專利名稱：：大腸埃希氏菌k88、k99、987p纖毛亞單位油乳劑疫苗的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防仔豬黃痢的大腸埃希氏菌K88、K99、987P纖毛亞單位油乳劑疫苗的制備方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：仔豬黃痢是由特定O抗原型的致病性大腸埃希氏菌(￡.co//)引起的初生仔豬的以下痢為特征的傳染病。該病主要導(dǎo)致1周齡內(nèi)(主要是1~3日齡)仔豬發(fā)病，以排出黃色水樣糞便和漸進(jìn)性死亡為特征，是影響規(guī)模化種豬場和農(nóng)村散養(yǎng)豬仔豬成活率的重要疾病(SalajkaE，etal..ColonizationfactordifferentfromK88,K99,F41，and987PinenterotoxigenicEscherichiacolistrainsisolatedfrompostweaningdiarrhoeainpigs.VetMicrobiol，1992，32(2):163;逄媛,等.仔豬腹渴性大腸桿菌基因工程疫苗的研究進(jìn)展.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2007,(5):2-3)。致仔豬黃痢的致病性大腸埃希氏菌的致病力主要由粘附素性纖毛和腸毒素兩類毒力因子構(gòu)成，二者密切相關(guān)且缺一不可。己發(fā)現(xiàn)豬大腸埃希氏菌的的纖毛主要有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)以及比例較小的F41。纖毛是一種蛋白質(zhì)，具有良好的免疫原性，以含單價或多價纖毛抗原的滅活全菌疫苗或亞單位疫苗對妊娠母豬進(jìn)行免疫，可使仔豬從初乳中獲得抗仔豬黃痢的被動保護(hù)力(袁萬哲等.仔豬大腸桿菌病K88-K99-987P-F41四價亞單位疫苗的研制V.疫苗生產(chǎn)與免疫效力試驗.中國獸醫(yī)學(xué)報，2007，27(6):818-821;GillP，PurchidVD.IdentificationofK88fimbriaeofE.coliassociatedwithpigletdiarrhea.IndianJournalofComparativeMicrobiologyImmunologyandInfectiveDiseases,1999,20(2):126-128;JinLZ,etal..InhibitionofenterotoxingenicEscherichiacoliK88,K99and987pbytheLactobacillusisolatesfromporcineintestine.JournaloftheScienceofFoodand3Agriculture,2000,80(5):619-624)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是由大腸埃希氏菌分別提取出F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)三種纖毛抗原按一定比例混合，然后與油佐劑進(jìn)行乳化制成大腸埃希氏菌K88、K99、987P纖毛亞單位油乳劑疫苗，用于預(yù)防仔豬黃痢。大腸埃希氏菌K88、K99、987P纖毛亞單位油乳劑疫苗的生產(chǎn)方法，主要是1.按發(fā)酵罐容積70%(V/V)加入改良Minca液體培養(yǎng)基，同時按培養(yǎng)基0.1%(V/V)加入消泡劑，通入高溫蒸汽滅菌30min，待培養(yǎng)基溫度降至35~37°C,按3%(V/V)向發(fā)酵罐中加入種子培養(yǎng)物，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度至37°C，調(diào)節(jié)融氧濃度至35%，培養(yǎng)5~7h分別制備含K88纖毛抗原的大腸埃希氏菌C83549菌抹的菌液、含K99纖毛抗原的大腸埃希氏菌C83644菌4朱的菌液和含987P纖毛抗原的大腸埃希氏菌C83710菌抹的菌液。