專利名稱：：中國倉鼠卵巢細胞系的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物技術和分子生物學領域。本發(fā)明具體涉及中國倉鼠卵巢細胞系及其在重組蛋白表達中的用途。
背景技術：
：蛋白質可用于多種診斷的、藥理學的、農業(yè)的、營養(yǎng)的和研究的應用。由于生產蛋白質尤其是治療性蛋白質成本高，因此在生產效率或者蛋白質的功能和穩(wěn)定性方面即使微小的提高仍可有價值。蛋白質的功能和穩(wěn)定性以及因此的效用可受到糖殘基翻譯后加至所述蛋白質從而形成糖蛋白的影響。例如，將末端唾液酸殘基加至附著于糖蛋白的多糖通常會增加蛋白質在血液中的壽命，在某些情況下還會影響溶解度、熱穩(wěn)定性、對蛋白酶攻擊的抗性、抗原性和一些糖蛋白的比活。參見例如GuandWang(1998),Biotechnol.andBioeng.58(6)642-48；Morelletal.(1968),J.Biol.Chem.243(1):155_59。由細胞系例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生的重組糖蛋白蛋白質和藥物主要由不同唾液酸化的同工型構成。唾液酸化不良的同工型具有更短的循環(huán)半衰期，因此效能較低。因此需要增加糖蛋白的唾液酸含量，特別是對于要用于藥理學應用的糖蛋白。事實上，生物
技術領域：
中的主要研究焦點之一已經是如何增加重組蛋白質藥物的唾液酸化。
發(fā)明內容根據本發(fā)明的第1方面，本發(fā)明人提供了中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，所述細胞與野生型中國倉鼠卵巢細胞相比能夠實現更高的蛋白質唾液酸化，其中所述CHO細胞通過以蓖麻(Ricinuscommunis)凝集素I(RCA-I)進行選擇而獲得。所述CHO細胞能夠在存在功能性GnT1的情況下實現更高的唾液酸化。所述CHO細胞可包含GnT1基因突變。GnT1基因突變可包括一種或多種在GnT1序列(GenBank登記號AF343963)的規(guī)定位置的如下突變(a)在位置1015處C轉換成T；(b)在位置1300處G顛換成C；(c)在位置638處A顛換成C；(d)在位置784處C顛換成G；(e)在位置811處T顛換成A；(f)致使所編碼的氨基酸序列從位置236開始移碼的在位置706處的插入；(g)在位置1015處C轉換成T；(h)在位置246處G轉換成A；⑴在位置258處G轉換成A；(j)在位置859處A轉換成T。GnT1基因可包含顯示于SEQIDNO:1中的GnT1核酸序列。所述CHO細胞可表達包含一種或多種在GnT1序列(GenBank登記號AF343963)的規(guī)定位置的如下突變的GnT1蛋白質(a)在位置434處Ala突變?yōu)镻ro；(b)在位置213處Asp—Ala；(c)在位置262處Arg—Gly;(d)在位置271處Trp—Arg；(e)由在編碼GnT1核酸序列位置706處的插入導致的從位置236開始的移碼；(f)在位置339處Gln—STOP；(g)在位置82處Trp—STOP；(h)在位置86處Trp—STOP；(i)在位置287Lys—STOP。所述CHO細胞可表達如SEQIDNO2中所示的GnT1蛋白質。所述CHO細胞可包含編碼目的蛋白質例如重組目的蛋白質的核酸序列。所述目的蛋白質可包括促紅細胞生成素(EPO)或干擾素-Y(IFN-γ)。所述CHO細胞可包含編碼功能性GnT1的核酸序列。編碼目的蛋白質的核酸序列和編碼功能性GnT1的核酸序列可以包含在一個表達載體中。編碼目的蛋白質的核酸序列和編碼功能性GnT1的核酸序列可以被穩(wěn)定地轉染至所述CHO細胞中。根據本發(fā)明的第2方面，提供了包含根據本發(fā)明第1方面的CHO細胞的CHO細胞系。所述CHO細胞系可包括JW152細胞系(根據布達佩斯條約以登記號PTA-9657保藏于ATCC)、JW80細胞系、JW36細胞系、KFC15002細胞系、KFC15071細胞系、KFC5008細胞系、JW152細胞系、KFC5026細胞系、KFC20011細胞系或KFC15047細胞系?？梢允顾鯟HO細胞或CHO細胞系適應懸浮培養(yǎng)。根據本發(fā)明的第3方面，本發(fā)明人提供了由根據本發(fā)明第1或2方面的CHO細胞或CHO細胞系表達的重組蛋白質。所述重組蛋白質可包括促紅細胞生成素(EPO)或干擾素-Y(IFN-γ)。所述重組蛋白質的pKa可為4或更小，3.5或更小，3或更小，2.5或更小，或者2或更小，或者其Z-值可大于150，例如大于160，大于170，大于180，例如大于190，大于200，大于210，例如大于220或大于230，或者以上兩種情況同時滿足。本發(fā)明的第4方面提供了表達重組蛋白質的方法，所述方法包括將編碼所述蛋白質的核酸導入上文列出的CHO細胞，使所述蛋白質從所述CHO細胞或其后代表達，并任選地純化所述蛋白質。所述方法可包括將編碼功能性GnT1的核酸導入所述CHO細胞。所述方法可包括導入包含編碼所述蛋白質的核酸序列和編碼功能性GnT1的核酸序列的表達載體。所述方法可包括穩(wěn)定地轉染編碼目的蛋白質的核酸序列和編碼功能性GnT1的核酸序列。根據本發(fā)明的第5方面，本發(fā)明人提供了包含以下序列的核酸SEQIDNO1中所示的序列，或包含GnT1序列和表Dl第2列所列突變的序列，或者其變體、同源物、衍生物或片段。