng)緩慢，從培養(yǎng)到生化鑒定需要7~9天，會(huì)延誤相應(yīng)的診斷和治療；再者，彎曲菌培養(yǎng)操作繁瑣，需要微需氧環(huán)境，培養(yǎng)到生化鑒定需要8種培養(yǎng)基，進(jìn)行10次試驗(yàn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種快速鑒別胎兒彎曲菌和性病亞種的方法。
[0004]本發(fā)明的另一目的在于提供實(shí)現(xiàn)上述方法的試劑盒。
[0005]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種快速鑒別胎兒彎曲菌和性病亞種的方法，包括如下步驟:
[0006](I)設(shè)計(jì)雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物和探針:
[0007]①胎兒彎曲菌的檢測(cè)引物和探針:
[0008]Sap-F:5’ -GGTGGAGAATTTACTGATAG-3’ ；
[0009]Sap-R:5，-GCCTTAGCCTCAAATATAG-3，；
[0010]Sap-P:5’ -FAM-TTAGACTCAGCACTACCGCCATT-BHQ1-3，；
[0011]②胎兒彎曲菌性病亞種檢測(cè)引物:
[0012]Par-F:5’ -GTGGATCGGCATCTACTA-3’ ；
[0013]Par-R:5’ -ATCGCAATCTGCAATGAA-3’ ；
[0014]Par-P:5’ -HEX-TATCATCGCCGACGAGTGCC-BHQ1-3’ ；
[0015](2)提取待檢樣品中的基因組DNA ;
[0016](3)以步驟⑵得到的基因組DNA為模板，加入步驟(1)的引物和探針，進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR;
[0017](4)結(jié)果判斷:Ct值〈35為陽性；35~40為可疑，需要重復(fù)試驗(yàn)一次；>40為陰性；
[0018]步驟⑵中所述的待檢樣品包括糞便、生殖道涂抹物和血液；
[0019]步驟(2)中所述的待檢樣品可通過常規(guī)方法得到基因組DNA，如通過相應(yīng)的基因組試劑盒提取基因組DNA ；
[0020]步驟⑵中所述的待檢樣品優(yōu)選經(jīng)過增菌，再進(jìn)行基因組DNA的提?。?br> [0021]步驟(3)中所述的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的體系優(yōu)化為:qPCR MIX(2.5X) 10μ L、引物 Sap-F(1nM) 1.25 μ L、弓 I 物 Sap-R(1nM) 1.25 μ L、弓 I 物 Par-F(1nM) 1.25 μ L、弓 I 物Par-R(1nM) 1.25 μ L、探針 Sap-P (1nM) 0.5 μ L、探針 Par-P (1nM) 0.5 μ L、EnchancerSolut1n (增強(qiáng)劑，20 X) 1.25 μ L、模板DNA5 μ L，無菌水補(bǔ)足至25 μ L ；
[0022]步驟⑶中所述的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的條件優(yōu)選為:95°C 2min ；95°C 10s、56°C 30s, 40個(gè)循環(huán)；在退火階段接受熒光信號(hào)；
[0023]步驟(4)中所述的陽性的解讀如下:只出現(xiàn)sap擴(kuò)增產(chǎn)物，表示待檢樣品含有胎兒彎曲菌胎兒亞種；若同時(shí)出現(xiàn)sap擴(kuò)增產(chǎn)物和par擴(kuò)增產(chǎn)物，比較FAM曲線和HEX曲線的ct值，若兩者Ct值相同時(shí)，待檢樣品只含胎兒彎曲菌性病亞種，若兩者Ct值不同時(shí)，待檢樣品含有胎兒彎曲菌胎兒亞種和性病亞種；
[0024]實(shí)現(xiàn)上述快速鑒別胎兒彎曲菌和性病亞種的方法的試劑盒，包括如下引物和探針:
[0025]Sap-F:5’ -GGTGGAGAATTTACTGATAG-3’ ；
[0026]Sap-R:5，-GCCTTAGCCTCAAATATAG-3，；
[0027]Sap-P:5’ -FAM-TTAGACTCAGCACTACCGCCATT-BHQ1-3，；
[0028]Par-F:5，-GTGGATCGGCATCTACTA-3，；
[0029]Par-R:5，-ATCGCAATCTGCAATGAA-3，；
[0030]Par-P: 5，-HEX-TATCATCGCCGACGAGTGCC-BHQ1-3，；
[0031]所述的試劑盒還包括陽性對(duì)照；