2.各菌株發(fā)酵培養(yǎng)菌液經(jīng)管式離心機(jī)10000r/min離心30min,收獲的菌泥按0.1g/ml比例重新懸浮于生理鹽水中。采用剪切機(jī)對在58~65。C對含不同纖毛抗原的大腸埃希氏菌的菌懸液按5000~6000r/min的剪切強(qiáng)度剪切20~25min分別進(jìn)行各纖毛抗原的提取。3.按每lml成品苗中，K88纖毛抗原含量^100個抗原單位、K99纖毛抗原含量^50個抗原單位、987P纖毛抗原含量^50個抗原單位，配制混合纖毛液。4.按常規(guī)方法制備成油乳劑疫苗。具體實施例方式一、疫苗制備l.生產(chǎn)用種子制備(1)一級種子繁殖與鑒定將表達(dá)K88纖毛抗原的大腸埃希氏菌菌種C83549菌種接種到改良Minca液體培養(yǎng)基(每1000ml該培養(yǎng)基含KH2P041.36g，Na2HPO4'12H2020.3g，酵母粉lg,酪蛋白胨5g，甘油5ml，微量鹽液1ml,固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉15g。其中微量鹽溶液配方為每1000ml含MgSO4'2H2010g,MnCl2'4H20lg,FeCl26H200.135g，CaCl2.2H200.4g),37。C振蕩培養(yǎng)6~10h后，轉(zhuǎn)接到改良Minca固體培養(yǎng)基平板劃線分離，36~37。C培養(yǎng)20h，用低倍鏡選取光滑圓整的單個菌落若干，分別接入改良Minca液體培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)16h,用相應(yīng)的(K88、K99、987P)纖毛抗血清(購自于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)平板凝集反應(yīng)達(dá)"++++",純檢合格，按培養(yǎng)物量的10%(V/V)加入甘油混勻，分裝于滅菌小試管中，作為一級種子。用同樣方法分別制備表達(dá)K99纖毛抗原的大腸埃希氏菌C83644菌林和表達(dá)987P纖毛抗原的大腸埃希氏菌C83710菌株的一級種子。分別作好標(biāo)記(注明名稱、代次、分裝量、日期等)，在-20。C保存，使用期不超過6個月。(2)二級種子繁殖取以上制備的各一級種子直接接種改良Minca固體培養(yǎng)基平板，3637。C培養(yǎng)20小時，選取光滑圓整菌落，用相應(yīng)的纖毛抗血清逐個做平板凝集反應(yīng)，選取"++++，，的菌落若干個后混合接入改良Minca液體培養(yǎng)基，37。C搖振培養(yǎng)16h，以相應(yīng)的因子血清做平板凝集反應(yīng)，凝集反應(yīng)達(dá)到"++++",純檢合格，即可用于接種。在28。C保存，應(yīng)不超過7天。2.菌液培養(yǎng)釆用發(fā)酵培養(yǎng)法分別培養(yǎng)C83549、C83644、C83710菌林菌液。生產(chǎn)工藝流程如下按發(fā)酵罐容積70%加入改良Minca液體培養(yǎng)基，同時按培養(yǎng)基0.1%加入花生油，通入高溫蒸汽滅菌30min，待培養(yǎng)基溫度降至35~37°C，按3%向發(fā)酵罐中加入二級種子，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度至37。C,調(diào)節(jié)融氧濃度至35%，發(fā)酵培養(yǎng)57h。取小量樣品進(jìn)行染色鏡檢，無雜菌污染后，以相應(yīng)型纖毛抗血清進(jìn)行玻板凝集觀察纖毛生長情況，檢驗合格(凝集相在"+++，，以上)后，菌液經(jīng)管式離心機(jī)離心，菌泥按0.1g/ml比例重新懸浮于生理鹽水中。3.各菌抹發(fā)酵培養(yǎng)菌液經(jīng)管式離心機(jī)(CQ105型，湘潭離心機(jī)有限公司生產(chǎn)),10000r/min離心30min,分別收獲的菌泥按0.1g/ml比例重新懸浮于生理鹽水中。