在第6方面中，本發(fā)明提供了包含以下序列的多肽如SEQIDNO:2中所示的序列，或包含GnT1序列和表Dl第3列所列突變的序列，或者其變體、同源物、衍生物或片段。在本發(fā)明第7方面中，提供了提供CHO細胞或細胞系的方法，所述方法包括在存在蓖麻凝集素I(RCA-I)的情況下培養(yǎng)CHO細胞，并選擇培養(yǎng)中存活的細胞。所述方法可包括在存在蓖麻凝集素I(RCA-I)的情況下培養(yǎng)CHO細胞，并選擇培養(yǎng)中存活的細胞。所述方法可包括將所述CHO細胞暴露于濃度為0.1μg/ml至100μg/ml，例如上至50μg/ml或上至20μg/ml，例如10μg/ml或5μg/ml的RCA-1。所述方法可包括將所述CHO細胞暴露于RCA-I達1小時、數小時(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小時)、過夜，至數日例如2天或3天，例如過夜。所述方法還可包括，選擇在凝集試驗中不與RCA-I反應的細胞。根據本發(fā)明的第8方面，本發(fā)明人提供了可通過上文列出的方法得到的CHO細胞或CHO細胞系。除非另外指出，否則本發(fā)明的實施將運用化學、分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規(guī)技術，這些是本領域普通技術人員的能力所能及的。這些技術在文獻中有說明。例如，參見J.Sambrook，E.F.Fritsch，andΤ.Maniatis，1989，MolecualrCloningALaboratoryManual,SecondEdition,Books1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel,F.Μ.etal.(1995andperiodicsupplements；CurrentProtocolsinMolecularBiology,ch.9,13,and16,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree,andA.Kahn,1996,DNAIsolationandSequencing:EssentialTechniques,JohnWiley&Sons;J.M.PolakandJames0'D.McGee,1990,InSituHybridizationPrinciplesandPractice；OxfordUniversityPress；M.J.Gait(Editor),1984,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IrlPress；D.Μ.J.LilleyandJ.E.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymology:DNAStructurePartA:SynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress；UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7)；Antibodies:ALaboratoryManualbyEdHarlow(Editor),DavidLane(Editor)(1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2)，1855.HandbookofDrugScreening,editedbyRamakrishnaSeethala,PrabhavathiB.Fernandes(2001,NewYork,NY,MarcelDekker,ISBN0-8247-0562-9)；和LabRef:AHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,EditedJaneRoskamsandLindaRodgers，2002，ColdSpringHarborLaboratory，ISBN0_87969_630_3。用t本的每一篇都通過引用的方式納入本文。圖1的照片顯示，在JW152細胞系中短暫表達的促紅細胞生成素(EPO)對內切糖苷酶H(EndoH)處理是敏感的。短暫表達的EPO的蛋白質印跡來自CHOK-I細胞(第1道)、來自JW152細胞(第2道)、經內切糖苷酶H處理的來自CHO-Kl的EPO(第3道)、經內切糖苷酶H處理的來自JWl52的EPO(第4道)。JWl52表達的EPO對EndoH處理敏感，這表明存在于EPO分子上的聚糖結構為高甘露糖型。因此懷疑來自糖基化通路的前期部分的基因有缺陷。圖2的照片顯示，JW152細胞缺少功能性GnTI基因。通過IEF/蛋白質印跡測定來分析重組ΕΡ0。最左側的道(CHOWT)顯示作為對照的野生型CHO細胞表達的ΕΡ0。第二道顯示由JW152細胞產生的ΕΡ0。通過比較兩條道，可明顯看出JW152細胞中的糖基化不完全。對于補償試驗，將多個糖基化相關基因(如標明的)中的每一個與EPO構建體共轉染至JW152細胞中。僅GnTI能夠補償JW152細胞中的遺傳缺陷，表明這些細胞缺乏功能性GnTI基因。來自該IEF結果的另一非常重要的現象是，在存在GnTI的情況下，JW152細胞比野生型細胞對EPO的唾液酸化好得多。