專利名稱：大腸埃希氏菌介導(dǎo)的β-連環(huán)蛋白的基因干擾的制作方法
大腸埃希氏菌介導(dǎo)的β-連環(huán)蛋白的基因干擾相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2008年11月14日提交的美國專利申請No. 61/114，610號的優(yōu)先權(quán)， 其內(nèi)容通過引用整體并入本文。
背景技術(shù)：
使用小干擾RNA(SiRNA)通過RNAi (RNA干擾)的基因沉默已經(jīng)成為分子生物學(xué)強(qiáng)有力的工具并具有用于治療性基因沉默的潛能。已經(jīng)證明由靶細(xì)胞內(nèi)的小DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的短發(fā)夾RNA(shRNA)也介導(dǎo)穩(wěn)定的基因沉默并且獲得與通過轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的siRNA 所獲得的水平相當(dāng)?shù)幕蚯脺p(T. R. BrummeIkamp，R. Bernards, R. Agami, Science 296, 550 (2002)，P. J. Paddison, A. A. Caudiy, G. J. Hannon, PNAS 99，1443 (2002))。RNAi的用于治療目的的可能應(yīng)用是廣泛的，并且包括沉默和敲減諸如癌基因或病毒基因的疾病基因。RNAi的治療性應(yīng)用的一個(gè)主要障礙在于siRNA向靶細(xì)胞內(nèi)的遞送 (Zamore PD, Aronin N. Nature Medicine 9，(3) :266-8 (2003)) 實(shí)際上，遞送已經(jīng)被稱為是目前RNAi 的主要障礙(Phillip Sharp, cited by Nature news feature, Vol 425,2003, 10-12)。因此，需要安全且可預(yù)測地向哺乳動(dòng)物施用干擾RNA的新方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含原核載體的至少一種侵襲性細(xì)菌或至少一種侵襲性細(xì)菌治療顆粒(BTP)，所述載體包含編碼一個(gè)或多個(gè)siRNA的一個(gè)或多個(gè)DNA分子、經(jīng)修飾的Plaew5 啟動(dòng)子、至少一個(gè)Inv基因座和至少一個(gè)HlyA基因，其中所述siRNA干擾目標(biāo)基因靶標(biāo)的 mRNA，并且與野生型細(xì)菌相比，所述侵襲性細(xì)菌的RNase III活性降低。優(yōu)選地，所述侵襲性細(xì)菌是侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌(E.coli)。優(yōu)選地，所述siRNA干擾β-連環(huán)蛋白的mRNA。 本發(fā)明還提供了包含編碼一個(gè)或多個(gè)siRNA的一個(gè)或多個(gè)DNA分子、經(jīng)修飾的Pla。OT5啟動(dòng)子、至少一個(gè)Inv基因座和至少一個(gè)HlyA基因的至少一個(gè)原核載體，其中所述siRNA干擾目標(biāo)基因靶標(biāo)的mRNA。優(yōu)選地，所述siRNA干擾β -連環(huán)蛋白的mRNA。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明提供的各種侵襲性細(xì)菌、BTP和載體的方法。例如，本發(fā)明提供了向哺乳動(dòng)物細(xì)胞遞送一個(gè)或多個(gè)siRNA的方法。所述方法包括引入包含原核載體的至少一種侵襲性細(xì)菌或至少一種侵襲性細(xì)菌治療顆粒(BTP)，所述載體包含編碼一個(gè)或多個(gè)siRNA的一個(gè)或多個(gè)DNA分子、經(jīng)修飾的Plartiv5啟動(dòng)子、至少一個(gè)Inv基因座和至少一個(gè)HlyA基因，其中所述siRNA干擾目標(biāo)基因靶標(biāo)的mRNA，并且與野生型細(xì)菌相比，所述侵襲性細(xì)菌的RNase III活性降低。優(yōu)選地，所述侵襲性細(xì)菌是侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌。本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)的方法。所述方法包括引入包含原核載體的至少一種侵襲性細(xì)菌或至少一種侵襲性細(xì)菌治療顆粒(BTP)，所述載體包含編碼一個(gè)或多個(gè)siRNA的一個(gè)或多個(gè)DNA、經(jīng)修飾的Pla。UV5啟動(dòng)子、至少一個(gè)hv基因座和至少一個(gè)HlyA基因，其中所述siRNA干擾目標(biāo)基因靶標(biāo)的mRNA，并且與野生型細(xì)菌相比，所述侵襲性細(xì)菌的RNase III活性降低，其中所表達(dá)的siRNA干擾目標(biāo)基因的至少一個(gè)mRNA并由此調(diào)節(jié)基因表達(dá)。優(yōu)選地，所述侵襲性細(xì)菌是侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌。優(yōu)選地，所述SiRNA 干擾β-連環(huán)蛋白的mRNA。本發(fā)明還提供了治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物的疾病或病變的方法。所述方法包括通過向已知引起疾病或病變(例如已知提高增殖、生長或發(fā)育異常)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引入包含原核載體的至少一種侵襲性細(xì)菌或至少一種侵襲性細(xì)菌治療顆粒(BTP)而調(diào)節(jié)所述細(xì)胞中的至少一個(gè)基因的表達(dá)，其中所述載體包含編碼一個(gè)或多個(gè)SiRNA的一個(gè)或多個(gè)DNA分子、經(jīng)修飾的Plartiv5啟動(dòng)子、至少一個(gè)Inv基因座和至少一個(gè)HlyA基因，其中所述siRNA干擾目標(biāo)基因靶標(biāo)的mRNA，并且與野生型細(xì)菌相比，所述侵襲性細(xì)菌的RNase III活性降低， 其中所表達(dá)的siRNA干擾已知引起疾病或病變的基因的mRNA。優(yōu)選地，所述侵襲性細(xì)菌是侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌。優(yōu)選地，所述siRNA干擾β-連環(huán)蛋白的mRNA。所表達(dá)的siRNA能夠指導(dǎo)所述細(xì)胞的多酶復(fù)合體RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體與一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因的mRNA(例如β-連環(huán)蛋白)相互作用。優(yōu)選地，與野生型β-連環(huán)蛋白的表達(dá)相比或與用包含編碼一個(gè)或多個(gè)siRNA的一個(gè)或多個(gè)DNA分子的侵襲性細(xì)菌或BTP給藥或治療前β-連環(huán)蛋白的表達(dá)相比，β-連環(huán)蛋白的表達(dá)降低。連環(huán)蛋白的表達(dá)降低可以是β-連環(huán)蛋白mRNA的表達(dá)降低或β-連環(huán)蛋白的表達(dá)降低。優(yōu)選地，與野生型β-連環(huán)蛋白的表達(dá)相比(與正常的健康細(xì)胞相比時(shí))或與用包含編碼一個(gè)或多個(gè)siRNA的一個(gè)或多個(gè)DNA分子的侵襲性細(xì)菌或BTP給藥或治療前β-連環(huán)蛋白的表達(dá)相比，β-連環(huán)蛋白的表達(dá)降低至少50% ；更優(yōu)選地，與野生型β-連環(huán)蛋白的表達(dá)相比(與正常的健康細(xì)胞相比時(shí))或與用包含編碼一個(gè)或多個(gè)siRNA的一個(gè)或多個(gè)DNA分子的侵襲性細(xì)菌或BTP 給藥或治療前連環(huán)蛋白的表達(dá)相比，連環(huán)蛋白的表達(dá)降低至少75% ；最優(yōu)選地，與野生型β-連環(huán)蛋白的表達(dá)相比(與正常的健康細(xì)胞相比時(shí))或與用包含編碼一個(gè)或多個(gè) siRNA的一個(gè)或多個(gè)DNA分子的侵襲性細(xì)菌或BTP給藥或治療前β -連環(huán)蛋白的表達(dá)相比， β-連環(huán)蛋白的表達(dá)降低至少90%。優(yōu)選地，所述疾病或病變可以是，但不限于與β-連環(huán)蛋白的過表達(dá)相關(guān)的疾病或病變。也即，所述疾病或病變的特征在于，當(dāng)與正常(非病變)或野生型細(xì)胞或哺乳動(dòng)物相比，需要此治療的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物中β-連環(huán)蛋白的表達(dá)(DNA、RNA或蛋白)提高。優(yōu)選地，待治療的疾病或病變選自由以下組成的組結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、Crohn氏病、 潰瘍性結(jié)腸炎、家族性腺瘤性息肉病(FAP)、Gardner綜合征、肝細(xì)胞癌(HCC)、基細(xì)胞癌、毛母質(zhì)瘤、成髓細(xì)胞瘤和卵巢癌。本發(fā)明還提供了包含至少一種侵襲性細(xì)菌或BTP和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。本發(fā)明的侵襲性細(xì)菌或BTP可以是減毒的、不致病的或無毒的細(xì)菌。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是離體的、體內(nèi)的或體外的。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以為，但不限于人、牛、綿羊、豬、貓、野牛、犬、山羊、馬、驢、鹿、禽、鳥、雞和靈長類的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是，但不限于結(jié)腸上皮細(xì)胞、直腸上皮細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、皮膚上皮細(xì)胞、毛細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和卵巢細(xì)胞?？梢杂眉sIO3-IO11 (或所述范圍內(nèi)的任意整數(shù))的活侵襲性細(xì)菌或BTP感染所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選地，可以用約IO5-IO9(或所述范圍內(nèi)的任意整數(shù))的活侵襲性細(xì)菌或BTP感染所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞?？梢杂梅秶诩s0. I-IO6 (或所述范圍內(nèi)的任一整數(shù))的感染復(fù)數(shù)感染所述哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，可以用范圍在約102_104(或所述范圍內(nèi)的任一整數(shù))的感染復(fù)數(shù)感染所述哺乳動(dòng)物。所述哺乳動(dòng)物可以為，但不限于人、牛、綿羊、豬、貓、野牛、犬、山羊、馬、驢、鹿、禽、
鳥、雞和靈長類。優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物是人。所述侵襲性細(xì)菌中刪除了編碼RNaseIII的基因。優(yōu)選地，所述侵襲性細(xì)菌中刪除了編碼RNaseIII的rnc基因。優(yōu)選地，與野生型細(xì)菌相比，所述侵襲性細(xì)菌的RNase III活性降低至少90% ；更優(yōu)選地，與野生型細(xì)菌相比，所述侵襲性細(xì)菌的RNase III活性降低至少95% ；最優(yōu)選地，與野生型細(xì)菌相比，所述侵襲性細(xì)菌的RNase III活性降低至少99%。 優(yōu)選地，所述侵襲性細(xì)菌是侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌。所述一個(gè)或多個(gè)DNA分子可以在所述侵襲性細(xì)菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄成一個(gè)或多個(gè)shRNA。優(yōu)選地，所述一個(gè)或多個(gè)shRNA包含3’懸端或平末端。優(yōu)選地，所述一個(gè)或多個(gè)shRNA不包含或不包括5’懸端(具有平末端)。優(yōu)選地，所述一個(gè)或多個(gè)shRNA包含2-5個(gè)堿基對的3’ 懸端；更優(yōu)選地，所述一個(gè)或多個(gè)shRNA包含不大于2個(gè)堿基對的3’懸端(一個(gè)或兩個(gè)堿基對的懸端)；最優(yōu)選地，所述一個(gè)或多個(gè)shRNA不包含或不包括3’懸端(具有平末端)。 所述一個(gè)或多個(gè)shRNA被加工成一個(gè)或多個(gè)siRNA。優(yōu)選地，所述一個(gè)或多個(gè)shRNA在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)被加工成一個(gè)或多個(gè)siRNA。包含編碼所述一個(gè)或多個(gè)siRNA的一個(gè)或多個(gè)DNA的原核載體可以包含一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列、終止子序列、侵襲因子序列或裂解調(diào)節(jié)序列。