對重懸菌液中的K88、K99、987P纖毛抗原按以下條件進(jìn)行提取C83549抹懸液、C83710林懸液在60。C水浴條件下，以剪切機(jī)5000r/min剪切20min,C83644抹懸液在65。C水浴條件下，以剪切機(jī)6000r/min剪切20min。處理菌懸液經(jīng)連續(xù)流離心機(jī)(CR22G，日本日立公司生產(chǎn))，16000r/min離心30min，收集上清液，再經(jīng)無菌0.22pm纖維膜過濾除菌，置2~8。C保存?zhèn)溆?纖毛抗原的電泳圖見附圖1)。4.根據(jù)菌毛液的抗原單位高低不同，計算出三種菌毛液的配比量，按每lml成品苗中，K88纖毛抗原含量^100個抗原單位、K99纖毛抗原含量250個抗原單位、987P纖毛抗原含量^50個抗原單位，配制混合纖毛液。培養(yǎng)物中(K88、K99、987P)纖毛抗原含量的測定按以下方法進(jìn)行取試管若干支，第一管加入生理鹽水2ml，其余各管加入生理鹽水0.5ml，向第1管中加入待檢菌懸液0.5ml進(jìn)行5倍稀釋，然后從第2管開始對待檢菌懸液進(jìn)行1.25倍比系列稀釋。向所有試管中加入4個單位纖毛抗血清0.5ml,混勻后置38。C水浴2小時，耳又出以3000r/min離心30分鐘，吸出上清0.5ml移入新的試管中，同時設(shè)生理鹽水對照、因子血清對照和待;險菌懸液對照。向所有試管中加入指示抗原0.5ml,混勻后置2~8。C過夜后按以下公式計算待檢菌懸液纖毛抗原單位值。計算公式應(yīng)為待檢菌懸液纖毛抗原單位值=("-"稀釋倍數(shù)+"+"稀釋倍數(shù))x25.疫苗制備(1)水相配制取滅菌的吐溫-804份、無菌檢驗合格的混合纖毛液96份，加入配液罐中，開啟攪拌電機(jī)，勻速攪拌至吐溫-80完全溶解。6(2)油相制備取注射用白*油94份、司本-806份和硬脂酸鋁2份加入油相制備罐中，開啟攪拌電機(jī)，勻速攪拌，同時開啟導(dǎo)熱油開關(guān)，152。C加熱30min,冷卻后，導(dǎo)入貝i油罐中備用。(3)乳化取油相2份置于乳化罐內(nèi)，開動電機(jī)低速攪拌，同時緩緩加入水相1份，再以3000r/min攪拌30min,在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液，終濃度達(dá)到0.005%。乳化后，取樣3~5ml，以3000r/min離心15min,若有分層現(xiàn)象，應(yīng)重新乳化30min。(4)分裝定量分裝，加蓋密封。二、疫苗的安全試驗l.仔豬大腸埃希氏菌病三價纖毛疫苗對靶動物和非使用日齡動物的一次單劑量接種的安全性試驗將購自山東青島某良種豬場的斷奶前3~5天健康仔豬、配種前7天母豬和產(chǎn)前7天的懷孕初產(chǎn)母豬各分成4組，每組10頭，前3組為疫苗免疫試驗組，每組分別用由本發(fā)明人試制的大腸埃希氏菌K88、K99、987P纖毛亞單位油乳劑疫苗01、02、03批用頸部肌肉注射，2ml/頭的劑量各免疫l組，第4組為非免疫對照組。觀察免疫過后2周內(nèi)，試驗豬有無過敏，精神、飲食、糞便有無變化，注射部位有無紅腫、潰爛現(xiàn)象，仔豬增重或母豬產(chǎn)子情況是否正常。結(jié)果試驗豬均無過敏，精神、飲食、糞便無變化，注射部位無紅腫、潰爛現(xiàn)象，仔豬增重或母豬產(chǎn)子情況均正常。詳見表l、表2、表3。表1斷奶前35天健康仔豬一次單劑量接種安全性試驗結(jié)果組別數(shù)量(頭)疫苗批號接種劑量過敏現(xiàn)象飲食、精神膿腫增重情況11020060111頭份/無正常無正常21020060211頭份/無正常無正常310200603H頭份/無正常無正常410——_正常正常_表2配種前7天母豬一次單劑量接種安全性試驗結(jié)果_組別數(shù)量(頭)疫苗批號接種劑量過敏現(xiàn)象飲食、精神膿腫共產(chǎn)子數(shù)A102006011頭份/無正常無108B102006021頭份/無正常無111C102006031頭份/無正常無108_j_^_3_z:_z:__—107表3產(chǎn)前7天母豬一次單劑量接種安全性試驗結(jié)果_組別數(shù)量(頭)疫苗批號接種劑量過敏現(xiàn)象飲食、精神膿腫共產(chǎn)子數(shù)A10200601l頭份/頭無正常無110B10200602l頭份/頭無JH常無109C102006031頭份/頭無正常無108_d__rz_=_z:_正第'—ioz2.