[0032]所述的陽性對(duì)照為胎兒彎曲菌的Sap基因或含有胎兒彎曲菌Sap基因的核酸序列；以及胎兒彎曲菌性病亞種的Par基因或含有胎兒彎曲菌性病亞種Par基因的核酸序列；
[0033]所述含有胎兒彎曲菌Sap基因的核酸序列優(yōu)選為將胎兒彎曲菌Sap基因和克隆載體重組得到的質(zhì)粒；
[0034]所述含有胎兒彎曲菌性病亞種Par基因的核酸序列優(yōu)選為將胎兒彎曲菌性病亞種Par基因和克隆載體重組得到的質(zhì)粒；
[0035]所述的試劑盒還含有qPCR所用的酶、緩沖液和增強(qiáng)劑等。
[0036]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0037](I)本發(fā)明提供的方法和試劑盒，能極大地縮短檢測(cè)時(shí)間，只需要I天時(shí)間即可完成整個(gè)檢測(cè)。
[0038](2)操作更加簡(jiǎn)單，只需要提取核酸和熒光PCR，無需額外操作。
[0039](3) 一次性能對(duì)待檢樣品進(jìn)行胎兒彎曲菌和性病亞種的定性和定量檢測(cè)。
[0040](4)靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1是Sap-陽性克隆標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0042]圖2是Par-陽性克隆標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0043]圖3是Sap-陽性克隆的靈敏度檢測(cè)結(jié)果圖。
[0044]圖4是Par-陽性克隆的靈敏度檢測(cè)結(jié)果圖。
[0045]圖5是特異性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線圖；其中，曲線I是胎兒彎曲菌胎兒亞種ATCC27374，曲線2是胎兒彎曲菌性病亞種ATCC19438，曲線3是胎兒彎曲菌性病亞種ATCC19438。
[0046]圖6是對(duì)比例I的擴(kuò)增曲線圖。
[0047]圖7是對(duì)比例2的擴(kuò)增曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0048]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0049]實(shí)施例1:
[0050](I)設(shè)計(jì)雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物和探針:
[0051]①胎兒彎曲菌的檢測(cè)引物和探針:
[0052]Sap-F:5’ -GGTGGAGAATTTACTGATAG-3’ ；
[0053]Sap-R:5，-GCCTTAGCCTCAAATATAG-3，；
[0054]Sap-P:5’ -FAM-TTAGACTCAGCACTACCGCCATT-BHQ1-3，；
[0055]以胎兒彎曲菌為模板，通過引物Sap-F和Sap-R擴(kuò)增得到的產(chǎn)物的長(zhǎng)度為137bp ；Sap-P 為 Taqman 探針。
[0056]②胎兒彎曲菌性病亞種檢測(cè)引物:
[0057]Par-F:5’ -GTGGATCGGCATCTACTA-3’ ；
[0058]Par-R:5，-ATCGCAATCTGCAATGAA-3，；
[0059]Par-P: 5，-HEX-TATCATCGCCGACGAGTGCC-BHQ1-3 ’ ；
[0060]以胎兒彎曲菌性病亞種為模板，通過引物Par-F和Par-R擴(kuò)增得到的產(chǎn)物的長(zhǎng)度為 112bp ； Par-P 為 Taqman 探針。
[0061](2)陽性質(zhì)粒的制備
[0062]I)通過細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)，按說明書的操作，分別抽提胎兒彎曲菌(ATCC27374)和胎兒彎曲菌性病亞種(ATCC19438)的基因組DNA。
[0063]2)以Sap-F和Sap-R為引物對(duì)，以胎兒彎曲菌(ATCC27374)的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR ；以Par-F和Par-R為引物對(duì)，以胎兒彎曲菌性病亞種(ATCC19438)的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR。PCR擴(kuò)增條件為:預(yù)變性95°C 5min ;變性95°C 20sec、退火55°C 30sec、延伸72°C lmin，30個(gè)循環(huán)；終延伸72°C 5min。PCR擴(kuò)增體系為:基因組DNA 2 μ L、引物對(duì)(濃度分別為ΙΟμ mol/L)各lyL、PCR MIX (天根生化科技公司)25 μ L，雙蒸水補(bǔ)足至50 μ L。將得到的PCR產(chǎn)物通過2 %的瓊脂糖凝膠電泳(100V，70min)分離，通過DNA凝膠回收試劑盒(Invitrogen Purelink0Quick Gel Extract1n Kit)回收，分別得到 Sap 片段(137bp)和 Par 片段(112bp)。