所述啟動(dòng)子可以是原核啟動(dòng)子。優(yōu)選地，所述原核啟動(dòng)子是T7啟動(dòng)子，PgapA啟動(dòng)子、PaMBAD啟動(dòng)子、Pta。啟動(dòng)子、Pla。OT5啟動(dòng)子或recA啟動(dòng)子。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子是原核啟動(dòng)子。優(yōu)選地，所述原核啟動(dòng)子是經(jīng)修飾的Plartiv5啟動(dòng)子。所述經(jīng)修飾的Pla。OT5啟動(dòng)子可以包含SEQ ID NO :573的序列。優(yōu)選地，所述經(jīng)修飾的Pla。OT5啟動(dòng)子可以包含UP元件。所述UP元件可以包含SEQ ID NO :573的7- 位核苷酸。優(yōu)選地，所述原核載體進(jìn)一步包含至少一個(gè)終止子序列。優(yōu)選地，所述終止子序列包含一系列連續(xù)的胸苷堿基對。更優(yōu)選地，所述終止子序列可以包含至少5個(gè)連續(xù)的胸苷堿基對。所述終止子序列優(yōu)選包含少于20個(gè)連續(xù)的胸苷堿基對。所述原核載體可以進(jìn)一步包含第二終止子序列。優(yōu)選地，第二終止子序列可以是rrnC終止子序列。優(yōu)選地，所述rrnC終止子序列可以包含SEQ ID NO :30-31或SEQ ID NO :574的序列。 優(yōu)選地，這兩個(gè)終止子序列在所述原核載體中是相鄰的(其為連續(xù)序列)。更優(yōu)選地，所述兩個(gè)終止子序列是分開的。優(yōu)選地，所述原核載體包含經(jīng)驗(yàn)證的PMBV43的序列。優(yōu)選地， 所述經(jīng)驗(yàn)證的PMBV43序列是SEQ ID NO :564。除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。在本說明書中，除非文中清楚指明，否則單數(shù)形式也可以包括復(fù)數(shù)形式。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測試中可以使用與本發(fā)明所述類似或等同的方法和材料，但合適的方法和材料如以下所述。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考均通過引用并入本文。在有沖突的情況下，以包括定義在內(nèi)的本發(fā)明說明書為準(zhǔn)。此外，所述材料、方法和實(shí)例僅作為示例而非限制性的。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)于以下詳述和權(quán)利要求書中。


圖1為顯示三個(gè)劑量的CEQ200和CEQ221在C0S7細(xì)胞內(nèi)的比較圖。圖2為具有功能注解的顯示RNase III底物的發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)的示意圖。圖3為顯示細(xì)菌I型RNase III對發(fā)夾前體的切割作用的示意圖。圖4為顯示熟化的第二步(第一 Dicer切割步驟)的示意圖。圖5為顯示第二 Dicer切割步驟和熟化為活性siRNA的示意圖。圖6的A部分為顯示CEQ 505能夠在Cos-7細(xì)胞中以劑量依賴方式將哺乳動(dòng)物 β-連環(huán)蛋白沉默達(dá)90%的示意圖。圖6的B部分為顯示CEQ 221pNJSZc lamin(靶向核纖層蛋白基因的等同株)能夠在SW480細(xì)胞中以劑量依賴方式將哺乳動(dòng)物核纖層蛋白沉默達(dá)65%的示意7為顯示具有鏈擺動(dòng)(strand wobble)的H3_shRNA的示意圖。圖8的A部分為顯示表達(dá)opa的大腸埃希氏菌株在MOI 1時(shí)的侵襲能力的示意圖。 圖8的B部分為顯示表達(dá)opa的大腸埃希氏菌株在MOI 10時(shí)的侵襲能力的示意9的A部分為顯示在人SW480細(xì)胞中利用CEQ508沉默β -連環(huán)蛋白mRNA的示意圖。圖9的B部分為顯示在人SW480細(xì)胞中利用CEQ508沉默β-連環(huán)蛋白的示意圖。圖10為顯示在人SW480細(xì)胞中利用CEQ508沉默β -連環(huán)蛋白的免疫印跡照片。圖11為顯示在C0S-7細(xì)胞中利用CEQ509BTP沉默β -連環(huán)蛋白mRNA的示意圖。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及利用細(xì)菌的不致病株或治療株或細(xì)菌治療顆粒(BTP)將小干擾 RNA(siRNA)遞送至真核細(xì)胞的組合物和方法。所述細(xì)菌或BTP遞送編碼siRNA的DNA或 siRNA本身，以通過侵入真核宿主細(xì)胞內(nèi)而發(fā)揮RNA干擾(RNAi)的作用。通常，為了在靶細(xì)胞內(nèi)觸發(fā)RNA干擾，需要將siRNA引入所述細(xì)胞。所述siRNA被直接引入或者通過轉(zhuǎn)染而引入靶細(xì)胞中或者可以在靶細(xì)胞內(nèi)由具有RNA聚合酶III兼容性啟動(dòng)子(例如U6、H1)的特異質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 dsRNA(shRNA) (P. J. Paddison, A. A. Caudiy, G. J. Hannon, PNAS 99,1443(2002)，T. R. Brummelkamp, R. Bernards, R. Agami, Science 296,550(2002))。本發(fā)明的干擾RNA調(diào)節(jié)真核細(xì)胞中的基因表達(dá)，其沉默或敲減靶標(biāo)細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)基因(例如降低基因活性)。所述干擾RNA將細(xì)胞所屬的多酶復(fù)合體RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)靶向至待沉默基因的mRNA。RISC和mRNA的相互作用引起mRNA的降解或封存 (sequestration)。這導(dǎo)致目標(biāo)基因的有效的轉(zhuǎn)錄后沉默。該方法被稱為細(xì)菌介導(dǎo)的基因沉默(BMGS)。在通過遞送表達(dá)siRNA的DNA質(zhì)粒進(jìn)行BMGS的情況下，釋放真核轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒后，在靶細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生shRNA或siRNA，并且觸發(fā)mRNA降解的高特異過程，該過程引起靶基因的沉默。此外，可以使用將siRNA或shRNA的表達(dá)限定在出于特定代謝狀態(tài)的特定靶細(xì)胞或組織的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞特異性真核啟動(dòng)子。在該方法的一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞特異性啟動(dòng)子為白蛋白，所述靶細(xì)胞或組織為肝臟。在該方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞特異性啟動(dòng)子為角蛋白，所述靶細(xì)胞或組織為皮膚。本發(fā)明的無毒細(xì)菌和BTP具有侵襲性質(zhì)(或者經(jīng)修飾而具有侵襲性質(zhì))并且可以通過多種機(jī)制進(jìn)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。與通過專門的吞噬細(xì)胞攝取細(xì)菌或BTP (該攝取通常致使細(xì)菌或BTP在專門的溶酶體中遭到破壞)相比，侵襲細(xì)菌或BTP菌株具有侵入非吞噬性宿主細(xì)胞的能力。天然存在的此類細(xì)菌或BTP的實(shí)例為細(xì)胞內(nèi)病原體，例如耶爾森氏菌(Yersinia)、立克次氏體(Rickettsia)、軍團(tuán)菌(Legionella)、布魯氏菌 (Brucella) >^feff ^ (Mycobacterium) >ilff ^ (Helicobacter) ,^^ ΜΜ (Coxiella) > 衣原體(Chlamydia)、奈瑟氏菌(Neisseria)、伯克霍爾德氏菌(Burkolderia)、包特氏菌(Bordetella)、布魯氏菌(Borrelia)、李斯特菌(Listeria)、志賀氏菌(Shigella)、 沙門氏菌(Salmonella)、葡萄球菌(Staphylococcus)、鏈球菌(Str印tococcus)、口卜啉菌 (Porphyromonas)、螺旋體(Ti^ponema)和弧菌(Vibrio)，但該性質(zhì)還可以轉(zhuǎn)移至其它細(xì)菌或BTP中，例如大腸埃希氏菌(E. coli)、乳酸菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus) 或雙歧桿菌(Bifidobacteriae)(P. Courvalin, S. Goussard, C. Grillot-Courvalin,
C.R. Acad. Sci. Paris 318,1207(1995))。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，用于將干擾RNA遞送至宿主細(xì)胞的細(xì)菌或BTP包括福氏志賀氏菌(Shigella flexneri) (D. R. Sizemore, Α. Α. Branstrom, J. C. Sadoff, Science 270，299 (199 )，侵襲性大腸埃希氏菌(P. Courvalin, S.Goussard, C. Grillot-Courvalin, C. R. Acad. Sci. Paris 318, 1207(1995), C. GriIlot-Courvalin, S. Goussard, F. Huetz, D. Μ. Ojcius, P. Courvalin, Nat Biotechnol 16，862 (1998))，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica) (A. Al-Mariri Α, Α. Tibor, P. Lestrate, P. Mertens, Χ. De Bolle, J. J. Letesson Infect Immun 70,1915(2002))和單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes) (Μ. Hense, Ε. Domann, S. Krusch, P. Wachholz, K. Ε. Dittmar, Μ. Rohde, J. Wehland, Τ. Chakraborty, S.Weiss, Cell Microbiol 3,599 (2001), S. Pilgrim, J.Stritzker, C. Schoen, A. Kolb- Maurer, G. Geginat, M. J. Loessner, I. Gentschev, W. Goebel, Gene Therapy 10,
2036(2003)).任何侵入性細(xì)菌或BTP都可用于將DNA轉(zhuǎn)移至真核細(xì)胞中(S. W^eiss, T. Chakraborty, Curr Opinion Biotechnol 12，467 (2001))。利用天然的侵襲性病原體鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)進(jìn)行 BMGS0在該實(shí)施方式的一個(gè)方面，鼠傷寒沙門氏菌菌株包括SL 7207和VNP20009 (S. K. Hoiseth, B. A. D. Stocker, Nature 291,238(1981) ；Pawelek JM, Low KB, Bermudes
D.Cancer Res. 57(20) :4537-44(Oct. 15 1997))。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，利用減毒的大腸埃希氏菌進(jìn)行BMGS。在該實(shí)施方式的另一個(gè)方面，對CEQ201菌株進(jìn)行工程改造以通過侵襲性質(zhì)粒而使其具有細(xì)胞侵襲性質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，該質(zhì)粒為 TRIP (Transkingdom RNA 干擾質(zhì)粒)質(zhì)?；?pNJSZ。針對攜帶由真核轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的侵入性營養(yǎng)缺陷性細(xì)菌或者BTP還使用了雙重“特洛伊木馬”技術(shù)。該質(zhì)粒反過來由靶細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，以形成觸發(fā)RNAi的細(xì)胞內(nèi)過程的一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的該方法誘導(dǎo)多個(gè)基因的顯著的基因沉默。在該實(shí)施方式的某些方面，所述基因包括體外的轉(zhuǎn)基因(GFP)、突變的致癌基因(k-Ras)和癌相關(guān)基因(β_連環(huán)蛋白)。本發(fā)明BMGS的另一方面被稱為iTranskingdom RNAi (tkRNAi)。在本發(fā)明的該方面，與靶細(xì)胞對比，siRNA由侵襲性細(xì)菌直接產(chǎn)生，或者在細(xì)菌產(chǎn)生后聚集在BTP中。通過標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化技術(shù)將由原核啟動(dòng)子(例如T7)控制的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒插入至載體細(xì)菌中。在所述細(xì)菌中產(chǎn)生siRNA，并在由營養(yǎng)缺陷或定時(shí)添加抗生素觸發(fā)的細(xì)菌裂解后釋放到哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞中。