對產(chǎn)前35天懷孕母豬的一次超劑量接種安全試驗用本發(fā)明人試制的3批(01、02和03)大腸埃希氏菌K88、K99、987P纖毛亞單位油乳劑疫苗對購自山東青島某良種豬場產(chǎn)前35天懷孕母豬進(jìn)行頸部肌肉兩點注射，4ml/頭,觀察疫苗接種對免疫豬的安全性。結(jié)果表明，試制的3批疫苗對免疫豬無明顯影響，免疫豬無過敏現(xiàn)象，注射部位不紅腫，免疫豬的精神、飲食及產(chǎn)仔均正常，說明我們試制的疫苗一次超劑量接種懷孕母豬是安全的。詳見表4。表4懷孕豬一次超劑量接種安全性試驗結(jié)果組別數(shù)量(頭)疫苗批號接種劑量過敏現(xiàn)象飲食、精神狀況膿腫共產(chǎn)子數(shù)1102006014ml/頭無正常無110102006024ml/頭無正常無1112102006034ml/頭無jH常無10910—_一正?！?093.單劑量重復(fù)接種安全試驗用本發(fā)明人試制的3批(01、02和03)大腸埃希氏菌K88、K99、987P纖毛亞單位油乳劑疫苗對購自山東青島某良種豬場產(chǎn)前42天懷孕母豬分別于產(chǎn)前42、35天進(jìn)行頸部肌肉單劑量重復(fù)接種，1頭份/頭/次，觀察疫苗接種對免疫豬的安全性。結(jié)果表明，試制的3批疫苗對免疫懷孕母豬均無明顯影響，免疫豬無過敏現(xiàn)象，注射部位不紅腫，免疫豬的精神、飲食及產(chǎn)仔均正常，說明我們試制的疫苗重復(fù)接種懷8孕母豬是安全的。詳見表5。表5懷孕豬單劑量重復(fù)接種安全性試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4.疫苗接種對靶動物免疫學(xué)功能的影響用本發(fā)明人試制的3批(01、02和03)大腸埃希氏菌K88、K99、987P纖毛亞單位油乳劑疫苗對購自山東青島某良種豬場產(chǎn)前35天懷孕母豬進(jìn)行免疫接種，同時注射豬瘟活疫苗(購自乾元浩南京生物藥廠)，分組免疫后2周采血分離血清用購自中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所的豬瘥間接血凝診斷試劑盒測定豬瘟間接血凝效價。結(jié)果表明注射豬疸活疫苗同時注射大腸埃希氏菌K88、K99、987P纖毛亞單位油乳劑疫苗組與單獨注射豬瘟活疫苗組的平均效價差別不明顯，說明該疫苗對靶動物的免疫學(xué)功能沒有明顯影響。觀察疫苗接種對免疫豬免疫學(xué)功能的影響(結(jié)果見表6)_表6疫苗接種對靶動物免疫學(xué)功能的影響試驗結(jié)果_組別仔豬數(shù)量(頭)接種方法豬瘟間接血凝價平均效價1501批+豬瘟，各1頭份/頭5、5、5、6、452502批+豬瘟，各1頭份/頭5、5、6、5、453503批+豬瘟，各1頭份/頭5、5、6、4、55對照1_§_僅豬瘟苗，1頭份/頭_5、5、4、6、5_^對照2_^__0、1、1、1、2_5.疫苗接種對靶動物生產(chǎn)性能的影響用本發(fā)明人試制的3批(01、02和03)大腸埃希氏菌K88、K99、987P纖毛亞單位油乳劑疫苗對購自山東青島某良種豬場產(chǎn)前35天懷孕母豬進(jìn)行免疫接種，頸部肌肉注射2ml，結(jié)果表明試驗豬疫苗注射部位沒有紅腫現(xiàn)象，精神沒有受到影響，飲食正常，活動正常，母豬在生產(chǎn)過程中，無流產(chǎn)、弱仔等現(xiàn)象，試驗?zāi)肛i所產(chǎn)仔豬體健活潑，無弱仔。第4組作為非免疫對照。結(jié)果詳見表7。