[0064]3)將步驟2)得到的Sap片段(137bp)和Par片段(112bp)分別末端平端化，再與平末端載體連接，具體如下:目的片段(Sap片段或Par片段)3 μ L,2XReact1nBuffer5μ L，DNA平端化酶0.5μ L，加水補(bǔ)足8.5μ L ；70°C反應(yīng)5min，放在冰上冷卻，再加入pZeroBack/blunt載體(2974bp,天根生化科技公司)I μ L和T4連接酶(天根生化科技公司)0.5yL，于22°C反應(yīng)5min。反應(yīng)結(jié)束后，置于冰上。
[0065]4)將步驟3)得到的連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技公司)中，將轉(zhuǎn)化液涂布于含100μ g/ml氨芐青霉素的LB平板上，得到初步篩選得到的克隆；接著通過菌落PCR對(duì)初步篩選得到的克隆進(jìn)行復(fù)篩，反應(yīng)條件同步驟2);將復(fù)篩陽性的克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，經(jīng)上海美吉生物(廣州)公司測(cè)序確定，分別得到Sap-陽性克隆和Par-陽性克隆。
[0066]Sap-陽性克隆含如下序列(劃?rùn)M線部分為目的序列):
[0067]GCGAACTCGATGGCTCGAGTTTTAGCAGATGGTGGAGAATTTACTGATAGTAAGGGTAATGTTATTAATGTTGCTAGTTTAAGCAAGGGTGATTTMTAGGTGCTATGATTGACTCTATGGTTAATGGTGGTAGTGCTGAGTCTAAGGCTATATTTGAGGCTAAGGCATCTTTCTAGAAGATCTCCTACAATATTCTCAGCTGCCATGGAAAATCGATGTTCTTAAAAT ；
[0068]Par-陽性克隆含如下序列(劃?rùn)M線部分為目的序列):
[0069]CGTATTGTAGAGACTTCTAGATGATGTGGATCGGCATCTACTAAAAGCGTATCATCGCCGACGAGTGCCAGCTTTATGGCTAAATTTATGGCGATATTTGTTTTGCCGCTACCGCCTTTTTCATTGCAGATTGCGATATCTTGCTGAAAAACTCGAGCCATCCGGAAGATCTGGCGGCCGCTCTCCCTATAGTGAGTCGA。
[0070]經(jīng)Blast證實(shí):重組的堿基沒有變異和缺失。
[0071](3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0072]I)使用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提得到Sap-陽性克隆質(zhì)粒(3111bp)和Par-陽性克隆質(zhì)粒(3086bp)。經(jīng)Eppendorf核酸蛋白分析儀檢測(cè)，Sap-陽性克隆質(zhì)粒和Par-陽性克隆質(zhì)粒溶液在260nm的吸光度值分別為0.0228ng/L、0.0317ng/L ;經(jīng)如下公式計(jì)算其相應(yīng)的質(zhì)?？截悵舛葹?.3 X 1ltl拷貝/ μ L，4.7 X 1ltl拷貝/yL。
[0073]

【權(quán)利要求】
1.一種快速鑒別胎兒彎曲菌和性病亞種的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)設(shè)計(jì)雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物和探針: ①胎兒彎曲菌的檢測(cè)引物和探針:
Sap-F:5’ -GGTGGAGAATTTACTGATAG-3’ ；
Sap-R:5，-GCCTTAGCCTCAAATATAG-3，；
Sap-P:5’ -FAM-TTAGACTCAGCACTACCGCCATT-BHQ1-3’ ； ②胎兒彎曲菌性病亞種檢測(cè)引物:
Par-F:5’ -GTGGATCGGCATCTACTA-3’ ；
Par-R:5’ -ATCGCAATCTGCAATGAA-3’ ；