圖3的照片顯示，以GnTI共轉染后，在JW152而非CHO-Kl中觀察到了唾液酸化的提高。CH0-K1、共表達GnTI的CHO-Kl中產生的EPO的唾液酸化模式。JW152細胞中和共表達GnTI的JW152細胞中產生的ΕΡ0。共表達以及不共表達GnTI的CHO-Kl的EPO唾液酸化模式似乎相同，因此，GnTI的過表達不是第4道中所見的唾液酸化提高的原因。結果表明，在存在GnTI的情況下，JW152細胞比野生型細胞對重組蛋白質的唾液酸化好得多。以神經氨酸酶——其可切掉唾液酸——處理樣品可導致酸性區(qū)中的EPO帶在切掉唾液酸后縮減至堿性區(qū)，表明更高唾液酸化形式的EPO的確集中在所述凝膠的酸性區(qū)中。圖4的照片顯示，在存在功能性GnTI的情況下，以前公開的Lec1突變體(具有GnTI缺陷)的EPO表達顯示也是高度唾液酸化的。在CHO-Kl、Lec1和功能性GnTI恢復的Lec1中表達的短暫EPO。Lec1以前已經被報道，并且已經被PamelaStanley領導的另一小組使用不同凝集素獨立地分離。圖5的照片顯示，所有9個CHO糖基化突變體——其抗RCA且?guī)в胁煌腉nTI基因突變——均導致不完全的唾液酸化。在JW152、JW36、JW80、KFC5008、KFC5026、KFC15002、KFC15047、KFC15071、KFC2001UCHO-Kl中短暫表達的ΕΡ0。以RCA凝集素選擇的9個CHO糖基化突變體中產生的ΕΡ0，每一所述突變體均帶有不同的導致GnTI功能喪失的GnTI基因突變。與CHO野生型(最右側)相比，在這些細胞系中觀察到不完全的唾液酸化。EPO臨床標準物在最左側。RCA凝集素主要產生GnTI缺陷型突變體。圖6的照片顯示，在恢復GnTI功能后，所有9個CHO糖基化突變體短暫表達比在CHO-Kl中短暫表達的EPO更好地被唾液酸化的ΕΡ0。圖7的照片顯示，GnTI功能恢復的JW152對EPO-Fc融合蛋白質的唾液酸化也比CHO-Kl更好。將在CHO野生型中產生的EPO-Fc融合蛋白質與在恢復前后在JW152中產生的EPO-Fc融合蛋白質比較。結果表明，即使用不同的模型糖蛋白，經恢復的JW152仍保持了較優(yōu)的唾液酸化。圖8的照片顯示，HPAEC色譜圖顯示從在共表達功能性GnTI的JW152細胞中表達的EPO-Fc上切下的更好地唾液酸化的聚糖。使用親和純化通過蛋白A結合的色譜柱來純化在CHO-Kl中和在以GnTI共轉染的JW152中短暫表達的EP0_Fc。通過以肽N_糖苷酶F(PNGaseF)處理將等量EPO-Fc上的聚糖切下，并依照附著于所述聚糖的唾液酸數目使用高pH陰離子交換色譜(HPAEC)分離。所述色譜清楚地顯示，當與CHO-Kl樣品比較時，JW152樣品在4S基團的峰更高，在IS基團的峰更低。箭頭指出內部對照棉子糖。如所示標明樣品圖9的照片顯示由通過RCA-I分離的10個隨機挑取的克隆表達的重組ΕΡ0。上面的凝膠，在10種不同的突變系中表達的ΕΡ0。將細胞以僅表達EPO的構建體轉染。下面的凝膠，在相同系列以PEIG轉染的細胞系中表達的ΕΡ0。該構建體表達EPO和GnTI兩者。圖10的照片顯示在10種不同的JW152克隆中產生的ΕΡ0，所述JW152克隆被表達EPO和GnTI二者的構建體穩(wěn)定轉染。將JW152細胞以被稱為pEIG的構建體轉染。在PEIG中，包含EPO-IRES-GnTI(EIG)的轉錄單元被克隆至pcDNA3.1中CMV啟動子的下游。在轉染后，選擇并挑取穩(wěn)定的克隆。通過IEF/蛋白質印跡測定來分析由10個所述隨機挑取的克隆產生的EPO的唾液酸化模式。結果顯示，由不同的穩(wěn)定的克隆產生的所有EPO樣品是高度唾液酸化的。這意味著，在存在功能性GnTI的情況下，在穩(wěn)定表達EPO時，可維持更好的唾液酸化。圖11的照片顯示，CHO-Kl中EPO的穩(wěn)定表達顯示出比GnTI功能恢復的JW152的唾液酸化譜更差的唾液酸化譜。將CHO-Kl細胞以包含EPO編碼序列的表達載體轉染并進行選擇。分離克隆，并且以IEF分析來自9個隨機選擇的穩(wěn)定克隆的ΕΡ0。結果表明，由不同的穩(wěn)定的克隆產生的所有EPO樣品的總體唾液酸化均不同，但總的說來，其唾液酸化不及圖10中的EPO樣品。圖12的照片顯示4個JW152穩(wěn)定細胞系中產生的ΕΡ0，已使所述細胞系適應無蛋白質培養(yǎng)基中的懸浮成批培養(yǎng)。在貼壁培養(yǎng)中的穩(wěn)定JW152細胞系中觀察到的唾液酸化模式在懸浮培養(yǎng)中得以保持。序列表SEQIDNO:1是CHOJff152細胞的N-乙酰葡糖胺轉移酶IcDNA的核酸序列。SEQIDNO:2是由SEQIDNO1編碼的N-乙酰葡糖胺轉移酶I的氨基酸序列。具體實施例方式本發(fā)明人已經使用細胞毒性凝集素RCA-I從CHO-Kl細胞分離出了新的CHO突變細胞系JW152。由被EPO和GnTIcDNA穩(wěn)定轉染的JW152細胞產生的重組EPO包含高度唾液酸化的同工型。已使這些穩(wěn)定轉染的細胞系中的幾種已適應懸浮培養(yǎng)，并且在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過IEF測定來分析這些細胞產生的ΕΡ0。結果表明，無血清培養(yǎng)基中產生的EPO保持高度唾液酸化。這些結果表明，JW152細胞有可能成為用于產生蛋白質例如高度唾液酸化的蛋白質(包括糖蛋白藥物)的宿主細胞系。