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>總計b:平均增重四、子代通過母源抗體獲得被動免疫力的效力和免疫期試驗用本發(fā)明人制備的大腸埃希氏菌K88、K99、987P纖毛亞單位油乳劑疫苗(02批)免疫購自青島平度市某良種豬場的產(chǎn)前35~42天健康懷孕(母豬血清中三種纖毛抗體的間接血凝效價均小于3(log2)),母豬產(chǎn)子后，將正常哺乳仔豬分組后交替采血分離血清，從l日齡釆血至7日齡，測定仔豬血清中特異性抗K88、K99、987P菌毛抗體平均效價(用青島易邦生物工程有限公司技術(shù)中心提供的三種纖毛抗體的間接血凝才企測試劑進(jìn)行才企測)。結(jié)果表明，免疫母豬所產(chǎn)的仔豬在吮吸母豬后12小時，血清中三種纖毛的抗體于對照仔豬相比即有明顯上升，K88、K99、987P纖毛抗體平均效價分別達(dá)到了8.1(log2)、6.3和9.4(log2),而對照仔豬三種纖毛的抗體效價均S2Uog2),至24小時，達(dá)到最高，K88、K99、987P纖毛抗體平均效價分別達(dá)到了1L5(log2)、10.6(1og2)和U.7(log2)，可維持至第4日齡，此后抗體水平開始下降，至第7、10天抗體水平仍可以檢測到。結(jié)果詳見表9。表9仔豬血清3種菌毛間接血凝(log2)抗體平均效價檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>日齡、5日齡、6日齡、7日齡、10日齡仔豬分別口服相應(yīng)效檢強(qiáng)毒菌株C83902抹、C83912株、C83917抹新鮮培養(yǎng)物5ml(含菌量為6~8xl(^CFU/ml)進(jìn)行強(qiáng)毒攻擊，每個型每次至少選擇4頭仔豬攻毒，同時選擇4頭相同條件的非免疫母豬所產(chǎn)仔豬同時攻毒作為對照。觀察攻毒仔豬下痢和致死情況。攻毒試驗表明，疫苗免疫后傳遞給子代的被動免疫力可以保護(hù)仔豬在整個哺乳期內(nèi)不發(fā)病(結(jié)果詳見表10)。表10被動免疫仔豬攻毒保護(hù)試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>6曰齡4/44/44/44/44/44/47曰齡4/44/44/44/44/44/410H齡4/44/44/44/44/44/4注表中分子表示攻毒后被保護(hù)仔豬數(shù)，分母表示攻毒仔豬總數(shù)。五、疫苗成品檢驗(1)性狀外觀乳白色乳液。劑型油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第一滴外，均應(yīng)呈油滴狀不擴(kuò)散。穩(wěn)定性吸取疫苗10ml加入離心管中，以3000r/min離心15min,管底析出的水相應(yīng)^0.5ml。粘度用lml吸管(下口內(nèi)徑為1.2mm,上口內(nèi)徑為2.7mm)吸取25。C左右疫苗l.Oml,令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需的時間，應(yīng)在6s以內(nèi)。(2)無菌檢驗按《中華人民共和國獸藥典》方法進(jìn)行，應(yīng)無菌生長。(3)安全檢驗取體重20kg左右健康仔豬4頭，每頭頸部肌肉注射4ml，觀察14日，應(yīng)無明顯的不良反應(yīng)。(4)效力檢驗取成品疫苗510ml，于-20。C反復(fù)凍融8次，以3000r/min離心15min，取管底析出的水相測定K88、K99、987P三種纖毛的抗原單位，以析出的水相中，K88纖毛抗原^300個抗原單位/ml、K99纖毛抗原2150個抗原單位/ml、987P纖毛抗原^150個抗原單位/ml為合格。(5)汞類防腐劑含量測定按《中華人民共和國獸藥典》方法進(jìn)行，應(yīng)符合獸用生物制品通則的規(guī)定。六、疫苗的作用與用途用于免疫妊娠母豬，新生仔豬通過吮吸母豬的初乳而獲得被動免疫。預(yù)防初生仔豬大腸埃希氏菌病(即仔豬黃痢)。七、用法與用量頸部肌肉注射，妊娠母豬在產(chǎn)仔前3542日免疫，2ml/頭。