大多數(shù)細(xì)菌都含有大量RNA降解酶RNAse，其可以降解siRNA從而引起tkRNAi活性的降低。在特定細(xì)菌的RNAse表現(xiàn)出此siRNA降解活性的情況下，對編碼目標(biāo)RNAse的基因(例如編碼RNAse III的rnc基因)進(jìn)行靶向刪除，以使每tkRNAi細(xì)菌產(chǎn)生較高水平的siRNA，從而使更多的siRNA被遞送至靶細(xì)胞中，以及靶細(xì)胞中目標(biāo)基因的更有效的基因沉默。與用于發(fā)現(xiàn)基因功能的遺傳工程化敲減模型相比，包括BMGS和tkRNAi在內(nèi)的本發(fā)明的RNAi方法用于產(chǎn)生瞬時(shí)“敲減”的遺傳動(dòng)物模型。所述方法還用作研究和藥物開發(fā)用體外轉(zhuǎn)染工具。這些方法使用具有理想性質(zhì)(侵襲性、減毒、易操作性)的細(xì)菌以進(jìn)行BMGS和 tkRNAi。如本文較詳細(xì)描述的，利用質(zhì)粒(例如TRIP)和載體使細(xì)菌或BTP具有侵襲性以及一個(gè)或數(shù)個(gè)shRNA的真核或原核轉(zhuǎn)錄。1.細(xì)菌和/或細(xì)菌治療顆粒(BTP)本發(fā)明提供了至少一種侵襲性細(xì)菌或者至少一種細(xì)菌治療顆粒(BTP)，其包含一個(gè)或多個(gè)siRNA或編碼一個(gè)或多個(gè)siRNA的一個(gè)或多個(gè)DNA分子。根據(jù)本發(fā)明，能夠通過例如跨膜進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，將分子例如RNA分子或編碼 RNA的DNA分子遞送至靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的任何微生物均可用于向此細(xì)胞遞送RNA。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述微生物為原核生物。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述原核生物是細(xì)菌或 BTP0除細(xì)菌外，可用于向細(xì)胞遞送RNA的微生物也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，所述微生物可以是真菌，例如新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)，原生動(dòng)物，例如克氏錐蟲 (Trypanosoma cruzi)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)、杜氏禾Ij什曼原蟲(Leishmania donovani)禾口皰原蟲(Plasmodia)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述微生物為細(xì)菌或BTP。優(yōu)選的侵襲性細(xì)菌或BTP能夠通過例如進(jìn)入真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，向靶細(xì)胞遞送至少一種分子，例如RNA或編碼RNA的DNA分子。優(yōu)選地，所述RNA是siNRA或shRNA，并且所述編碼RNA的DNA分子編碼siRNA或shRNA。BTP為用于治療或預(yù)防目的的細(xì)菌的片段。BTP可以包括本領(lǐng)域已知為迷你細(xì)胞(minicell)的顆粒。迷你細(xì)胞是由在極點(diǎn)(pole)附近具有缺陷的細(xì)胞分裂產(chǎn)生的小細(xì)胞，其缺乏類核，因此不能生長和形成菌落(Alder et al.，(1967) Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. Α. 57,321-326 ；綜述參見 Sullivan and Maddock, (2000) Curr. Biol. 10 :R249_R252 ； Margolin, (2001)Curr. Biol. 11，R395_R398 ；Howard and Kruse, (2005)J. Cell Biol. 168， 533-536)。迷你細(xì)胞的形成是突變的結(jié)果，該突變導(dǎo)致細(xì)胞分裂用隔膜形成位點(diǎn)的選擇缺陷。此類突變包括 minC、minD 的無效等位基因(Davie et al, (1984) J. Bacteriol. 158, 1202-1203 ;de Boer et al.，1988) J. Bacteriol. 170，2106-2112)和 ftsZ 的某些等位基因 (Bi and Lutkenhaus, (1992) J. Bacteriol. 174，5414-5423)。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)tsZ 或 MinC-MinD 蛋白的過表達(dá)同樣引起迷你細(xì)胞的形成(Ward and Lutkenhaus，1985 ;de Boer et al.， 1988)。雖然迷你細(xì)胞不含類核體，但其能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯(Roozen et al. , (1971) J.Bacteriol. 107,21-33 ；Shepherd et al.，(2001)J. Bacteriol. 183，2527-34)。BTP與細(xì)菌的區(qū)別在于其缺乏細(xì)菌基因組，因此降低了細(xì)菌在患者體內(nèi)增殖的風(fēng)險(xiǎn)。這對免疫功能低下的患者尤其有益。此外，BTP的不能增殖性可使其用于敏感組織例如腦，和通常認(rèn)為傳統(tǒng)siRNA難以接近的其他身體區(qū)域。例如，細(xì)菌的腹膜內(nèi)遞送可涉及粘連和腹膜炎的風(fēng)險(xiǎn)，這些風(fēng)險(xiǎn)可通過使用BTP消除。然而，與本發(fā)明的細(xì)菌相同，BTP包含細(xì)菌細(xì)胞壁、一些細(xì)菌胞質(zhì)內(nèi)容物(bacterial plasma content)和亞細(xì)胞顆粒、一種或多種治療性組分(例如一種或多種siRNA)、一種或多種侵襲因子、一種或多種吞噬體降解因子和一種或多種靶向特定組織的因子。BTP由已產(chǎn)生siRNA并在細(xì)菌內(nèi)積聚siRNA的細(xì)菌產(chǎn)生，然后在細(xì)胞分裂過程中分離細(xì)菌片段(BTP)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，通過發(fā)酵細(xì)菌獲得BTP (在所述發(fā)酵過程中大量形成BTP)，然后利用體積差過濾從活細(xì)菌分離BTP (所述分離將截留細(xì)菌而允許BTP通過和收集)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，通過離心從細(xì)菌分離BTP。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，通過激活死亡信號裂解活細(xì)菌細(xì)胞。分離后， 可以將BTP冷凍并進(jìn)行配制以備用。當(dāng)涉及微生物例如細(xì)菌或BTP時(shí)，本文使用的術(shù)語“侵襲”是指能夠向靶細(xì)胞遞送至少一種分子例如RNA或編碼RNA的DNA分子的細(xì)菌。侵襲性微生物可以是能夠穿過細(xì)胞膜，由此進(jìn)入所述細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)并向所述靶細(xì)胞遞送其至少一些內(nèi)容物(例如RNA或編碼 RNA的DNA)的微生物。向靶細(xì)胞遞送至少一種分子的過程優(yōu)選不明顯改變所述侵襲器官。侵襲性微生物包括天然能夠通過例如穿過細(xì)胞膜(例如真核細(xì)胞膜)并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)而向靶細(xì)胞遞送至少一種分子的微生物，以及天然不具有侵襲性，但已經(jīng)過修飾(例如遺傳修飾)從而具有侵襲性的微生物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以通過將所述細(xì)菌或BTP連接至“侵襲因子”(也稱為“進(jìn)入因子”或“胞質(zhì)靶向因子”)進(jìn)行修飾從而使所述天然不具有侵襲性的微生物具有侵襲性。本文使用的“侵襲因子”是當(dāng)由非侵襲性細(xì)菌或 BTP表達(dá)時(shí)使所述細(xì)菌或BTP具有侵襲性的因子，例如蛋白或蛋白組。本文使用的“侵襲因子”由“胞質(zhì)靶向基因”編碼。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述微生物是選自以下組的天然具有侵襲性的細(xì)菌或BTP，所述組包括但不限于耶爾森氏菌、立克次氏體、軍團(tuán)菌、布魯氏菌、分枝桿菌、螺旋菌、考克斯菌、衣原體、奈瑟氏菌、伯克霍爾德氏菌、包特氏菌、布魯氏菌、李斯特菌、志賀氏菌、沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、嚇啉菌、螺旋體、弧菌、大腸埃希氏菌和雙歧桿菌。任選地， 所述天然具有侵襲性的細(xì)菌或BTP是表達(dá)選自以下組的侵襲因子的耶爾森氏菌，所述組包括但不限于侵襲素和^dA (小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌質(zhì)粒粘附因子)。任選地，所述天然具有侵襲性的細(xì)菌或BTP是表達(dá)侵襲因子RickA(肌動(dòng)蛋白聚合蛋白)的立克次氏體。任選地， 所述天然具有侵襲性的細(xì)菌或BTP是表達(dá)侵襲因子RaIF (鳥嘌呤交換因子)的軍團(tuán)菌。任選地，所述天然具有侵襲性的細(xì)菌或BTP是表達(dá)選自以下組的侵襲因子的奈瑟氏菌，所述組包括但不限于NadA (奈瑟氏菌粘附/侵襲因子)、OpaA, OpaC和0pa52 (不透明性相關(guān)蛋白)。任選地，所述天然具有侵襲性的細(xì)菌或BTP是表達(dá)選自以下組的侵襲因子的李斯特菌，所述組包括但不限于hlA (內(nèi)化蛋白因子)、InlB (內(nèi)化蛋白因子)、Hpt (己糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)和ActA(肌動(dòng)蛋白聚合蛋白)。任選地，所述天然具有侵襲性的細(xì)菌或BTP是表達(dá)選自以下組的侵襲因子的志賀氏菌，所述組包括但不限于志賀氏菌分泌因子IpaA(侵襲質(zhì)粒抗原)、IpaB、IpaC, IpgD, IpaB-IpaC復(fù)合體、VirA和IcsA。任選地，所述天然具有侵襲性的細(xì)菌或BTP是表達(dá)選自以下組的侵襲因子的沙門氏菌，所述組包括但不限于沙門氏菌分泌/交換因子SipA, SipC, SpiC, SigD, SopB, SopE, SopE2和SptP。任選地，所述天然具有侵襲性的細(xì)菌或BTP是表達(dá)選自以下組的侵襲因子的葡萄球菌，所述組包括但不限于纖連蛋白結(jié)合蛋白任選地，所述天然具有侵襲性的細(xì)菌或BTP是表達(dá)選自以下組的侵襲因子的鏈球菌，所述組包括但不限于纖連蛋白結(jié)合對比ACP、m3a、F2、Sfbl、Sfb2、 SOF和PFBP。任選地，所述天然具有侵襲性的細(xì)菌或BTP是表達(dá)侵襲因子FimB (整合素結(jié)合蛋白 fibriae)的牙銀口卜啉菌(Porphyromonas gingivalis)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述微生物是天然不具有侵襲性但已經(jīng)過修飾 (例如遺傳修飾)而具有侵襲性的細(xì)菌或BTP。任選地，所述天然不具有侵襲性的細(xì)菌或BTP 已通過表達(dá)選自以下組的侵襲因子對其進(jìn)行遺傳修飾而具有侵襲性，所述組包括但不限于侵襲素、YadA> RickA、RalF、NadA> OpaA> OpaC> 0pa52、InlA、InlB、Hpt、ActA、IpaA、IpaB、 IpaC、IpgD、IpaB-IpaC 復(fù)合體、VirA、IcsA、SipA、SipC、SpiC、SigD、SopB> SopE> SopE2、 SptP、FnBPA、FnBPB, ACP、Fba, F2、Sfbl、Sfb2、SOF、PFBP 和 FimB0在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述微生物是可具有天然侵襲性但已經(jīng)經(jīng)過修飾 (例如遺傳修飾)而表達(dá)一個(gè)或多個(gè)額外的侵襲因子的細(xì)菌或BTP。任選地，所述侵因子選自包括但不限于以下的組侵襲素、￥&(^、1 化1^、^1正、恥(^、0 34、0 3(、0 352311認(rèn)、11118、 Hpt> ActA> IpaA> IpaB> IpaC、IpgD、IpaB-IpaC §；☆#、VirA、IcsA、SipA、SipC、SpiC、SigD、 SopB, SopE, SopE2、SptP、FnBPA、FnBPB, ACP、Fba, F2、Sfbl、Sfb2、SOF、PFBP 和 FimB0天然具有侵襲性的微生物例如細(xì)菌或BTP可以具有特定的趨向性，即優(yōu)選的靶細(xì)胞?；蛘撸部梢詫ξ⑸?例如細(xì)菌或BTP)進(jìn)行修飾(例如遺傳修飾)而模仿第二微生物的趨向性。