細胞系JW152在2008年12月11日以作為按照關于用于專利程序的微生物菌種保藏的國際承認的布達佩斯條約的國際保藏編號的登記號PTA-9657保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection),10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209,UnitedStatesofAmerica。因此，本發(fā)明人提供了與野生型中國倉鼠卵巢細胞相比能夠實現更高的蛋白質唾液酸化的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或細胞系。能夠實現更高唾液酸化的CHO細胞可以通過合適的選擇方法例如RCA-I選擇方法產生。所述方法更詳細地記載于下文“CH0細胞和細胞系”中。因此，RCA-I可用于分離在存在GnTI的情況下產生高度唾液酸化的重組蛋白質的CHO糖基化突變細胞。所述選擇方法因此特別地包括在本文描述的方法和組合物中。因此，本發(fā)明人提供了中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或細胞系，所述細胞或細胞系與野生型中國倉鼠卵巢細胞相比能夠實現更高的蛋白質唾液酸化，所述CHO細胞可通過以蓖麻凝集素I(RCA-I)選擇來獲得?？偟恼f來，本發(fā)明人提供了RCA-I抗性CHO細胞或細胞系，例如RCA-I抗性CHO-Kl細胞或細胞系。遺傳分析已經揭示了JW152細胞中的功能異常N-乙酰葡糖胺轉移酶I(GnTI)基因。對所述突變細胞的GnTIcDNA的分子克隆鑒定出了產生提前終止密碼子的點突變。因此，JW152細胞僅可以合成只有338個氨基酸的截短形式的GnTI蛋白質，而不是包含447個氨基酸的正常蛋白質。本發(fā)明人已經使用RCA-I分離出更多的CHO突變系(約100個克隆)。遺傳分析表明，它們都缺乏功能性GnTI基因。它們中的許多帶有不同的GnTI基因編碼區(qū)點突變，表明它們來自于不同的原始克隆。然而，它們在存在GnTI的情況下都強烈地提高了對重組蛋白質的唾液酸化。這些其他CHO細胞系的GnT1基因突變顯示于下表Dl中。因此，本發(fā)明人提供了中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，所述細胞與野生型中國倉鼠卵巢細胞相比在存在功能性GnT1的情況下能夠實現更高的蛋白質唾液酸化，所述CHO細胞包含GnT1基因突變。本發(fā)明人還提供了中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或細胞系，所述細胞與野生型中國倉鼠卵巢細胞相比能夠實現更高的蛋白質唾液酸化，所述CHO細胞可通過以蓖麻凝集素I(RCA-I)選擇得到并且包含GnT1基因突變。所述GnT1基因突變可包含任何點突變、缺失、倒位等。所述GnT1基因突變可編碼具有部分功能的或無功能的GnT1多肽。所述GnT1基因突變可編碼截短的GnT1多肽。本發(fā)明人提供了包含這些突變CHO細胞系和克隆中每一個的CHO細胞和細胞系。本發(fā)明人提供了由RCA-I選擇得到并且與野生型或天然CHO細胞或者親本細胞相比能夠實現更高的唾液酸化的特定細胞系。本發(fā)明人提供了所述細胞或細胞系中包含的突變CHO核酸和多肽序列，這在下文中進一步詳述。所述CHO細胞或細胞系可包括JW152細胞系。它可包括JW80細胞系。它可包括JW36細胞系。它可包括KFC15002細胞系。它可包括KFC15071細胞系。它可包括KFC5008細胞系。它可包括JW152細胞系。它可包括KFC5026細胞系。它可包括KFC20011細胞系。它可包括KFC15047細胞系。所述CHO細胞或細胞系可以以編碼目的蛋白質例如異源或重組蛋白質的核酸轉染。所述蛋白質可包括糖蛋白。所述CHO細胞或細胞系可以以編碼功能性、全長或野生型GnT1序列的核酸轉染或共轉染。如上文指出的，本發(fā)明人提供了所述核酸本身，例如編碼突變GnT1基因的核酸，或者所述核酸的片段、變體、衍生物或同源物。所述編碼突變GnT1基因的核酸、其片段、變體、衍生物或同源物可導致包含它們的CHO細胞與不包含它們的CHO細胞例如野生型CHO細胞相比能夠實現更高的唾液酸化。編碼突變GnT1基因的核酸可包含如SEQIDN0:1所示的序列或者其變體、同源物、衍生物或片段。SEQIDNO1從CHOJW152細胞分離的N-乙酰葡糖胺轉移酶I(Mgatl，GenBank:AF343963)mRNA的編碼區(qū)。在這些突變細胞中，鑒定出了在位置1015處C至T的點突變(以黑體顯示)ATGCTGAAGAAGCAGTCTGCAGGGCTTGTGCTTTGGGGTGCTATCCTCTTTGTGGGCTGGAATGCCCTGCTGCTCCTCTTCTTCTGGACACGCCCAGCCCCTGGCAGGCCCCCCTCAGATAGTGCTATCGATGATGACCCTGCCAGCCTCACCCGTGAGGTGTTCCGCCTGGCTGAGGACGCTGAGGTGGAGTTGGAGCGGCAGCGGGGGCTGTTGCAGCAAATCAGGGAGCATCATGCTTTGTGGAGACAGAGGTGGAAAGTGCCCACCGTGGCCCCTCCAGCCTGGCCCCGTGTGCCTGCGACCCCCTCACCAGCCGTGATCCCCATCCTGGTCATTGCCTGTGACCGCAGCACTGTCCGGCGCTGCTTGGATAAGTTGTTGCACTATCGGCCCTCAGCTGAGCATTTCCCCATCATTGTCAGCCAGGACTGCGGGCACGAAGAGACAGCACAGGTCATTGCTTCCTATGGCAGTGCAGTCACACACATCCGGCAGCCAGACCTGAGTAACATCGCTGTGCCCCCAGACCACCGCAAGTTCCAGGGTTACTACAAGATCGCCAGGCACTACCGCTGGGCACTGGGCCAGATCTTCAACAAGTTCAAGTTCCCAGCAGCTGTGGTAGTGGAGGACGATCTGGAGGTGGCACCAGACTTCTTTGAGTACTTCCAGGCCACCTACCCACTGCTGAGAACAGACCCCTCCCTTTGGTGTGTGTCTGCTTGGAATGACAATGGCAAGGAGCAGATGGTAGACTCAAGCAAACCTGAGCTGCTCTATCGAACAGACTTTTTTCCTGGCCTTGGCTGGCTGCTGATGGCTGAGCTGTGGACAGAGCTGGAGCCCAAGTGGCCCAAGGCCTTCTGGGATGACTGGATGCGCAGACCTGAGCAGCGGAAGGGGCGGGCCTGTATTCGTCCAGAAATTTCAAGAACGATGACCTTTGGCCGTAAGGGTGTGAGCCATGGGCAGTTCTTTGATCAGCATCTTAAGTTCATCAAGCTGAACCAGtAGTTCGTGTCTTTCACCCAGTTGGATTTGTCATACTTGCAGCGGGAGGCTTATGACCGGGATTTCCTTGCCCGTGTCTATAGTGCCCCCCTGCTACAGGTGGAGAAAGTGAGGACCAATGATCAGAAGGAGCTGGGGGAGGTGCGGGTACAGTACACTAGCAGAGACAGCTTCAAGGCCTTTGCTAAGGCCCTGGGTGTCATGGATGACCTCAAGTCTGGTGTCCCCAGAGCTGGCTACCGGGGCGTTGTCACTTTCCAGTTCAGGGGTCGACGTGTCCACCTGGCACCCCCACAAACCTGGGAAGGCTATGATCCTAGCTGGAATTAG本發(fā)明人還提供了突變GnT1多肽及其片段、變體、衍生物和同源物。所述突變GnT1多肽、片段、變體、衍生物或同源物可導致包含它們的CHO細胞與不包含它們的CHO細胞例如野生型CHO細胞相比能夠實現更高的唾液酸化。所述突變GnT1多肽可包括如SEQIDNO2所示的序列或者其變體、同源物、衍生物或片段。SEQIDNO2由CHOJW152細胞中突變的基因編碼的N-乙酰葡糖胺轉移酶I(GnTI)蛋白質。所述點突變(C1015T)的結果是，JW152細胞僅產生只有338個氨基酸的截短形式的GnTI，而不是包含447個氨基酸的正常蛋白質。黑體的C-末端部分在JW152細胞中不被翻譯。MLKKQSAGLVLWGAILFVGWNALLLLFFWTRPAPGRPPSDSAIDDDPASLTREVFRLAEDAEVELERQRGLLQQIREHHALWRQRWKVPTVAPPAWPRVPATPSPAVIPILVIACDRSTVRRCLDKLLHYRPSAEHFPIIVSQDCGHEETAQVIASYGSAVTHIRQPDLSNIAVPPDHRKFQGYYKIARHYRWALGQIFNKFKFPAAVVVEDDLEVAPDFFEYFQATYPLLRTDPSLWCVSAWNDNGKEQMVDSSKPELLYRTDFFPGLGffLLMAELffTELEPKffPKAFffDDWMRRPEQRKGRACIRPEISRTMTFGRKGVSHGQFFDQHLKFIKLNQqfvsftqldlsylqreaydrdflarvysapllqvekvrtndqkelgevrvqytsrdsfkafakalgvmddlksgvpragyrgwtfqfrgrrvhlappqtwegxdpswn已使圖2中所示的JW152-pEIG穩(wěn)定細胞系中的數個細胞系適應懸浮培養(yǎng)并且在無血清培養(yǎng)基中生長。無血清培養(yǎng)基中產生的EPO保持了高度唾液酸化。本發(fā)明人因此提供了由RCA-I選擇得到的突變CHO細胞和細胞系，已使所述細胞和細胞系適應懸浮培養(yǎng)或者在半固體培養(yǎng)基上生長。總之，本發(fā)明人已經開發(fā)了從CHO細胞分離糖基化突變細胞的新方法。RCA-I處理存活的所有CHO細胞均具有非常類似的特性。首先，它們都缺乏功能性GnTI基因。其次，它們在存在GnTI的情況下對它們的重組蛋白質的唾液酸化比野生型CHO細胞更好。該特征在短暫轉染和穩(wěn)定轉染的細胞中都同樣得以保持。以RCA-I分離的CHO糖基化突變細胞例如JW152細胞可以產生高度唾液酸化的重組糖蛋白，條件是存在GnTI。該方法可用于產生其中唾液酸含量對效力重要的重組糖蛋白。這些蛋白質包括EPO、IEF-Y、因子VIII等。CHO細胞和細胞系本文描述的CHO細胞和細胞系可以通過任何合適的方式制備。例如，所述CHO細胞和細胞系可以通過使用合適凝集劑例如凝集素I的選擇產生。所述凝集素可包括任何合適的凝集素，例如蓖麻凝集素I(RCA-I)。本發(fā)明人因此提供了提供CHO細胞或細胞系的方法，所述方法包括在存在蓖麻凝集素I(RCA-I)的情況下培養(yǎng)CHO細胞，并選擇培養(yǎng)中存活的細胞。