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明相對于傳統(tǒng)的預(yù)防仔豬黃痢的纖毛化菌體滅活的鋁膠疫苗或K88、K99基因工程疫苗，具有用量少、免疫效力高、免疫期長等優(yōu)點。圖1是本發(fā)明實施后，K88、K99、987P纖毛4是取的SDS-PAGE電泳圖。圖2是本發(fā)明研制疫苗的標(biāo)簽。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例1l.生產(chǎn)用種子制備(1)一級種子繁殖與鑒定將表達(dá)K88纖毛抗原的大腸埃希氏菌菌種C83549菌種接種到改良Minca液體培養(yǎng)基(每1000ml該培養(yǎng)基含KH2P041.36g，Na2HPO4-12H2020.3g，酵母粉lg，酪蛋白月東5g，甘油5ml，微量鹽液lml，固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉15g。其中微量鹽溶液配方為每1000ml含MgSO4'2H2010g，MnCl2'4H20lg，F(xiàn)eCl2.6H200.135g，CaCl2'2H200.4g),37。C振蕩培養(yǎng)6~10h后，轉(zhuǎn)接到改良Minca固體培養(yǎng)基平板劃線分離，3637。C培養(yǎng)20h,用低倍鏡選取光滑圓整的單個菌落若干，分別接入改良Minca液體培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)16h，與相應(yīng)纖毛抗血清的平板凝集反應(yīng)達(dá)"++++"，純檢合格，按培養(yǎng)物量的10%(V/V)加入甘油混勻，分裝于滅菌小試管中，作為一級種子。用同樣方法分別制備表達(dá)K99纖毛抗原的大腸埃希氏菌C83644菌林和表達(dá)987P纖毛抗原的大腸埃希氏菌C83710菌林的一級種子。分別作好標(biāo)記(注明名稱、代次、分裝量、日期等)，在-20。C保存，使用期不超過6個月(參見表ll)。表ll一級種子<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(2)二級種子繁殖取以上制備的各一級種子直接接種改良Minca固體培養(yǎng)基平板，3637。C培養(yǎng)20小時，選取光滑圓整菌落，用相應(yīng)的因子血清逐個做平板凝集反應(yīng)，選取"++++"的菌落若干個后混合接入改良Minca液體培養(yǎng)基，37。C搖振培養(yǎng)l6h，以相應(yīng)的纖毛抗血清做平板凝集反應(yīng)，凝集反應(yīng)達(dá)到"++++",純檢合格，即可用于接種。在28。C保存，應(yīng)不超過7天(參見表12)。表12二級種子K88數(shù)量(ml)1150使用培養(yǎng)基改良Minca纖毛生長情況與K88纖毛抗血清進(jìn)行凝集反應(yīng)，呈"++++"凝集K99數(shù)量(ml)U50使用培養(yǎng)基改良Minca纖毛生長情況與K99纖毛抗血清進(jìn)行凝集反應(yīng)，呈"++++"凝集987P數(shù)量(ml)1150使用培養(yǎng)基改良Minca纖毛生長情況與987P纖毛抗血清進(jìn)行凝集反應(yīng)，呈"++++"凝集2.菌液培養(yǎng)采用發(fā)酵培養(yǎng)法分別培養(yǎng)C83549、C83644、C83710菌抹菌液。生產(chǎn)工藝流程如下按發(fā)酵罐容積70%加入改良Minca液體培養(yǎng)基，同時按培養(yǎng)基0.1%加入花生油，通入高溫蒸汽滅菌30min,待培養(yǎng)基溫度降至35~37°C,按3%向發(fā)酵罐中加入二級種子，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度至37。C，調(diào)節(jié)融氧濃度至35%,發(fā)酵培養(yǎng)57h。