任選地，所述細(xì)菌或BTP是鏈球菌并且所述優(yōu)選的靶細(xì)胞選自包括但不限于以下的組咽上皮細(xì)胞、舌的口腔上皮細(xì)胞和粘膜上皮細(xì)胞。任選地，所述細(xì)菌或BTP是卟啉菌并且所述優(yōu)選的靶細(xì)胞選自包括但不限于口腔上皮細(xì)胞的組。任選地，所述細(xì)菌或BTP 是葡萄球菌并且所述優(yōu)選的靶細(xì)胞是粘膜上皮細(xì)胞。任選地，所述細(xì)菌或BTP是奈瑟氏菌并且所述優(yōu)選的靶細(xì)胞選自包括但不限于尿道上皮細(xì)胞和宮頸上皮細(xì)胞的組。任選地，所述細(xì)菌或BTP是大腸埃希氏菌并且所述優(yōu)選的靶細(xì)胞選自包括但不限于以下的組腸上皮細(xì)胞、尿道上皮細(xì)胞和上尿路的細(xì)胞。任選地，所述細(xì)菌或BTP是包特氏菌并且所述優(yōu)選的靶細(xì)胞是呼吸道上皮細(xì)胞。任選地，所述細(xì)菌或BTP是弧菌并且所述優(yōu)選的靶細(xì)胞是腸上皮細(xì)胞。任選地，所述細(xì)菌或BTP是螺旋體并且所述優(yōu)選的靶細(xì)胞是粘膜上皮細(xì)胞。任選地，所述細(xì)菌或BTP是支原體并且所述優(yōu)選的靶細(xì)胞是呼吸道上皮細(xì)胞。任選地，所述細(xì)菌或BTP是螺桿菌并且所述優(yōu)選的靶細(xì)胞是胃內(nèi)皮細(xì)胞。任選地，所述細(xì)菌或BTP是衣原體并且所述優(yōu)選的靶細(xì)胞選自包括但不限于結(jié)膜細(xì)胞和尿道上皮細(xì)胞的組。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述微生物是經(jīng)過修飾(例如遺傳修飾)以具有特定趨向性的細(xì)菌或BTP。任選地，所述優(yōu)選的靶細(xì)胞選自包括但不限于由以下組成的組 咽上皮細(xì)胞、舌的口腔上皮細(xì)胞、粘膜上皮細(xì)胞、口腔上皮細(xì)胞、尿道上皮細(xì)胞、宮頸上皮細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、呼吸道上皮細(xì)胞、上尿路的細(xì)胞、胃上皮細(xì)胞和結(jié)膜細(xì)胞。任選地，所述優(yōu)選的靶細(xì)胞是發(fā)育異常的或癌性上皮細(xì)胞。任選地，所述優(yōu)選的靶細(xì)胞是激活的或靜息的免疫細(xì)胞?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法測定至少一個(gè)分子至靶細(xì)胞的遞送。例如，可以利用雜交或PCR方法，或者利用可包括抗體使用在內(nèi)的免疫學(xué)方法，通過由此沉默的RNA或蛋白的表達(dá)減少而測定所述分子的存在。測定微生物是否具有足以用于本發(fā)明應(yīng)用的侵襲性可以包括測定相對于與宿主細(xì)胞接觸的微生物的數(shù)量，是否有足夠的siRNA被遞送至宿主細(xì)胞。如果相對于所用微生
11物的量，SiRNA的量較少，則可能期望進(jìn)一步修飾所述微生物以提高其侵襲潛能?？梢酝ㄟ^多種方法測定進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)菌或BTP。細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌或BTP耐受氨基糖苷抗生素處理，而細(xì)胞外細(xì)菌被快速殺死?？梢酝ㄟ^用抗生素慶大霉素處理細(xì)胞單層以使細(xì)胞外細(xì)菌或BTP失活，然后在用溫和去污劑釋放存活的細(xì)胞內(nèi)生物前除去所述抗生素， 并測定在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌培養(yǎng)基上的存活數(shù)，而實(shí)現(xiàn)細(xì)菌或BTP攝取的定量估算。此外，可以通過例如細(xì)胞層的薄片透射電子顯微鏡或者通過免疫熒光技術(shù)直接觀察進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)菌或 BTP(Falkow et al. (1992)Annual Rev. Cell Biol. 8 :333)。因此，可以使用各種技術(shù)測定特定細(xì)菌或BTP是否能夠侵襲特定類型的細(xì)胞，或確定細(xì)菌或BTP修飾(修飾此細(xì)菌的趨向性以模仿第二細(xì)菌的趨向性)之后的細(xì)菌侵襲。根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選可以用于遞送RNA的細(xì)菌或BTP為不致病的。然而也可以使用致病細(xì)菌或BTP，前提是其致病性已經(jīng)減弱，由此使所述細(xì)菌對所施用的受試者無害。 本文使用的術(shù)語“減毒的細(xì)菌或BTP”是指已經(jīng)過修飾以顯著降低或消除了其對受試者的有害性的細(xì)菌或BTP?？梢酝ㄟ^以下所列的多種方法對致病細(xì)菌或BTP進(jìn)行減毒。無論其具體的作用機(jī)制如何，向真核細(xì)胞遞送RNA的所述細(xì)菌或BTP可以根據(jù)細(xì)菌或BTP的類型而進(jìn)入細(xì)胞的各種區(qū)室。例如，所述細(xì)菌或BTP可以在小泡(例如吞噬細(xì)胞小泡)中。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，所述細(xì)菌或BTP可以被破壞或裂解，并且其內(nèi)容物被遞送至真核細(xì)胞中。還可以對細(xì)菌或BTP進(jìn)行工程加工以表達(dá)吞噬體降解蛋白從而使RNA 從吞噬體漏出。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)菌或BTP表達(dá)(天然表達(dá)或者通過諸如遺傳修飾的修飾而表達(dá))促進(jìn)所述吞噬體的形成孔、破裂或降解的蛋白。任選地，所述蛋白是膽固醇依賴性溶細(xì)胞素。任選地，所述蛋白選自由以下組成的組李斯特菌溶素(Iisteriolysin)、伊萬諾夫溶素(ivanolysin)、鏈球菌溶素(str印tolysin)、神經(jīng)磷脂酶、產(chǎn)氣莢膜梭菌溶素(perfringolysin)、肉毒溶菌素(botulinolysin)、殺白細(xì)胞素 (Ieukocidin)、炭疽毒素、磷脂酶、IpaB(侵襲質(zhì)?？乖?、IpaH, IcsB(細(xì)胞內(nèi)傳播)、DOT/ Icm(細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷/細(xì)胞內(nèi)繁殖缺陷)、D0TU(D0T/Icm復(fù)合體的穩(wěn)定因子)、IcmF和 PmrA (多藥耐藥外排泵)。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)菌可以在真核細(xì)胞中保持存活不同的時(shí)間長度，并且可以持續(xù)產(chǎn)生RNA。然后，所述RNA或編碼RNA的DNA可以通過例如泄漏而從細(xì)菌釋放至細(xì)胞中。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，所述細(xì)菌還可以在真核細(xì)胞中復(fù)制。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)菌復(fù)制不殺死宿主細(xì)胞。本發(fā)明不限于通過具體機(jī)制遞送RNA或編碼RNA的DNA， 且旨在包括可以通過細(xì)菌遞送RNA或編碼RNA的DNA的方法和組合物，而與其遞送機(jī)理無關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于本發(fā)明應(yīng)用的細(xì)菌或BTP是不致病的或者無毒的。在本實(shí)施方式的另一個(gè)方面，所述細(xì)菌或BTP是治療性的。在該實(shí)施方式的另一方面，所述細(xì)菌或BTP是選自但不限于以下的減毒株或其衍生物耶爾森氏菌、立克次氏體、軍團(tuán)菌、 布魯氏菌、分枝桿菌、螺旋菌、嗜血菌(Haemophilus)、考克斯菌、衣原體、奈瑟氏菌、伯克霍爾德氏菌、包特氏菌、布魯氏菌、李斯特菌、志賀氏菌、沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、卟啉菌、螺旋體、弧菌、大腸埃希氏菌和雙歧桿菌。任選地，所述耶爾森氏菌是假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)種的減毒株。任選地，所述耶爾森氏菌株是小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌種的減毒株。任選地，所述立克次氏體菌株是Rickettsia coronii種的減毒株。任選地，所述軍團(tuán)菌菌株是嗜肺性軍團(tuán)菌(Legionella pneumophilia)種的減毒株。任選地，所述分支桿菌菌株是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)種的減毒株。任選地，所述分支桿菌菌株是牛分枝桿菌(Mycobacterium boviS)BCG種的減毒株。任選地，所述螺桿菌菌株是幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)種的減毒株。任選地，所述考克斯菌菌株是貝氏考克斯菌(Coxiella burnetti)的減毒株。任選地，所述嗜血菌菌株是流感嗜血菌(Haemophilus influenza)種的減毒株。任選地，所述衣原體菌株是砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis)種的減毒株。任選地，所述衣原體菌株是肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)種的減毒株。任選地，所述奈瑟氏菌菌株是淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrheae)種的減毒株。任選地，所述奈瑟氏菌菌株是腦膜炎奈瑟氏菌 (Neisseria meningitides)種的減毒株。任選地，所述伯克霍爾德氏菌菌株是洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkolderia cepacia)種的減毒株。任選地，所述包特氏菌菌株是百日咳包特氏菌(Bordetella pertussis)種的減毒株。任選地，所述布魯氏菌菌株是Borrelia hermisii 種的減毒株。任選地，所述李斯特菌菌株是單核細(xì)胞增生李斯特菌種的減毒株。任選地，所述李斯特菌菌株是伊萬諾夫李斯特菌(Listeria ivanovii)種的減毒株。任選地，所述沙門氏菌菌株是腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)種的減毒株。任選地，所述沙門氏菌菌株是鼠傷寒沙門氏菌種的減毒株。任選地，所述鼠傷寒沙門氏菌菌株是SL 7207或VNP20009。 任選地，所述葡萄球菌菌株是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)種的減毒株。任選地，所述鏈球菌菌株是化膿性鏈球菌(Str印tococcus pyogenes)種的減毒株。任選地， 所述鏈球菌菌株是變形鏈球菌(Str印tococcus mutans)種的減毒株。任選地，所述鏈球菌菌株是唾液鏈球菌(Str印tococcus salivarius)種的減毒株。任選地，所述鏈球菌菌株是肺炎鏈球菌(Str印tococcus pneumonia)種的減毒株。任選地，所述卟啉菌菌株是牙齦卟啉菌種的減毒株。任選地，所述假單胞菌菌株是銅綠假單胞菌O^seudomonas aeruginosa) 種的減毒株。任選地，所述螺旋體菌株是梅毒螺旋體(Tr印onema pallidum)種的減毒株。 任選地，所述弧菌菌株是霍亂弧菌(Vibrio cholerae)種的減毒株。任選地，所述大腸埃希氏菌菌株為MIC94。以下列出的是已在文獻(xiàn)中描述具有天然侵襲性的細(xì)菌的實(shí)例(第1. 1部分)、文獻(xiàn)中描述為天然不具有侵襲性的細(xì)菌(第1. 2部分)以及天然的不致病的或者減毒的細(xì)菌。 雖然已經(jīng)描述一些細(xì)菌不具有侵襲性(第1.2部分)，但這些細(xì)菌可能仍然具有足以用于本發(fā)明的侵襲性。不論通常描述的具有天然侵襲性的細(xì)菌或不具有侵襲性的細(xì)菌，任何細(xì)菌菌株都可以經(jīng)修飾而調(diào)節(jié)尤其是提高其侵襲特性(例如在第1. 3部分的描述)。1. 1天然具有侵襲性的細(xì)菌在本發(fā)明中使用的具體天然侵襲性細(xì)菌對本發(fā)明并不重要。此天然存在的具有侵襲性的細(xì)菌包括，但不限于志賀氏菌、沙門氏菌、李斯特菌、立克次氏體和腸侵襲性大腸埃希氏菌。所采用的具體志賀氏菌菌株對本發(fā)明并不重要?？稍诒景l(fā)明中使用的志賀氏菌菌株的實(shí)例包括福氏志賀氏菌加仏了⑶No. 29903)、宋內(nèi)志賀菌(Shigella sonnei) (ATCC No. 29930)和痢疾志賀氏菌(Shigella disenteriae) (ATCC No. 13313)。本發(fā)明優(yōu)選使用減毒的志賀氏菌株，例如福氏志賀氏菌加2457T aroA virG突變體CVD 1203 (Noriega et al.見上文)、福氏志賀氏菌 M90T icsA 突變體(Goldberg et al. Infect. Immun.,62 :5664-5668 (1994))、福氏志賀氏菌 Y SFLl 14 aroD 突變體(Karnell et al. Vacc. , 10 167-174(1992))和福氏志賀氏菌 aroA aroD 突變體(Verma et al. Vacc.，9 :6_9 (1991))。 或者，也可以通過引入單個(gè)減毒突變或者引入所述單個(gè)減毒突變與一個(gè)或多個(gè)其他減毒突變的組合而構(gòu)建新的減毒志賀氏菌株。