本發(fā)明描述的CHO細胞和細胞系可以通過以蓖麻凝集素I(RCA-I)處理起始或親本細胞并選擇所述處理下存活的細胞來制備。可以將所述存活的細胞進一步克隆并制成細胞系。所選擇的細胞和細胞系可包含如本文中所述的較高的唾液酸化活性。如本文所述，所選擇的細胞和細胞系可包含突變GnT1基因和多肽。例如，本文描述的CHO細胞或細胞系可以通過將親本細胞系暴露于合適濃度的蓖麻凝集素I(RCA-I)合適時間來選擇。RCA-I濃度可以為0.1μg/ml至100μg/ml，例如上至50μg/ml或上至20μg/ml。具體濃度的實例包括ομg/ml和5μg/ml。孵育或暴露于RCA-I的時間可以為從1小時、數小時(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小時)、過夜至數日，例如2天或3天。通常，可以調節(jié)所述時間和濃度以消除大部分CHO細胞，但使少部分抗RCA-I的細胞能夠存活并形成集落。在這之中，暴露和選擇的濃度和時間可以不同，但通常而言，RCA-I的濃度越高，需要的暴露時間越短，反之亦然。所述選擇可以在任何合適的起始細胞或細胞系上進行，但它通常是CHO細胞或細胞系。任何已知的CHO細胞或細胞系均可用作起點或親本細胞，包括CH0-K1。其他合適的起始細胞可以包括但不限于如下(括號中是ECACC登記號)CH0(85050302)、CH0(PROTEINFREE)(00102307)、CHO-Kl(85051005)、CH0-K1/SF(93061607)、CHO/dhFr-(94060607)、CHO/dhFr-AC-free(05011002)、RR-CHOKI(92052129)。在選擇后，使存活的細胞生長并形成集落，在形成集落后可以挑取它們。進行該步驟的時間可不同，但通常足夠長以使集落生長成可挑取的大小。所述時間的實例有5天、7天、9天、11天、13天、1周、2周、3周或更長。所述挑取可以手工進行，或者可以通過使用機器人例如CLONEPIX(Genetix，NewMilton,Hampshire,UK)自動進行。還可以將所挑取的集落進一步克隆、進一步篩選、表征、+立笑絕上口死寸。可以對所選擇的細胞進行進一步測試。例如，可以使用RCA-I對它們進行凝集試驗以確認所述突變細胞不再與RCA-I反應。作為具體實例(其不意欲進行限制)，可以在例如6-孔板中將CHO-Kl細胞培養(yǎng)至匯合?？梢詫⑴囵B(yǎng)基換成無血清DMEM?？梢韵蛩雠囵B(yǎng)基中加入蓖麻凝集素I(RCA-I，EYLaboratories)至終濃度10μg/gml。它可以與細胞孵育過夜?？梢岳缫院?0%FBS的新鮮DMEM代替含RCA-I的無血清DMEM。9天后，可以將RCA-I處理下存活的CHO細胞的集落挑取并例如在24孔板中培養(yǎng)?？梢詫@些細胞進行進一步測試例如使用RCA-I的凝集試驗以確認所述突變細胞不再與RCA-I反應。本發(fā)明人因此提供了提供CHO細胞或細胞系的方法，所述方法包括在存在蓖麻凝集素I(RCA-I)的情況下培養(yǎng)CHO細胞，選擇在培養(yǎng)中存活且在凝集試驗中不與RCA-I反應的細胞。通過例如表達目的蛋白質并確定唾液酸化程度，可以對RCA-I選擇的CHO細胞和CHO細胞系測試其唾液酸化表現。這可以通過下文“唾液酸化”中描述的方法進行。本發(fā)明人因此提供了提供CHO細胞或細胞系的方法，所述方法包括在存在蓖麻凝集素I(RCA-I)的情況下培養(yǎng)CHO細胞，選擇在培養(yǎng)中存活的細胞并且選擇那些表現出高唾液酸化表現(例如所表達蛋白質的高Z值或低pi)的細胞或細胞系。使用現有技術中已知的方法，可以將所述選擇的細胞中的GnT1基因克隆并測序。所述GnT1基因可包括本文所述的突變GnT1基因。本發(fā)明人因此提供了提供CHO細胞或細胞系的方法，所述方法包括在存在蓖麻凝集素I(RCA-I)的情況下培養(yǎng)CHO細胞，選擇在培養(yǎng)中存活的細胞并且選擇那些包含本文所述的突變GnT1基因的細胞或細胞系。突變CHO細胞和細胞系如上文所述，本發(fā)明人提供了由RCA-I選擇得到的CHO細胞或細胞系。所述細胞系可包括JW152細胞系或者下文表Dl中列出的任何細胞系，包括JW80細胞系、JW36細胞系、KFC15002細胞系、KFC15071細胞系、KFC5008細胞系、JW152細胞系、KFC5026細胞系、KFC20011細胞系或KFC15047細胞系。蛋白表達本文所述的CHO細胞可用作表達任何目的蛋白質的宿主細胞。這可以通過本領域中已知的方式進行。CHO細胞和細胞系中的蛋白表達詳細記載于文獻中，本領域技術人員使用本文描述的CHO細胞和細胞系作為蛋白表達的宿主幾乎沒有困難。因此，例如，可以通過本領域中已知的方式以能夠表達目的蛋白質的表達載體來轉染所述CHO細胞和細胞系。所述CHO細胞和細胞系還可能能夠表達野生型或功能性GnTl，例如GenBank登記號AF343963中列出的序列。這可以通過以編碼GnT1的表達載體轉染所述CHO細胞和細胞系來進行。這可以在與包含編碼目的蛋白質的核酸的載體相同或不同的載體上進行。使用本文描述的CHO細胞作為宿主細胞可以表達任何合適的蛋白質。所述蛋白質可包括異源蛋白質。所述蛋白質可包括重組蛋白質。所述蛋白質可包括基因工程蛋白質。所述蛋白質可包括糖蛋白。實例包括治療或藥理學上感興趣的異源蛋白質?？