專利名稱：德氏乳桿菌的降低血膽固醇菌株的制作方法
德氏乳桿菌的降低血膽固醇菌株本發(fā)明涉及具有降低血膽固醇特性的德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii) 新菌株。據(jù)報(bào)道，某些發(fā)酵乳產(chǎn)品可發(fā)揮降低血膽固醇的作用。這些作用尤其依賴于這些產(chǎn)品中屬于某些給定物種的乳酸菌之特定菌株的存在。它們尤其是腸球菌(例如糞腸球菌 (Enterococcus faecium,申請(qǐng) EP0101209)或蒙氏腸球菌(Enterococcus mundtii, PCT 申 it WO 2007/108583))菌株、雙歧桿菌菌株(PCT 申請(qǐng) WO 2007/029773) (Xiao 等，J Dairy Sci，86，2452-61，2003)和乳桿菌菌株。在乳桿菌中，僅在少數(shù)物種中鑒定出降低血膽固醇的菌株，如干酪乳桿菌 (Lactobacillus casei)(Brashears等，J Dairy Sci,81,2103-10,1998 ；Kapila & Sinha, Indian J Med Sci，60，361-70，2006 ;Kawase 等，J Dairy Sci，83，255-63，2000)、發(fā)酵乳桿菌(Laactobacillus fermentum) (Gilliland & Walker, J Dairy Sci, 73,905-11, 1990 ;Pereira 等，Appl Environ Microbiol，69，4743-52，2003)，并且特別是嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)(Gilliland 等，Appl Environ Microbiol,49,377-81, 1985 ；Lin 等，J Dairy Sci,72,2885-99,1989 ；Gilliland & Walker, J Dairy Sci,73, 905-11,1990 ；Gupta 等，Int J Food Microbiol, 29,105-9,1996 ；Anderson & Gilliland, J Am Coll Nutr，18,43-50，1999)。另一方面，乳桿菌的其它種，尤其是德氏乳桿菌至今都被認(rèn)為缺乏降低血膽固醇的作用，所述德氏乳桿菌是在發(fā)酵乳產(chǎn)品生產(chǎn)中最廣泛使用的物種之一，因?yàn)樗褪葻徭溓蚓?Sti^ptococcus thermophilus) 一起構(gòu)成傳統(tǒng)的“酸乳共生”。因此，已表明傳統(tǒng)的酸乳(通過(guò)用德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵而獲得)不具有通過(guò)用嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌(Akalin等，J Dairy Sci，80，2721-5，1997)發(fā)酵所獲得的乳產(chǎn)品以及用長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum) (Xiao 等，J Dairy Sci，86，2452-61， 2003)發(fā)酵所獲得的乳產(chǎn)品的降低血膽固醇的作用。還報(bào)道，對(duì)無(wú)菌小鼠施用德氏乳桿菌誘導(dǎo)糞便膽固醇排泄的降低，但不改變血液或肝臟的膽固醇水平。當(dāng)對(duì)載脂蛋白E缺陷的小鼠(ApoE敲除小鼠)施用德氏乳桿菌時(shí)，沒(méi)有觀察到對(duì)糞便、肝臟或血液膽固醇的作用 (Portugal 等，Braz J Med Biol Res,39，629—35，2006)。本發(fā)明人現(xiàn)已分離出了德氏乳桿菌菌株，出乎意料的是，該菌株具有降低血膽固醇的特性。該菌株還具有在乳中生長(zhǎng)的能力，并具有通常用于酸乳生產(chǎn)的德氏乳桿菌的增殖能力。因此，該菌株可以方便地用于發(fā)酵乳產(chǎn)品的生產(chǎn)，尤其是酸乳的生產(chǎn)。因此，本發(fā)明提供了德氏乳桿菌乳酸亞種(Lactobacillus delbrueckii subspecies lactis)菌株，其于 2007 年 4 月 6 日以編號(hào) 1-3741 保藏于 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)[法國(guó)國(guó)家培養(yǎng)物和微生物保藏中心]，巴黎 Docteur Roux 大街 25 號(hào)。該菌株的特性如下一形態(tài)學(xué)革蘭氏陽(yáng)性微生物，大致為很小的長(zhǎng)粒狀桿菌。一發(fā)酵如下的糖類(結(jié)果來(lái)自API 50 CH strip——API MRS培養(yǎng)基，37°C，48小時(shí)):D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖。本發(fā)明還提供了包含德氏乳桿菌乳酸亞種菌株CNCM 1-3741以及一種或更多種其它乳酸菌菌株的乳酸發(fā)酵劑(ferment)。