志賀氏菌細(xì)菌作為遞送載體的至少一個(gè)優(yōu)勢是其對結(jié)腸粘膜表面的淋巴組織的趨向性。此外，認(rèn)為志賀氏菌復(fù)制的主要位點(diǎn)在常見于粘膜淋巴組織的M細(xì)胞基部側(cè)面的樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)(McGhee, J. R. et al. (1994)Reproduction, Fertility, & Development 6 369 ；Pascual, D. W. et al. (1994) Immunomethods 5:56 的綜述)。因此，志賀氏菌載體可提供靶向RNA干擾或遞送治療分子至這些專門的抗原呈遞細(xì)胞的方式。志賀氏菌載體的另一個(gè)優(yōu)勢在于減毒的志賀氏菌株在體外和體內(nèi)遞送核酸報(bào)告基因(Sizemore, D. R. et al. (1995)Science 270 :299 ；Courvalin, P. et al. (1995)Comptes Rendus de 1 Academie des Sciences Serie Ill-Sciences de la Vie—Life Sciences 318 :1207 ；Powell, R. J. et al. (1996)In :Molecular approaches to the control of infectious diseases.F. Brown, E. Norrby, D. Burton and J. Mekalanos, eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York. 183 ；Anderson，R. J. et al. (1997)Abstracts for the 97th General Meeting of the American Society for Microbiology :E.)。在實(shí)用方面，志賀氏菌嚴(yán)格受限的宿主特異性能夠防止志賀氏菌載體通過中間宿主向食物鏈內(nèi)擴(kuò)散。此外，已經(jīng)幵發(fā)出了在嚙齒動(dòng)物、靈長類和志愿者體內(nèi)高度減毒的減毒株(Anderson et al. (1997)見上文；Li，A. et al. (1992) Vaccine 10 :395 ；Li，A. et al. (1993) Vaccine 11 180 ；Karnell, A. et al. (1995) Vaccine 13 88 ；Sansonetti, P. J. and J. Arondel (1989) Vaccine 7 :443 ；Fontaine，A. et al. (1990) Research in Microbiology 141 :907 ； Sansonetti，P. J. et al. (1991) Vaccine 9 :416 ；Noriega，F(xiàn). R. et al. (1994) Infection & Immunity 62 :5168 ；Noriega，F(xiàn). R. et al. (1996)Infection & Immunity 64 :3055 ； Noriega，F(xiàn). R. et al. (1996) Infection & Immunity 64 :23 ；Noriega，F(xiàn). R. et al. (1996) Infection & Immunity 64:3055 ；Kotloff，K. L et al. (1996) Infection & Immunity 64: 4542)。最后一項(xiàng)知識允許開發(fā)在人中使用的良好耐受的志賀氏菌載體。已經(jīng)通過非特異性誘變，利用如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍試劑的化學(xué)方法，或者利用重組DNA技術(shù)；經(jīng)典遺傳技術(shù)，例如TnlO誘變、P22-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、λ噬菌體介導(dǎo)的交換(crossover)和接合轉(zhuǎn)移；或者利用重組DNA技術(shù)的定點(diǎn)誘變，將減毒突變引入至細(xì)菌病原體中。由于通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建的菌株更為確定，因此優(yōu)選重組DNA技術(shù)。此類減毒突變的實(shí)例包括，但不限于(i)營養(yǎng)缺陷型突變，例如 aro(Hoiseth et al. Nature, 291 :238-239 (1981)), gua(McFarland et al. Microbiol. Path. , 3 129-141 (1987)), nad (Park et al.J. Bact., 170 :3725-3730 (1988)，thy (Nnalue et al.Infect. Immun. ,55 :955-962 (1987))禾口 asd(Curtiss，見上文)突變；(ii)使整體調(diào)節(jié)功能失活的突變，例如cya(Curtiss et al. Infect. Immun.， 55 :3035-3043(1987)), crp(Curtiss et al (1987), B ± JC ), phoP/phoQ(Groisman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. , USA,86 :7077-7081 (1989) ；and Miller et al. Proc. Natl. Acad. Sci. ， USA,86 :5054-5058 (1989)) , phopc(Miller et al. J. Bact. ，172 2485-2490(1990))或 ompR(Dorman et al. Infect. Immun. ,57 :2136-2140(1989))突變；(iii)改變脅迫應(yīng)答的突變，例如 recA (Buchmeier et al. Mol. Micro.，7 933-936(1993))，htrA (Johnson et al. Mol. Micro.，5 :401-407(1991))，htpR(Neidhardt et al. Biochem. Biophys. Res. Com. , 100 :894-900 (1981)), hsp (Neidhardt et al.Ann. Rev. Genet. , 18 :295-329(1984))和 groEL(Buchmeier et al. Sci. ,248 :730-732(1990)) 突變；(iv)特定毒力因子的突變，例如 IsyA (Libby et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA，91 :489-493(1994))，pag 或 prg(Miller et al (1990)，見上文；and Miller et al(1989)，見上文)，iscA或 virG(d' Hauteville et al. Mol. Micro.，6 :833-841 (1992))， plcA (Mengaud et al. Mol. Microbiol. ,5 :367-72 (1991) ；Camilli et al. J. Exp. Med，173 :751-754(1991))禾口 act(Brundage et al. Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 90 11890-11894(1993))突變；(ν)影口向 DNA 拓?fù)鋵W(xué)的突變，例如 topA (Galan et al. Infect. Immun. ,58 1879-1885(1990))；(vi)打斷或改變細(xì)胞周期的突變，例如min(de Boer et al. Cell,56 641-649(1989))；(vii)引入編碼自殺系統(tǒng)的基因，例如 sacB(Recorbet et al. App. Environ. Micro.，59 :1361-1366(1993) ；Quandt et al. Gene,127 :15-21 (1993)), nuc (Ahrenholtz et al.App. Environ. Micro. ,60 :3746-3751 (1994)), hok, gef, kil phlA(Molin et al.Ann. Rev. Microbiol.，47 :139-166(1993))；(viii)改變脂多糖和/或脂質(zhì)A的生物發(fā)生的突變，例如rfb (Raetz in Esherishia coli and Salmonella typhimurium, Neidhardt et al. , Ed. , ASM Press, Washington D. C. pp 1035-1063 (1996)), galE(Hone et al. J. Infect. Dis. , 156 164-167(1987))和 htrB (Raetz，見上文)、msbB (Reatz，見上文)；(ix)引入噬菌體裂解系統(tǒng)，例如P22編碼的溶素原(Rennell et al. Virol, 143 280-289(1985))，λ 胞壁質(zhì)糖基轉(zhuǎn)移酶(Bienkowskalzewczyk et al. Mol. Gen. Genet., 184 :111-114(1981))或 S-基因(Reader et al. Virol,43 :623-628(1971))；和所述減毒突變可以為組成型表達(dá)或者受誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制，例如溫度敏感性熱休克蛋白家族的啟動(dòng)子(Neidhardt et al.見上文)，或者厭氧誘導(dǎo)的nirB啟動(dòng)子(Harborne et al. Mol. Micro.，6 :2805-2813 (1992))或者阻遏型啟動(dòng)子，例如 uapA(Gorfinkiel et al.J. Biol. Chem. ,268 :23376-23381 (1993))或 gcv (Stauffer et al. J. Bact.，176 :6159-6164 (1994))。 所采用的具體李斯特菌菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明可以使用的李斯特菌菌株的實(shí)例包括單核細(xì)胞增生李斯特菌(ATCC No. 1531 。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的李斯特菌菌株，例如單核細(xì)胞增生李斯特菌actA突變體(Brundage et al.見上文)或單核細(xì)胞增生李斯特菌 PIcA(Camilli et al. J. Exp. Med.，173 :751-754(1991))?；蛘?，可以如以上對志賀氏菌的描述，通過引入(i)至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建新的減毒李斯特菌菌株。 所采用的具體沙門氏菌菌株對本發(fā)明并不重要?？梢栽诒景l(fā)明中使用的沙門氏菌菌株的實(shí)例包括傷寒沙門氏菌(ATCC No. 7251)和鼠傷寒沙門氏菌(S. typhimurium) (ATCC No. 13311)。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的沙門氏菌菌株，其包括S. typhi-aroC-aroD(Hone et al. Vacc. 9 :810(1991)和鼠傷寒沙門氏菌-aroA 突變體(Mastroeni et al. Micro. Pathol. 13 :477(1992))?；蛘撸梢匀缫陨蠈χ举R氏菌菌種描述，通過引入一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建新的減毒沙門氏菌菌株。所采用的具體立克次氏體菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明中可以使用的立克次氏體菌株的實(shí)例包括立氏立克次氏體(Rickettsia Rickettsiae) (ATCC Nos. VR149 和 VR891)、Ricketsia prowaseckii (ATCC No. VR233)、恙蟲病立克次氏體(Rickettsia tsutsugamuchi) (ATCC Nos. VR312、VR150 和 VR609)、莫氏立克次氏體(Rickettsia mooseri) (ATCC No. VR144)、西伯利亞立克次氏體(Rickettsia sibirica) (ATCC No. VR151)和五日熱立克次氏體(Rochalimaea qui tana) (ATCC No. VR358)。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的立克次氏體菌株，并且可以如以上對志賀氏菌菌種的描述，通過引入(i)至 (vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建所述菌株。所采用的具體腸侵襲性埃希氏菌菌株對本發(fā)明并不重要。在本發(fā)明中可以使用的腸侵襲性埃希氏菌菌株的實(shí)例包括大腸埃希氏菌4608-58、1184-68、53638-C-17、13-80和 6-81 (Sansonetti et al. Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur)，132A :351-355 (1982))。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的腸侵襲性埃希氏菌菌株，并且可以如以上對志賀氏菌菌種的描述，通過引入(i)至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建所述菌株。