梢员磉_的蛋白質包括anti-EGFRmAb、α-葡萄糖苷酶、α-L-艾杜糖醛酸酶(Iaronidase)、Ig_CTLA4融合物、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、促黃體激素、anti-VEGFmAb、第VIII因子、anti-lgEmAb、anti-CDlIamAb、α-半乳糖苷酶、干擾素-β、anti_TNFαmAb、促紅細胞生成素、anti_CD52mAb、第VIII因子、組織型纖溶酶原激活物、anti-HER2mAb、TNFa、受體融合物、第IX因子、促卵泡刺激素、anti-⑶20mAb、干擾素-β、β-葡糖腦苷脂酶、脫氧核糖核酸I等。例如，本發(fā)明人描述了以本文描述的CHO細胞和細胞系表達促紅細胞生成素(ΕΡ0)、干擾素-γ和第VIII因子。本發(fā)明人還描述了從本文描述的CHO細胞和細胞系表達的高度唾液酸化形式或同工型的促紅細胞生成素(EPO)、干擾素-γ和第VIII因子。唾液酸術語“唾液酸”意欲指代9碳羧化糖家族的任何成員。唾液酸家族最常見的成員是N-乙酰神經氨酸(2-酮-5-乙酰胺基-3，5-二脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮吡喃糖-1-酮酸(2-keto-5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galactononulopyranos-l-onicacid)，經常簡寫為Neu5Ac、NeuAc或NANA)。該家族的第二個成員是N-羥乙?；?神經氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基團被羥基化。第三個唾液酸家族成員是2-酮基-3-脫氧壬酮糖酸(2-ket0-3-de0Xy-n0nul0S0niCacid)(KDN)。還包括9位取代的唾液酸例如9-0-C1-C6-?；鵢Neu5Ac(如9_0_乳?；鵢Neu5Ac、9-0-乙?；?Neu5Ac、9-脫氧-9-氟代_Neu5Ac和9-疊氮基_9_脫氧_Neu5Ac)。唾液酸家族綜述參見例如Varki；Glycobiology21992；25-40；Sialicacids=Chemistry,MetabolismandFunction,R.Schauer,Ed.。唾液酸化蛋白質的唾液酸化程度可以通過多種方式測量，例如使用Z值或表示所述蛋白質的等電點。本發(fā)明人因此提供了使用本文描述的CHO細胞和細胞系進行的蛋白表達，所述蛋白表達包括目的蛋白質的高度唾液酸化形式或同工型。本文描述的CHO細胞和CHO細胞系的蛋白表達能夠產生蛋白質例如糖蛋白，例如促紅細胞生成素(ΕΡ0)、干擾素-γ和第VIII因子，其具有高Z值或低pl，或者這兩個條件同時滿足。Z值參數Z值提供糖蛋白中碳水化合物部分有多少個突出物帶有荷電殘基例如唾液酸的量度。為了確定Z值，將所述碳水化合物部分如上述從所述肽釋放，如果需要并進行標記。然后，將所述混合物通過離子交換色譜分離，使得物質可基于電荷分離。可以如上述借助標記物或者可以通過其他某些方法例如質譜法來顯示所洗脫的峰。然后，通過對單電荷、二電荷、三電荷和四電荷的碳水化合物種類相關峰進行積分來分析色譜圖。然后，可以使用每個種類占總碳水化合物的百分數來依照下式計算Z值Z=P'單+2P'二+3P'三+4P'四，其中Z為Z值，P'單、P'二、P'三和4P'四分別是單電荷、二電荷、三電荷和四電荷的碳水化合物占總碳水化合物的百分數。高Z值表示大量突出物帶有荷電殘基，因此所述糖蛋白應是高荷電的，并且在唾液酸殘基的情況下是酸性的。本文描述的CHO細胞能夠表達高度唾液酸化的蛋白質。因此，例如，所述CHO細胞表達的蛋白質可以具有高的Z值，例如大于150，例如大于160，大于170，大于180，例如大于190，大于200，大于210，例如大于220，大于230等。等電點蛋白質的等電點(pi)也可以用作其唾液酸化的量度。唾液酸化程度越高，其酸性越強并且其Pl越低。由本文描述的CHO細胞表達的蛋白質與它們的正常對應物例如天然蛋白質或者由野生型CHO細胞表達的對應蛋白質相比具有明顯更低的pi譜。例如，由本文描述的CHO細胞和細胞系表達的蛋白質可以具有低Pl，例如其pi為4.5或更小，例如4.3或更小，4.1或更小，4.0或更小，3.8或更小，3.6或更小，3.4或更小，3.2或更小，3.0或更小，2.8或更小，2.6或更小等。所述pi可以是各種蛋白分子的pl，或者是一批或一部分蛋白分子的pl，或者所表達的許多蛋白質的平均Pi?？梢允褂帽绢I域技術人員已知的許多方法從同工型混合物中分離所表達的蛋白質。例如，可使用等電聚焦、色譜聚焦或離子交換色譜來基于Pi分離所述同工型?？梢詫λ霾煌壏址治鐾僖核岷?，并選擇需要的級分使用。突變GNT1序列本發(fā)明人公開了突變GnT1序列，包括突變GnT1氨基酸序列和突變GnTl核酸序列。示例性突變GnT1氨基酸序列包括如SEQIDNO2所示的序列，以及包含下表Dl第3列所列突變的序列。示例性突變GnT1核酸序列包括如SEQIDNO:1所示的序列，以及包含下表Dl第2列所列突變的序列。如在下文實施例中所述，表Dl顯示了以RCA-I選擇分離出的克隆的GnT1序列中的突變。將相應突變列表，并排顯示各種核苷酸和氨基酸突變，以及在二級結構/相互作用遭到破壞的可能位置，或在終止密碼子突變情況下導致的氨基酸丟失。