Par-P:5’ -HEX-TATCATCGCCGACGAGTGCC-BHQ1-3’ ； (2)提取待檢樣品中的基因組DNA； (3)以步驟⑵得到的基因組DNA為模板，加入步驟⑴的引物和探針，進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR ； (4)結(jié)果判斷:Ct值〈35為陽性；35~40為可疑，需要重復(fù)試驗(yàn)一次；>40為陰性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速鑒別胎兒彎曲菌和性病亞種的方法，其特征在于:步驟(2)中所述的待檢樣品為糞便、生殖道涂抹物或血液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速鑒別胎兒彎曲菌和性病亞種的方法，其特征在于:步驟(3)中所述的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的體系為:2.5倍濃度的qPCR MIXlO μ L、濃度為1nM的引物Sap-F 1.25 μ L、濃度為1nM的引物Sap-R 1.25 μ L、濃度為1nM的引物Par-F1.25 μ L、濃度為1nM的引物Par-R 1.25 μ L、濃度為1nM的探針Sap-P 0.5 μ L、濃度為1nM的探針Par-P 0.5 μ L、20倍濃度的增強(qiáng)劑1.25 μ L、模板DNA 5 μ L，無菌水補(bǔ)足至25 μ L0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速鑒別胎兒彎曲菌和性病亞種的方法，其特征在于:步驟(3)中所述的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的條件為:95°C 2min ；95°C 10s、56°C 30s，40個(gè)循環(huán)；在退火階段接受熒光信號(hào)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速鑒別胎兒彎曲菌和性病亞種的方法，其特征在于:步驟(4)中所述的陽性為:只出現(xiàn)sap擴(kuò)增產(chǎn)物，表示待檢樣品含有胎兒彎曲菌胎兒亞種；若同時(shí)出現(xiàn)sap擴(kuò)增產(chǎn)物和par擴(kuò)增產(chǎn)物，比較FAM曲線和HEX曲線的ct值，若兩者ct值相同時(shí)，待檢樣品只含胎兒彎曲菌性病亞種，若兩者ct值不同時(shí)，待檢樣品含有胎兒彎曲菌胎兒亞種和性病亞種。
6.實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述快速鑒別胎兒彎曲菌和性病亞種的方法的試劑盒，其特征在于包括如下引物和探針:
Sap-F:5’ -GGTGGAGAATTTACTGATAG-3’ ；
Sap-R:5，-GCCTTAGCCTCAAATATAG-3，；
Sap-P:5’ -FAM-TTAGACTCAGCACTACCGCCATT-BHQ1-3’ ；
Par-F:5’ -GTGGATCGGCATCTACTA-3’ ；
Par-R:5’ -ATCGCAATCTGCAATGAA-3’ ；
Par-P:5’ -HEX-TATCATCGCCGACGAGTGCC-BHQ1-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:包括陽性對(duì)照；所述的陽性對(duì)照為胎兒彎曲菌的Sap基因或含有胎兒彎曲菌Sap基因的核酸序列；以及胎兒彎曲菌性病亞種的Par基因或含有胎兒彎曲菌性病亞種Par基因的核酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述含有胎兒彎曲菌Sap基因的核酸序列為將胎兒彎曲菌Sap基因和克隆載體重組得到的質(zhì)粒； 所述含有胎兒彎曲菌性病亞種Par基因的核酸序列為將胎兒彎曲菌性病亞種Par基因和克隆載體重組得到的質(zhì)粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求6~8任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于:還含有qPCR所用的酶、緩沖液和增強(qiáng)劑。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104178575SQ201410437158
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】侯水平, 吳新偉, 陳守義, 楊智聰 申請(qǐng)人:廣州市疾病預(yù)防控制中心