此外，由于除細(xì)菌外的某些微生物還能夠與用于細(xì)胞攝取的整合素分子(其為某些侵襲因子的受體)相互作用，這些微生物也可以用于向靶細(xì)胞中引入RNA。例如，與整合素分子相互作用的諸如口足病病毒、艾柯病毒和腺病毒的病毒，以及諸如莢膜組織胞漿菌 (Histoplasma capsulatum)禾口碩大禾[I什曼原蟲(Leishmania major)的真核病原體。1.2侵襲性較小的細(xì)菌本發(fā)明中可以使用的，已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述為不具有侵襲性或者至少比上文第1. 1部分列出的細(xì)菌的侵襲性小的細(xì)菌的實(shí)例包括，但不限于耶爾森氏菌、埃希氏菌(Escherichia spp.)、克雷伯菌(Klebsiella spp.)、包特氏菌、奈瑟氏菌、氣單胞菌(Aeromonas spp·)、弗朗西斯菌(Franciesella spp·)、棒狀桿菌(Corynebacterium spp.)、檸檬酸桿菌(Citrobacter spp.)、衣原體、嗜血桿菌(Hemophilus spp.)、布魯氏菌、 分枝桿菌、軍團(tuán)菌、紅球菌(Rhodococcus spp.)、假單胞菌(Pseudomonas spp.)、螺桿菌、弧菌、桿菌(Bacillus spp.)和丹毒絲菌(Erysipelothrix spp)?？赡鼙仨殞@些細(xì)菌進(jìn)行修飾以提高其侵襲潛能。所采用的具體耶爾森氏菌株對本發(fā)明并不重要?？梢栽诒景l(fā)明中使用的耶爾森氏菌株的實(shí)例包括小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Y. enterocolitica) (ATCC No. 9610)或鼠疫耶爾森氏菌(Y. pestis) (ATCC No. 194 )。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的耶爾森氏菌株，例如小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌 Ye03-R2(al-Hendy et al. Infect. Immun. ,60 :870-875(1992))或小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌 aroA(0' Gaora et al. Micro. Path.，9 105-116 (1990))?；蛘?，可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入(i)至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建新的減毒耶爾森氏菌株。所采用的具體埃希氏菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明中可以使用的埃希氏菌株的實(shí)例包括大腸埃希氏菌 Nissle 1917, MM294, H10407 (Elinghorst et al. Infect. Immun. ,60 :2409-2417(1992))和大腸埃希氏菌 EFC4、CFT325 和 CPZ005 (Donnenberg et al. J. Infect. Dis. ,169 :831-838 (1994))。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的埃希氏菌株，例如減毒的火雞病原體大腸埃希氏菌02 carAB突變體(Kwaga et al. Infect. Immun. ,62 3766-3772(1994))或CEQ201。或者，可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入(i)至 (vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建新的減毒埃希氏菌株。所采用的具體克雷伯菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明中可以使用的克雷伯菌株的實(shí)例包括肺炎克雷伯菌(ATCC No. 13884)。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的克雷伯菌株，并且可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入(i)至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建所述菌株。所采用的具體包特氏菌菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明中可以使用的包特氏菌菌株的實(shí)例包括支氣管炎包特氏菌(ATCC No. 193%)。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的包特氏菌菌株，并且可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入(i)至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建所述菌株。所采用的具體奈瑟氏菌菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明中可以使用的奈瑟氏菌菌株的實(shí)例包括腦膜炎奈瑟氏菌(ATCC No. 13077)和淋病奈瑟氏菌(ATCC No. 19424)。本發(fā)明優(yōu)選使用減毒的奈瑟氏菌菌株，例如淋病奈瑟氏菌MSll aro突變體(Chamberlain et al. Micro. Path. ,15 :51-63 (1993))。或者，可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入⑴ 至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建新的減毒奈瑟氏菌菌株。所采用的具體氣單胞菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明中可以使用的氣單胞菌株的實(shí)例包括嗜礦泉?dú)鈫伟?A. eucrenophila) (ATCC No. 23309)。或者，可以如以上對志賀氏菌種描述，通過引入(i)至(vii)組中一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建新的減毒氣單胞菌株。所采用的具體弗朗西斯菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明可以使用的弗朗西斯菌株的實(shí)例包括土拉熱弗朗西斯菌(F. tularensis) (ATCC No. 15482)。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的弗朗西斯菌菌株，并且可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入(i)至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建所述菌株。所采用的具體棒狀桿菌菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明中可以使用的棒狀桿菌菌株的實(shí)例包括假結(jié)核棒狀桿菌菌(C. pseudotuberculosis) (ATCC No. 19410)。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的棒狀桿菌菌株，并且可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入(i)至 (vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建所述菌株。所采用的具體檸檬酸桿菌菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明中可以使用的檸檬酸桿菌菌株的實(shí)例包括弗氏檸檬酸桿菌(C. freundii) (ATCC No. 8090)。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的檸檬酸桿菌菌株，并且可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入⑴至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建所述菌株。所采用的具體衣原體菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明可以使用的衣原體菌株的實(shí)例包括肺炎衣原體(ATCC NO.VR1310)。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的衣原體菌株，并且可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入(i)至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建所述菌株。所采用的具體嗜血桿菌菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明中可以使用的嗜血桿菌菌株的實(shí)例包括H. sornnus (ATCC No. 43625)。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的嗜血桿菌菌株，并且可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入(i)至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建所述菌株。所采用的具體布魯氏菌菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明中可以使用的布魯氏菌菌株的實(shí)例包括牛布魯氏菌(B. abortus) (ATCC No. 23448)。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的布魯氏菌菌株，并且可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入(i)至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建所述菌株。所采用的具體分支桿菌菌株對本發(fā)明并不重要?？梢栽诒景l(fā)明中使用的分支桿菌菌株的實(shí)例包括胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare) (ATCC No. 13950)和結(jié)核性分枝桿菌 (M. tuberculosis) (ATCC No. 27294)。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的分支桿菌菌株，并且可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入(i)至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建所述菌株。所采用的具體軍團(tuán)菌菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明可以使用的軍團(tuán)菌菌株的實(shí)例包括嗜肺軍團(tuán)菌(L. pneumophila) (ATCC No. 33156)。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的軍團(tuán)菌菌株，例如嗜肺軍團(tuán)菌mip突變體(Ott, FEMS Micro. Rev.，14 161-176 (1994))?；蛘撸梢匀缫陨蠈χ举R氏菌種的描述，通過引入(i)至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建新的減毒軍團(tuán)菌菌株。所采用的具體紅球菌菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明中可以使用的紅球菌菌株的實(shí)例包括馬紅球菌(R. equi) (ATCC No. 6939)。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的紅球菌菌株，并且可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入(i)至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建所述菌株。所采用的具體假單胞菌菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明中可以使用的假單胞菌菌株的實(shí)例包括銅綠假單胞菌(ATCC No. 23沈7)。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的假單胞菌菌株， 并且可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入(i)至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建所述菌株。所采用的具體螺桿菌菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明中可以使用的螺桿菌菌株的實(shí)例包括雪貂螺桿菌OLmustelae) (ATCC No. 43772)。