特別地，所述其它菌株可屬于如下物種嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、干酷乳桿菌干酷亞種(Lactobacillus casei subsp. casei)、干酷乳桿菌鼠 $ H 亞禾中(Lactobacillus casei subsp. rhamnosus) > ΞΕ If lif (Lactobacillus zeae)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌 (Lactobacillus paracasei)、乳月旨乳桿菌(Lactobacillus cremoris)、鼠李糖乳桿菌 (Lactobacillus rhamnosus)、戈氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)、德氏乳桿菌乳酸亞種 (Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis)、德氏季L If 菌德氏亞禾中(Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii)、德氏乳桿菌保力卩禾丨J 亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、噬淀粉乳桿胃(Lactobacillus amylovorus)
Llf lif (Lactobacillus crispatus)
^LIflii (Lactobacillus curvatus)、約氏IL桿菌(Lactobacillus johnsonii)、發(fā)酵IL桿菌、短桿菌(Lactobacillus brevis)、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp. Lactis)、乳酸鏈球菌乳月旨亞禾中(Lactococcus lactis subsp. cremoris)、糞腸球菌、 戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)，雙岐雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、乳酸雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、動(dòng)物雙歧桿菌(Bifdobacterium animalis)、動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacterium animalis sp. lactis)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)。根據(jù)本發(fā)明乳酸發(fā)酵劑的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，將德氏乳桿菌乳酸亞種CNCM 1-3741菌株與德氏乳桿菌保加利亞亞種的至少一種菌株和嗜熱鏈球菌的至少一種菌株相組合。本發(fā)明還提供了制備發(fā)酵產(chǎn)品的方法，該方法的特征是其包括將合適的基質(zhì)與 CNCM 1-3714株或與包含所述菌株的本發(fā)明乳酸發(fā)酵劑一起發(fā)酵。根據(jù)該方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，用于發(fā)酵的所述基質(zhì)是乳或基于乳的基質(zhì)，或植物汁液(果汁和/或蔬菜汁) 或這些基質(zhì)的混合物。本發(fā)明還提供了發(fā)酵產(chǎn)品，尤其是發(fā)酵乳產(chǎn)品，其包含CNCM 1-3741菌株的細(xì)菌和任選地一種或更多種其它乳酸菌菌株的細(xì)菌。根據(jù)本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)品的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，發(fā)酵后，其每毫升包含至少IXlO6 個(gè)CFU (集落形成單位)的CNCM 1-3741菌株細(xì)菌，優(yōu)選至少1 X IO7個(gè)CFU，更優(yōu)選1 X IO7 到 1X10、CFU。本發(fā)明還涉及CNCM 1-3741菌株或包含所述菌株的乳酸發(fā)酵劑或發(fā)酵產(chǎn)品用于獲得誘導(dǎo)血膽固醇水平尤其是LDL膽固醇水平降低的產(chǎn)品的用途。通過(guò)如下對(duì)舉例說(shuō)明CNCM 1-3741菌株降低血膽固醇特性的實(shí)施例的進(jìn)一步描述，對(duì)本發(fā)明的理解會(huì)更加清楚。但是需要清楚理解的是，這些實(shí)施例僅是通過(guò)舉例說(shuō)明本發(fā)明主題的方式給出，其決不對(duì)本發(fā)明的主題構(gòu)成限制。實(shí)施例1 :CNCM 1-3741菌株的體內(nèi)降低血膽固醇作用在載脂蛋白E缺陷(apoE敲除)小鼠體內(nèi)評(píng)價(jià)了攝取CNCM 1-3741菌株(以下也稱為DN 111 244)和作為陽(yáng)性對(duì)照的嗜酸乳桿菌1-2273菌株(在專利EP1251860中描述， 以下也稱為DN 112 001)的作用。1-2273菌株是在體外具有降低血膽固醇活性的菌株，但由于其在乳中的生長(zhǎng)很差而不易于獲得發(fā)酵乳產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)方案如下將9-10周齡的40只apoE敲除小鼠分成4組，每組10只。