取小量樣品進(jìn)行染色鏡檢，無雜菌污染后，以相應(yīng)型纖毛抗血清進(jìn)行玻板凝集觀察纖毛生長情況，檢驗合格(凝集相在"+++，，以上)后，菌液經(jīng)管式離心機(jī)離心，菌泥按0.1g/ml比例重新懸浮于生理鹽水中(參見表13)。表13發(fā)酵培養(yǎng)和收獲K88發(fā)酵培養(yǎng)基改良Minca發(fā)酵培養(yǎng)量(L)15消泡劑0.1%花生油溫度37°C溶氧35%收獲菌泥質(zhì)量(g)74菌懸液體積(ml)740K99發(fā)酵培養(yǎng)基改良Minca發(fā)酵培養(yǎng)量(L)15消泡劑0.1%花生油溫度37°C溶氧35%收獲菌泥質(zhì)量(g)70菌懸液體積(ml)700987P發(fā)酵培養(yǎng)基改良Minca發(fā)酵培養(yǎng)量(L)15消泡劑0.1%花生油溫度37°C溶氧35%收獲菌泥質(zhì)量(g)75菌懸液體積(ml)7503.混合纖毛液的制備各菌抹發(fā)酵培養(yǎng)菌液經(jīng)管式離心機(jī)(CQ105型，湘潭離心機(jī)有限公司生產(chǎn))10000r/min離心30min,分別收獲的菌泥按0.1g/m1比例重新懸浮于生理鹽水中。對重懸菌液中的K88、K99、987P纖毛抗原按以下條件進(jìn)行提取C835494朱懸液、C83710抹懸液在60。C水浴條件下，以剪切機(jī)5000r/min剪切20min，C83644株懸液在65。C水浴條件下，以剪切機(jī)6000r/min剪切20min。處理菌懸液經(jīng)連續(xù)流離心機(jī)(CR22G，日本日立公司生產(chǎn))，16000r/min離心30min，收集上清液，再經(jīng)無菌0.22pm纖維膜過濾除菌，置28。C保15存?zhèn)溆?參見表14)。表14菌毛提取、過濾和效價測定纖毛液種類纖毛液體積(ml)濾后體積(ml)效價(抗原單位/ml)K88纖毛液7006805112K99纖毛液6806402095987P纖毛液73069040%根據(jù)菌毛液的抗原單位高低不同，計算出三種菌毛液的配比量，按每lml成品苗中，K88纖毛抗原含量2100個抗原單位、K99纖毛抗原含量250個抗原單位、987P纖毛抗原含量^50個抗原單位，配制混合纖毛液。4.疫苗配制(參見表15)(1)水相配制取滅菌的吐溫-804份、無菌檢驗合格的混合纖毛液96份，加入配液罐中，開啟攪拌電才幾，勻速攪拌至吐溫-80完全(2)油相制備取注射用白油94份、司本-806份和硬脂酸鋁2份加入油相制備罐中，開啟攪拌電機(jī)，勻速攪拌，同時開啟導(dǎo)熱油開關(guān)，152。C加熱30min，冷卻后，導(dǎo)入貝i油罐中備用。(3)乳化取油相2份置于乳化罐內(nèi)，開動電機(jī)低速攪拌，同時緩緩加入水相1份，再以3000r/min攪拌30min，在終止攪拌前加入1%石克柳汞;容液，終濃度達(dá)到0.005%。(4)分裝定量分裝，加蓋密封。表15疫苗乳化和分裝水相制備K88纖毛液體積(ml)192K99纖毛液體積(ml)240987P纖毛液體積(ml)240吐溫-80體積(ml)120生理鹽水體積(ml)2208水相總體積(ml)3000油相制備國產(chǎn)白油體積(ml)5640司本-80體積(ml)360硬脂酸鋁質(zhì)量(g)120油相總體積(ml)6000乳化水相體積(ml)3000油相體積(ml)6000硫柳汞質(zhì)量(g)0.9乳化速度(r/min)3000乳化時間(min)30疫苗總體積(ml)9000分裝規(guī)格(ml/瓶)10分裝總量(瓶)900實施例2疫苗成品4企驗(1)性狀外觀呈乳白色乳液。將疫苗滴于冷水中，呈油滴狀不16擴(kuò)散。流出0.4ml時間為4.9秒。3000r/min離心15min,不分層。(2)無菌檢驗按《中華人民共和國獸藥典》方法進(jìn)行，無菌生長。(3)安全檢驗取體重20kg左右健康仔豬4頭，每頭頸部肌肉注射4ml，連續(xù)測量體溫觀察14日，0/4出現(xiàn)局部、全身反應(yīng)或其它不良反應(yīng)。(4)效力檢驗取lml成品疫苗，于-20。