在本發(fā)明中優(yōu)選使用減毒的螺桿菌菌株，并且可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入(i)至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建所述菌株。所采用的具體沙門氏菌菌株對本發(fā)明并不重要。可以在本發(fā)明中使用的沙門氏菌菌株的實(shí)例包括傷寒沙門氏菌(ATCC No. 7251)和鼠傷寒沙門氏菌(ATCC No. 13311)。本發(fā)明優(yōu)選使用減毒的沙門氏菌菌株，并且所述菌株包括鼠傷寒沙門氏菌aroC aroD(Hone et al. Vacc.，9 :810-816 (1991))和鼠傷寒沙門氏菌 aroA 突變體(Mastroeni et al. Micro. Pathol, 13 :477-491 (1992))) 0或者，可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入⑴至 (vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建新的減毒沙門氏菌菌株。所采用的具體弧菌菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明可以使用的弧菌菌株的實(shí)例包括霍亂弧菌(Vibrio cholerae) (ATCC No. 14035)和辛辛那提弧菌(Vibrio cincinnatiensis) (ATCC No. 35912)。本發(fā)明優(yōu)選使用減毒的弧菌菌株，所述菌株包括霍亂弧菌 RSI 毒性突變體(Taylor et al. J. Infect. Dis.，170 1518-1523 (1994))和霍亂弧菌ctxA、ace、zot、cep 突變體(Waldor et al. J. Infect. Dis.，170 :278-283 (1994))?；蛘?， 可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入(i)至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建新的減毒的弧菌菌株。所采用的具體桿菌菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明可以使用的桿菌菌株的實(shí)例包括枯草桿菌(Bacillus subtilis) (ATCC No. 6051)。本發(fā)明優(yōu)選使用減毒的桿菌菌株，并且所述菌株包括炭疽桿菌(B. anthracis)突變體 pXOl (Welkos et al. Micro. Pathol, 14 381-388(1993))和減毒的 BCG 菌株(Stover et al. Nat.，351 :456-460 (1991))。或者，可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入(i)至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建新的減毒桿菌菌株。所采用的具體丹毒絲菌菌株對本發(fā)明并不重要。本發(fā)明可以使用的丹毒絲菌菌株的實(shí)例包括豬丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae) (ATCC No. 19414)和扁桃體丹毒絲菌(Erysipelothrix tonsillarum) (ATCC No. 43339)。本發(fā)明優(yōu)選使用減毒的丹毒絲菌菌株，并且所述菌株包括豬丹毒絲菌Kg-Ia和Kg-2 (ffatarai et al. J. Vet. Med. Sci.， 55 :595-600(1993))和豬丹毒絲菌 ORVAC 突變體(Markowska-Daniel et al. Int. J. Med. Microb. Virol. Parisit. Infect. Dis.，277 :547-553 (1992))。或者，可以如以上對志賀氏菌種的描述，通過引入(i)至(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變而構(gòu)建新的減毒丹毒絲菌菌株。1.3.提高細(xì)菌菌株的侵襲性質(zhì)的方法無論是傳統(tǒng)意義上的侵襲性生物還是非侵襲性生物，這些生物都可以例如通過模仿志賀氏菌、李斯特菌、立克次氏體或腸侵襲性大腸埃希氏菌的侵襲性質(zhì)而對其進(jìn)行工程加工以提高其侵襲性質(zhì)。例如，可以向微生物中引入能夠使所述微生物進(jìn)入細(xì)胞(例如所述非侵襲性細(xì)菌的天然宿主的細(xì)胞)的細(xì)胞質(zhì)中的一個(gè)或多個(gè)基因。在本文稱為“細(xì)胞質(zhì)靶向基因”的此類基因的實(shí)例包括編碼能夠使志賀氏菌侵襲的蛋白的基因，或者腸侵襲性埃希氏菌的類似侵襲基因或者李斯特菌的李斯特菌溶素0，因此，已知此類技術(shù)使多種侵襲性細(xì)菌能夠侵襲并進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(Formal et al. Infect. Immun. ,46 :465(1984) ；Bielecke et al. Nature, 345 175-176(1990)； Small et al. In :Microbiology_1986, pages 121—124 ；Levine et al. Eds. , American Society for Microbiology, Washington, D. C. (1986) ；Zychlinsky et al. Molec. Micro., 11 :619-627(1994) ；Gentschev et al. (1995)Infection & Immunity 63 :4202 ；Isberg, R. R. and S. Falkow(1985)Nature 317 :262 ；禾口 Isberg, R. R. et al. (1987)Cell 50 :769)。 用于將以上細(xì)胞質(zhì)靶向基因轉(zhuǎn)入細(xì)菌菌株的方法是本領(lǐng)域熟知的?？梢砸爰?xì)菌以提高其侵襲性質(zhì)的另一個(gè)優(yōu)選基因編碼來自假結(jié)核耶爾森氏菌的侵襲素蛋白(Leong et al. EMBO J.，9 :1979(1990))?？梢詫⑶忠u素和李斯特菌溶素組合引入，由此進(jìn)一步提高所述細(xì)菌相對于單獨(dú)引入這些基因時(shí)的侵襲性質(zhì)。以上基因的描述是出于示例目的，然而，來自一個(gè)或多個(gè)來源的參與將來自微生物的分子(尤其是RNA或編碼RNA的DNA分子)遞送至細(xì)胞(例如動(dòng)物細(xì)胞)的細(xì)胞質(zhì)的任意基因或基因組合都可以滿足本發(fā)明，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。因此，此基因并不限于細(xì)菌基因，并且包括病毒基因，例如促進(jìn)內(nèi)滲裂解(endosmolysis)的流感病毒血凝素 HA-2 (Plank et al. J. Biol. Chem. ,269 12918-12924(1994))ο
可以通過例如從攜帶期望的細(xì)胞質(zhì)靶向基因的侵襲細(xì)菌分離的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得上述細(xì)胞質(zhì)靶向基因。可以根據(jù)本領(lǐng)域可得的，例如從以上列出的文獻(xiàn)和/或 GenBank(可從因特網(wǎng)上公開獲得，www, ncbi. nlm. nih. gov/)獲得的核苷酸序列設(shè)計(jì)PCR 用引物。可以設(shè)計(jì)PCR引物以擴(kuò)增細(xì)胞質(zhì)靶向基因、細(xì)胞質(zhì)靶向操縱子、細(xì)胞質(zhì)靶向基因簇或者細(xì)胞質(zhì)靶向基因的調(diào)節(jié)子。所采用的PCR策略將取決于靶標(biāo)侵襲細(xì)菌中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞質(zhì)靶向基因的遺傳構(gòu)造。所述PCR引物經(jīng)設(shè)計(jì)包含與靶DNA序列的開始和末端 DNA序列同源的序列。然后，可以將所述細(xì)胞質(zhì)靶向基因引入至靶細(xì)菌株，例如通過使用 Hfr 轉(zhuǎn)移或者質(zhì)粒遷移(Miller，A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1992) ；Bothwell et al.見上文；and Ausubel et al.見上文)，噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)(de Boer，見上文；Miller，見上文； and Ausubel et al.見上文)，化學(xué)轉(zhuǎn)化(Bothwell et al.見上文；Ausubel et al.見上文)，電穿孑L (Bothwel et al.見上文；Ausubel et al.見上文；and Sambrook,Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N. Y.)和物理轉(zhuǎn)化技術(shù)(Johnston et al.見上文；and Bottiwel 1，見上文)。可以將所述細(xì)胞質(zhì)靶向基因引入至溶原性噬菌體中(de Boer et al. Cell，56 :641-649 (1989))、 質(zhì)粒載體中(Curtiss et al.見上文)或者剪接至靶菌株的染色體中(Hone et al.見上文)。除了遺傳加工細(xì)菌和BTP以提高其侵襲性質(zhì)外，如上文所述，還可以通過將侵襲因子連接至細(xì)菌而對其進(jìn)行修飾。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，通過用侵襲因子例如蛋白侵襲素、侵襲素衍生物或者其足以進(jìn)行侵襲性的片段共價(jià)或非共價(jià)地包被細(xì)菌而使所述細(xì)菌具有更高的侵襲性。事實(shí)上，已經(jīng)證明用從假結(jié)核耶爾森氏菌純化的侵襲素，或者侵襲素的羧基末端192個(gè)氨基酸包被的非侵襲性細(xì)菌細(xì)胞能夠進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Leong et al. (1990)EMBO J. 9 1979)。此外，用侵襲素的羧基末端區(qū)域包被的乳膠珠被哺乳動(dòng)物細(xì)胞有效內(nèi)化；與此類似，用抗體固定化侵襲素包被的金黃色葡萄球菌菌株也被哺乳動(dòng)物細(xì)胞有效內(nèi)化(Isberg and Tran van Nhieu (1994) Ann. Rev. Genet. 27 :395 中綜述)?；蛘?，還可以用抗體、其變體或其片段包被細(xì)菌，其中所述抗體、其變體或其片段特異性地結(jié)合細(xì)菌進(jìn)入因子識別的表面分子。例如，已經(jīng)證明，如果用靶向整合素分子(例如α5β1，已知為與細(xì)菌侵襲素蛋白相互作用的表面分子)的單克隆抗體包被細(xì)菌，則所述細(xì)菌被內(nèi)化?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法制備此抗體。根據(jù)上文所述的方法，可以通過例如用抗體包被細(xì)菌，使所述細(xì)菌接觸具有所述抗體識別的表面受體的真核細(xì)胞，并監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的存在， 來測定所述抗體在介導(dǎo)細(xì)菌侵襲性中的功效。使侵襲因子與細(xì)菌表面相連的方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括交聯(lián)。3.質(zhì)粒和載體本發(fā)明還提供了包含編碼一個(gè)或多個(gè)SiRNA的至少一個(gè)DNA分子和至少一個(gè)啟動(dòng)子的至少一個(gè)載體或質(zhì)粒，其中所表達(dá)的siRNA干擾目標(biāo)基因的至少一個(gè)mRNA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含編碼一個(gè)或多個(gè)siRNA的至少一個(gè)DNA分子和與RNA 聚合酶III兼容的至少一個(gè)啟動(dòng)子或至少一個(gè)原核啟動(dòng)子的至少一個(gè)原核載體，其中所表達(dá)的siRNA干擾目標(biāo)基因的至少一個(gè)mRNA。本發(fā)明的TRIP(transkingd0m RNA干擾質(zhì)粒)載體和質(zhì)粒包含多克隆位點(diǎn)、啟動(dòng)