這些小鼠由 L' Arbresle (法國(guó))的 Charles River 實(shí)驗(yàn)室提供。將所有小鼠通過(guò)管飼法補(bǔ)充28天的富脂飲食—300 μ 1/天的培養(yǎng)物，包含在乳-MRS培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下獲取的6 X IO8個(gè)CFU 的DN 111 244菌株(第1組)；一300 μ 1/天的培養(yǎng)物，包含采用與上述DN 111 244菌株相同的乳-MRS培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下獲取的6 X IO8個(gè)CFU的DN 112 001菌株(第2組)；一300 μ 1/天的對(duì)照乳，其組成如下脫脂乳(對(duì)照組)。DN 112 001和DN 111 244 (CNCM 1-3741)菌株均以MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)。然后將其用乳重懸以獲取含6 X IO8個(gè)細(xì)菌CFU的乳。三組動(dòng)物每天的攝入量相同。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行稱重，在之后的治療過(guò)程中以5天為間隔進(jìn)行稱重。各組之間未觀察到顯著差異。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)和治療28天后測(cè)定血漿總膽固醇水平和LDL膽固醇水平。血漿脂質(zhì)測(cè)定結(jié)果參見(jiàn)

圖1和2。這些結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)28天的處理，第1組和第2組的動(dòng)物與對(duì)照組的動(dòng)物相比，總膽固醇和LDL膽固醇(“不良”膽固醇)降低。實(shí)施例2. =CNCM 1-3741菌株的乳生長(zhǎng)采用如下方案來(lái)檢測(cè)CNCM 1-3741菌株的乳生長(zhǎng)特性在重構(gòu)的脫脂乳(120g脫脂乳粉溶于IL蒸餾水，補(bǔ)充2g/L的酵母提取物)制成的培養(yǎng)基中接種CNCM 1-3741菌株或與之對(duì)比的德氏乳桿菌保加利亞亞種CNCM 1-1519菌株(描述于申請(qǐng)EP 0858501中，其具有常規(guī)發(fā)酵特性)。通過(guò)持續(xù)地控制生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH測(cè)定菌株的與其生長(zhǎng)相關(guān)的發(fā)酵活性。結(jié)果參見(jiàn)圖3。這些結(jié)果表明，CNCM 1-3741菌株能夠在乳中有效地生長(zhǎng)，因而，該菌株可用于生產(chǎn)發(fā)酵乳產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.德氏乳桿菌乳酸亞禾中(Lactobacillusdelbrueckii subspecies lactis)菌株，于2007年4月6日以編號(hào)1-3741保藏于法國(guó)國(guó)家培養(yǎng)物和微生物保藏中心(CNCM， Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)0
2.乳酸發(fā)酵劑，其包含權(quán)利要求1的德氏乳桿菌乳酸亞種菌株，所述菌株與一種或更多種其它乳酸菌菌株相組合。
3.權(quán)利要求2的乳酸發(fā)酵劑，其特征為所述其它乳酸菌菌株選自屬于如下物種的菌株德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii bulgaricus)和嗜熱鏈球菌 (Streptococcus thermophilus)。
4.包含CNCM1-3741菌株細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)品。
5.CNCM 1-3741菌株用于獲得引起血膽固醇水平尤其是LDL膽固醇水平降低的產(chǎn)品的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有降低血膽固醇特性的德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)新菌株，及其用于生產(chǎn)降低血膽固醇的發(fā)酵產(chǎn)品(尤其是乳產(chǎn)品)的用途。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102216444SQ200980146151
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2009年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月19日
發(fā)明者克里斯特勒·蓋伊, 凱瑟琳·尼科勒, 弗洛倫特·拉蘭納, 艾格尼絲·默尼耶, 阿特姆·赫列布尼科夫 申請(qǐng)人:達(dá)能日爾維公司