對最少4個細菌集落進行測序以確保存在的突變不是由于PCR錯誤。權利要求1.一種中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，所述細胞與野生型中國倉鼠卵巢細胞相比能夠實現更高的蛋白質唾液酸化，例如在存在功能性GnTl的情況下，其中所述CHO細胞可通過以蓖麻(Ricinuscommunis)凝集素I(RCA-I)進行選擇而獲得。2.權利要求1的CHO細胞，所述細胞(i)包括GnT1基因突變，例如選自在GnT1序列(GenBank登記號AF343963)的規(guī)定位置的如下突變(a)在位置1015處C轉換成T；(b)在位置1300處G顛換成C;(c)在位置638處A顛換成C；(d)在位置784處C顛換成G；(e)在位置811處T顛換成A；(f)致使所編碼的氨基酸序列從位置236開始移碼的在位置706處的插入；(g)在位置1015處C轉換成T；(h)在位置246處G轉換成A；(i)在位置258處G轉換成A；(j)在位置859處A轉換成T，或者所述細胞(ii)表達包含一種或多種在GnT1序列(GenBank登記號AF343963)的規(guī)定位置的如下突變的GnT1蛋白質(a)在位置434處Ala突變?yōu)镻ro；(b)在位置213處Asp—Ala;(c)在位置262處Arg—Gly；(d)在位置271處Trp—Arg；(e)由在編碼GnT1核酸序列位置706處的插入導致的從位置236開始的移碼；(f)在位置339處Gln—STOP；(g)在位置82處Trp—STOP；(h)在位置86處Trp—STOP；(i)在位置287Lys—STOP。3.權利要求1或2的CHO細胞，其中所述GnT1基因包含SEQIDNO1中所示的GnT1核酸序列，或者所述CHO細胞表達如SEQIDNO2中所示的GnT1蛋白質。4.權利要求1、2或3的CHO細胞，其中所述CHO細胞包含(a)編碼目的蛋白質例如重組目的蛋白質如促紅細胞生成素(EPO)或干擾素-Y(IFN-γ)的核酸序列；或者(b)編碼功能性GnT1的核酸序列；或者(c)編碼所述目的蛋白質的核酸序列和編碼功能性GnT1的核酸序列，所述兩個核酸序列包含在一個表達載體中，例如穩(wěn)定轉染至所述CHO細胞中。5.一種包含前述權利要求任一項的CHO細胞的CHO細胞系。6.一種CHO細胞系，包括JW152細胞系(根據布達佩斯條約以登記號PTA-9657保藏于ATCC)、JW80細胞系、JW36細胞系、KFC15002細胞系、KFC15071細胞系、KFC5008細胞系、JW152細胞系、KFC5026細胞系、KFC20011細胞系或KFC15047細胞系。7.前述權利要求任一項的CHO細胞或CHO細胞系，所述CHO細胞或CHO細胞系適應于懸浮培養(yǎng)。8.前述權利要求任一項的CHO細胞或CHO細胞系表達的重組蛋白質，例如包括促紅細胞生成素(EPO)或干擾素-Y(IFN-γ)。9.權利要求8的重組蛋白質，所述重組蛋白質的pKa為4或更小，3.5或更小，3或更小，2.5或更小，或者2或更小，或者其Z-值大于150，例如大于160，大于170，大于180，例如大于190，大于200，大于210，例如大于220或大于230，或者以上兩種情況同時滿足。10.一種表達重組蛋白質的方法，所述方法包括將編碼所述蛋白質的核酸導入權利要求1-7任一項的CHO細胞，使所述蛋白質由所述CHO細胞或其后代表達，并任選地純化所述蛋白質，并且所述方法還任選地包括將編碼功能性GnT1的核酸導入或穩(wěn)定地轉染至所述CHO細胞中，例如以包含編碼所述蛋白質的核酸序列和編碼功能性GnT1的核酸序列的表達載體的形式。11.一種包含以下序列的核酸SEQIDNO:1中所示序列，或包含GnT1序列和表Dl第2列所列突變的序列，或者其變體、同源物、衍生物或片段。12.—種包含以下序列的的多肽SEQIDNO:2中所示的序列，或包含GnT1序列和表Dl第3列所列突變的序列，或者其變體、同源物、衍生物或片段。13.一種提供CHO細胞或細胞系的方法，所述方法包括在存在蓖麻凝集素I(RCA-I)的情況下培養(yǎng)CHO細胞，并選擇培養(yǎng)中存活的細胞，其中例如(a)將所述CHO細胞暴露于濃度為0.1μg/ml至100μg/ml，例如上至50μg/ml或上至20μg/ml，例如10μg/ml或5μg/ml的RCA-1；或者(b)將所述CHO細胞暴露于RCA-I達1小時、數小時(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小時)、過夜，至數日例如2天或3天，例如過夜。14.權利要求13的方法，還包括選擇在凝集試驗中不與RCA-I反應的細胞。15.可通過權利要求13或14的方法得到的CHO細胞或CHO細胞系。16.參照并如附圖1-12所示的基本如前所述的CHO細胞、細胞系、重組蛋白質、方法、核酸或多肽。全文摘要本發(fā)明人提供了一種中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，所述細胞與野生型中國倉鼠卵巢細胞相比能夠實現更高的蛋白質唾液酸化，例如在存在功能性GnT1的情況下，其中所述CHO細胞可通過以蓖麻凝集素I(RCA-I)選擇來獲得。文檔編號C12N15/85GK102439140SQ200980146306公開日2012年5月2日申請日期2009年9月18日優(yōu)先權日2008年9月19日發(fā)明者宋志偉申請人:新加坡科技研究局