C反復(fù)凍融3次，以3000r/min離心15分鐘，取管底析出的水相測定K88、K99、987P三種纖毛的抗原單位。結(jié)果K88:327個抗原單位/ml、K99:167個抗原單位/ml、987P:167個抗原單位/ml。(5)汞類防腐劑含量測定按《中華人民共和國獸藥典》方法進(jìn)行，辟b柳汞含量為0.009%。權(quán)利要求1.一種預(yù)防仔豬黃痢的K88、K99、987P纖毛亞單位疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于包括一下幾個步驟1)按發(fā)酵罐容積70％(V/V)加入改良Minca液體培養(yǎng)基，同時按培養(yǎng)基0.1％(V/V)加入消泡劑，通入高溫蒸汽滅菌30min，待培養(yǎng)基溫度降至35～37℃，按3％(V/V)向發(fā)酵罐中加入種子培養(yǎng)物，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度至37℃，調(diào)節(jié)融氧濃度至35％，培養(yǎng)5～7h分別制備含K88纖毛抗原的大腸埃希氏菌C83549菌株的菌液、含K99纖毛抗原的大腸埃希氏菌C83644菌株的菌液和含987P纖毛抗原的大腸埃希氏菌C83710菌株的菌液；2)各菌株發(fā)酵培養(yǎng)菌液經(jīng)管式離心機(jī)10000r/min離心30min，收獲的菌泥按0.1g/ml比例重新懸浮于生理鹽水中。采用剪切機(jī)對在58～65℃對含不同纖毛抗原的大腸埃希氏菌的菌懸液按5000～6000r/min的剪切強(qiáng)度剪切20～25min分別進(jìn)行各纖毛抗原的提取；3)按每1ml成品苗中，K88纖毛抗原含量≥100個抗原單位、K99纖毛抗原含量≥50個抗原單位、987P纖毛抗原含量≥50個抗原單位，配制混合纖毛液；4)按常規(guī)方法制備成油乳劑疫苗。2.如權(quán)利要求1所述一種預(yù)防仔豬黃痢的K88、K99、987P纖毛亞單位疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于含K88纖毛抗原的大腸埃希氏菌的菌懸液按溫度58~60°C、剪切強(qiáng)度5000~5500r/min、剪切時間20~25min進(jìn)行提取。3.如權(quán)利要求1所述一種預(yù)防仔豬黃痢的K88、K99、987P纖毛亞單位疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于含987P纖毛抗原的大腸埃希氏菌的菌懸液按溫度58~60。C、剪切強(qiáng)度5000~5500r/min、剪切時間20~25min進(jìn)行提取。4.如權(quán)利要求1所述一種預(yù)防仔豬黃痢的K88、K99、987P纖毛亞單位疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于含K99纖毛抗原的大腸埃希氏菌的菌懸液按溫度60~65°C、剪切強(qiáng)度5500~6000r/min、剪切時間20~25min進(jìn)行提取。全文摘要本發(fā)明涉及一種是用于預(yù)防仔豬黃痢的大腸埃希氏菌K88、K99、987P纖毛亞單位油乳劑疫苗的生產(chǎn)方法，本發(fā)明是用分別生長K88、K99、987P纖毛抗原的大腸埃希氏菌，接種于適宜培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取生長于菌體表面的纖毛抗原，與油佐劑混合乳化制成。用于預(yù)防由大腸埃希氏菌引起的新生仔豬腹瀉病(即仔豬黃痢)。本發(fā)明采用新型設(shè)備和新的工藝參數(shù)，實現(xiàn)了三種纖毛抗原的高效、快速提取，免疫效力比普通鋁膠佐劑疫苗高3～5倍。文檔編號A61K39/108GK101450206SQ20091000073公開日2009年6月10日申請日期2009年1月9日優(yōu)先權(quán)日2009年1月9日發(fā)明者健孫,李明義,杜元釗,瀟胡,范根成,郭玉廣申請人:青島易邦生物工程有限公司