20子序列和終止子序列。所述TRIP載體和質(zhì)粒還包含編碼侵襲因子的一個(gè)或多個(gè)序列以允許非侵襲性細(xì)菌或BTP進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如編碼允許細(xì)菌或BTP進(jìn)入β 1-整合素陽性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的侵襲物的 Inv 基因座)(Young et al. ,J. Cell Biol. 116，197-207 (1992)) 和允許遺傳物質(zhì)逃離進(jìn)入小泡的一個(gè)或多個(gè)序列(例如編碼李斯特菌溶素OWHly A基因)(Mathew et al. , Gene Ther. 10,1105-1115(2003)and Grillot-Courvalin et al.， Nat. Biotechnol. 16，862-866 (1998))。在 PCT 公開 WO 06/066048 中進(jìn)一步描述了 TRIP (包含載體/質(zhì)粒示意圖)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述TRIP載體和質(zhì)粒中將引入在適當(dāng)啟動(dòng)子序列和終止子序列控制之下編碼短發(fā)夾RNA的發(fā)夾RNA表達(dá)盒。在這些構(gòu)建體的設(shè)計(jì)中，利用算法以顧及SiRNA開發(fā)中的一些已知難點(diǎn)，即⑴ 排除不合格性質(zhì)(SNP、干擾素基序)；(2)如果與ref Seq(19/21，與其它任何基因相隔> 17)具有同源性，則排除所述序列，和(3)如果具有顯著的miRNA種型匹配，則排除所述序列。如本文所述，在真核靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，或者在細(xì)菌或BTP中轉(zhuǎn)錄編碼一個(gè)或多個(gè) siRNA的一個(gè)或多個(gè)DNA分子。在DNA在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)siRNA在真核細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄為shRNA。所述真核細(xì)胞可以是體內(nèi)的、體外的或離體的。在本實(shí)施方式的一方面，編碼一個(gè)或多個(gè)siRNA的一個(gè)或多個(gè)DNA分子包含真核啟動(dòng)子。任選地，所述真核啟動(dòng)子是 RNA聚合酶III啟動(dòng)子。任選地，所述RNA聚合酶III啟動(dòng)子是TO啟動(dòng)子或Hl啟動(dòng)子。在DNA在細(xì)菌或BTP中轉(zhuǎn)錄的實(shí)施方式中，所述一個(gè)或多個(gè)DNA分子包含原核啟動(dòng)子。任選地，所述原核啟動(dòng)子是大腸埃希氏菌啟動(dòng)子。優(yōu)選地，所述大腸埃希氏菌啟動(dòng)子可以為T7啟動(dòng)子、lacUV5啟動(dòng)子、經(jīng)修飾的lacUV5啟動(dòng)子、RNA聚合酶啟動(dòng)子、gapA啟動(dòng)子、pAl啟動(dòng)子、Iac調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子、araC+ParaBAD啟動(dòng)子、T5啟動(dòng)子、Ptac啟動(dòng)子^strem et al,1998,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,9761-9766 ；Meng et al.，2001，Nucleic Acids Res. 29,4166-417 ；De Boer et al. , 1983, Proc. NatL Acad. Sci. USA 80，21—25)或者 recA 啟動(dòng)子。優(yōu)選地，啟動(dòng)子序列列于表1中。表權(quán)利要求
1.包含原核載體的侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌，所述載體包含編碼一個(gè)或多個(gè)siRNA的一個(gè)或多個(gè)DNA分子、經(jīng)修飾的Plaeuv5啟動(dòng)子、至少一個(gè)Inv基因座和至少一個(gè)HlyA基因，其中所述siRNA干擾β-連環(huán)蛋白的mRNA，并且與野生型大腸埃希氏細(xì)菌相比，所述侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌的RNase III活性降低。
2.原核載體，其包含編碼一個(gè)或多個(gè)siRNA的一個(gè)或多個(gè)DNA分子、經(jīng)修飾的Pla。OT5 啟動(dòng)子、至少一個(gè)Inv基因座和至少一個(gè)HlyA基因，其中所述siRNA干擾β-連環(huán)蛋白的 mRNA。
3.向哺乳動(dòng)物細(xì)胞遞送一個(gè)或多個(gè)siRNA的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引入權(quán)利要求1所述的至少一種侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌。
4.調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引入權(quán)利要求1所述的至少一種侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌。
5.治療或預(yù)防有需要的哺乳動(dòng)物的與連環(huán)蛋白過表達(dá)相關(guān)的疾病或病變的方法， 所述方法包括調(diào)節(jié)所述哺乳動(dòng)物中連環(huán)蛋白的表達(dá)，其包括向所述哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中引入權(quán)利要求1所述的至少一種侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌。
6.如權(quán)利要求1所述的侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌，其中，所述細(xì)菌中刪除了編碼RNase III的rnc基因。
7.如權(quán)利要求1所述的侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌，其中，與野生型大腸埃希氏細(xì)菌相比， 所述RNase III活性降低至少90%。
8.如權(quán)利要求1所述的侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌，其中，與野生型大腸埃希氏細(xì)菌相比， 所述RNase III活性降低至少95%。
9.如權(quán)利要求1所述的侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌，其中，與野生型大腸埃希氏細(xì)菌相比， 所述RNase III活性降低至少99%。
10.如權(quán)利要求1所述的侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌，其中，所述一個(gè)或多個(gè)DNA分子在所述侵襲性細(xì)菌中被轉(zhuǎn)錄成一個(gè)或多個(gè)shRNA。
11.如權(quán)利要求10所述的侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌，其中，所述一個(gè)或多個(gè)shRNA包含 3’懸端或平末端。
12.如權(quán)利要求11所述的侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌，其中，所述3’懸端為2-5個(gè)堿基對。
13.如權(quán)利要求11所述的侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌，其中，所述3’懸端不超過2個(gè)堿基對。
14.如權(quán)利要求10所述的侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌，其中，所述一個(gè)或多個(gè)shRNA被加工成一個(gè)或多個(gè)siRNA。
15.如權(quán)利要求1所述的侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌，其中，所述原核載體進(jìn)一步包含至少一個(gè)終止子序列。
16.如權(quán)利要求15所述的侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌，其中，所述至少一種終止子序列包含至少5個(gè)連續(xù)的胸苷堿基對。
17.如權(quán)利要求15所述的侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌，其中，所述細(xì)菌進(jìn)一步包含第二終止子序列。
18.如權(quán)利要求17所述的侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌，其中，所述第二終止子序列為rrnC 終止子序列。
19.如權(quán)利要求1所述的侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌，其中，所述原核啟動(dòng)子進(jìn)一步包含至少一個(gè)UP元件。
20.如權(quán)利要求1所述的侵襲性大腸埃希氏細(xì)菌，其中，所述侵襲性細(xì)菌為減毒的、不致病的或無毒的細(xì)菌。
21.組合物，其包含權(quán)利要求1所述的侵襲性細(xì)菌和藥學(xué)上可接受的載體。
22.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，用約1O3-1O11侵襲性細(xì)菌感染所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，用約IO5-1O9侵襲性細(xì)菌感染所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
24.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，以約0.1-1O6范圍的感染復(fù)數(shù)感染所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
25.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，以約1O2-1O4范圍的感染復(fù)數(shù)感染所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
26.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，與野生型β-連環(huán)蛋白表達(dá)相比，或者與向所述細(xì)胞引入所述侵襲性細(xì)菌之前的連環(huán)蛋白表達(dá)相比，所述連環(huán)蛋白表達(dá)降低。
27.如權(quán)利要求沈所述的方法，其中，所述連環(huán)蛋白表達(dá)降低是指連環(huán)蛋白 mRNA的表達(dá)降低。
28.如權(quán)利要求沈所述的方法，其中，所述連環(huán)蛋白表達(dá)降低是指連環(huán)蛋白的表達(dá)降低。
29.如權(quán)利要求沈所述的方法，其中，與野生型連環(huán)蛋白表達(dá)相比，或者與向所述細(xì)胞引入所述侵襲性細(xì)菌之前的連環(huán)蛋白表達(dá)相比，所述連環(huán)蛋白表達(dá)降低至少 50%。
30.如權(quán)利要求沈所述的方法，其中，與野生型連環(huán)蛋白表達(dá)相比，或者與向所述細(xì)胞引入所述侵襲性細(xì)菌之前的連環(huán)蛋白表達(dá)相比，所述連環(huán)蛋白表達(dá)降低至少 75%。
31.如權(quán)利要求沈所述的方法，其中，與野生型連環(huán)蛋白表達(dá)相比，或者與向所述細(xì)胞引入所述侵襲性細(xì)菌之前的連環(huán)蛋白表達(dá)相比，所述連環(huán)蛋白表達(dá)降低至少 90%。
32.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物的與連環(huán)蛋白過表達(dá)相關(guān)的疾病或病變選自由以下組成的組結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、Crohn氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、 家族性腺瘤性息肉病(FAP)、Gardner綜合征、肝細(xì)胞癌(HCC)、基細(xì)胞癌、毛母質(zhì)瘤、成髓細(xì)胞瘤和卵巢癌。
33.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自由以下組成的組結(jié)腸上皮細(xì)胞、直腸上皮細(xì)胞、小腸上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、皮膚上皮細(xì)胞、毛細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和卵巢細(xì)胞。
34.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物選自由以下組成的組人、牛、綿羊、 豬、貓、水牛、犬、山羊、馬、驢、鹿和靈長類。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物為人。
全文摘要
本發(fā)明提供了利用細(xì)菌或BTP向真核細(xì)胞遞送一個(gè)或多個(gè)小干擾RNA(siRNA)的方法。本發(fā)明還提供了利用所述細(xì)菌通過RNA干擾調(diào)節(jié)真核細(xì)胞中基因表達(dá)的方法，以及治療病毒性疾病和病變的方法。所述細(xì)菌或BTP包含一個(gè)或多個(gè)siRNA，或編碼一個(gè)或多個(gè)siRNA的一個(gè)或多個(gè)DNA分子。本發(fā)明還提供了與本發(fā)明的細(xì)菌一起使用以在真核細(xì)胞中引起RNA干擾的載體。
文檔編號C12N15/113GK102317457SQ200980145766
公開日2012年1月11日 申請日期2009年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日
發(fā)明者吉勒·雷默·博爾達(dá)克, 弗洛伊德·斯蒂芬·拉魯, 杰西卡·安·塞克斯頓, 約翰內(nèi)斯·海因里?！じ螉W夫, 莫雷斯沃爾·巴努達(dá)斯·瓦澤 申請人:瑪瑞納生物技術(shù)有限公司