專利名稱：大腸埃希氏菌OmpT抗體間接ELISA檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種大腸埃希氏菌OmpT抗體間接ELISA檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
大腸埃希氏菌(E. coli)屬是腸桿菌科12個(gè)菌屬中最重要成員，廣泛存在于自然界并能引起人和動(dòng)物共同感染的重要人畜共患病病原。依其致病機(jī)制可分為三類共生型、腸內(nèi)致病型和腸外致病型。過(guò)去人們對(duì)腸內(nèi)致病型E. coli研究較多，近年來(lái)腸外致病型E. coli備受關(guān)注。但E. coli菌體表面結(jié)構(gòu)復(fù)雜，血清型種類繁多，不同地區(qū)流行的E. coli血清型也各不相同，且與腸桿菌科其他11個(gè)屬細(xì)菌存在交叉反應(yīng)，為E. coli·感染的血清學(xué)診斷和檢測(cè)帶來(lái)不少困難。目前，E. coli血清學(xué)檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫熒光抗體試驗(yàn)(IFAT)和血清凝集試驗(yàn)(SAT)等。但這些血清學(xué)檢測(cè)方法都存在著特異性等不足之處，且檢測(cè)基本都是針對(duì)某一個(gè)血清型，因檢測(cè)范圍狹窄而使用受限。所以，尚缺乏通過(guò)單一抗原對(duì)所有血清型E. coli感染進(jìn)行血清學(xué)診斷和檢測(cè)的敏感、特異、快速、簡(jiǎn)便方法。OmpT是E. coli的特異性蛋白，由297個(gè)氨基酸構(gòu)成，存在于所有E. coli中，具有高度保守性和屬特異性。晶體結(jié)構(gòu)顯示，OmpT由10個(gè)β折疊構(gòu)成、中心切面為13Χ16Α。的橢圓型花籃結(jié)構(gòu)，蛋白活性位點(diǎn)位于細(xì)胞外。OmpT蛋白是菌血癥的主要蛋白抗原，其既能誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生，亦能誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答。鑒于OmpT蛋白具有這些重要的功能及良好的抗原性，本發(fā)明選取ompT基因，采用重組技術(shù)對(duì)其進(jìn)行基因克隆和原核表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行親和層析獲得純化的OmpT重組蛋白。經(jīng)過(guò)重組表達(dá)的OmpT蛋白既保留了其良好的抗原性，又提高了 OmpT蛋白的產(chǎn)量。該抗原不僅具有高度的屬特異性，且具有高純度和高穩(wěn)定性，提取純化后適宜作為抗原包被酶標(biāo)板建立間接ELISA檢測(cè)方法。目前，尚無(wú)一種使用OmpT重組蛋白檢測(cè)大腸埃希氏菌的ELISA檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種大腸埃希氏菌OmpT抗體間接ELISA檢測(cè)方法，解決目前對(duì)大腸埃希氏菌的檢測(cè)范圍狹窄，尚缺乏通過(guò)單一抗原對(duì)所有血清型E. coli感染進(jìn)行血清學(xué)診斷和檢測(cè)的敏感、特異、快速、簡(jiǎn)便方法。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一、一種大腸埃希氏菌OmpT抗體間接ELISA檢測(cè)方法，所述的檢測(cè)抗原為OmpT重
組蛋白。OmpT重組蛋白是通過(guò)以下方法制備而成(I)提取大腸埃希氏菌的DNA ；(2)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已公布序列AE014075設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出ompT基因，引物序列如下
OmpT-Tl :5，-CG |GGATCCj ATGCGGGCGAAACTTCT-3，(SEQ ID No. I)ompT~T2 :5’ -GGC lGTCG^Arl TTAAAAGGTGTACTTAAGACCAGC-3 (SEQ ID No. 2)(3)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物回收和純化；(4)PCR產(chǎn)物與T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)酶切鑒定，篩選陽(yáng)性克隆，序列測(cè)定；(5) BamH I、Sal I雙酶切陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒以及pET_32a，構(gòu)建pET-32a-ompT表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后挑取陽(yáng)性克隆，雙酶切鑒定；
(6)將陽(yáng)性克隆的培養(yǎng)液用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)OmpT重組蛋白。所述的PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性45s，60. 5°C退火45s，72°C延伸90s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。二、一種大腸埃希氏菌OmpT抗體間接ELISA檢測(cè)方法,該方法包括以下步驟(I)待檢血清按照1:640稀釋后，與酶標(biāo)板上的OmpT重組蛋白37°C孵育I. 5h，洗板三次；(2)加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)的兔抗牛IgG與待檢血清37°C孵育I. 5h ；(3)加入TMB底物進(jìn)行顯色I(xiàn)Omin ；(4)終止反應(yīng)后檢測(cè)OD450, OD450值彡O. 335為陽(yáng)性，OD450值< O. 335為陰性。該方法在檢測(cè)大腸埃希氏菌中的應(yīng)用。具體方法如下以提取的大腸埃希氏菌DNA作為PCR反應(yīng)模板擴(kuò)增出ompT基因，將其克隆進(jìn)表達(dá)pET-32a質(zhì)粒中，再轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌E. coli rosetta(DE3)中，將獲得的含有陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒的重組菌，按常規(guī)方法誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)蛋白經(jīng)純化、定量后包被酶標(biāo)板，建立檢測(cè)大腸埃希氏菌OmpT抗體的間接ELISA方法。I、大腸埃希氏菌OmpT蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建按常規(guī)方法提取大腸埃希氏菌DNA作為PCR反應(yīng)的模版擴(kuò)增出ompT基因片段，經(jīng)克隆、測(cè)序驗(yàn)證，將其克隆pET-32a表達(dá)質(zhì)粒中，再轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E. coli rosetta(DE3)中，雙酶切、PCR鑒定及測(cè)序，結(jié)果均證明所得為陽(yáng)性pET-32a-ompT質(zhì)粒，重組菌命名為大腸埃希氏菌pET-ompT菌株。2、OmpT蛋白表達(dá)、鑒定及純化、定量將經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的菌體12000r/min離心lOmin，將沉淀以10倍濃縮比例重懸于PBS中，超聲破碎裂解菌體，離心取上清結(jié)合NI-NTA柱，用咪唑洗脫法純化重組蛋白，取樣經(jīng)四亞群大腸埃希氏菌免疫血清和對(duì)照菌免疫血清Western blot鑒定及免疫原性、普遍性和特異性驗(yàn)證。并根據(jù)Bradford法確定蛋白濃度。3、酶標(biāo)反應(yīng)板的制備包被將OmpT重組蛋白作為抗原，用0. 05M pH7. 6 Tris鹽酸緩沖液稀釋后包被96孔板，包被濃度I μ g/孔，置濕盒中4°C 12-14小時(shí)，PBST洗板3次，每次3min，然后拍干；得到抗原OmpT包被酶標(biāo)反應(yīng)板。封閉用含1°/觀4加滿孔(約20(^1/孔)，371孵育，封閉lh，洗板三次，拍干密封；即得到OmpT包被酶標(biāo)板。采用上述技術(shù)方案的積極效果本發(fā)明用大腸埃希氏菌的標(biāo)志性基因OmpT制備的重組蛋白作為ELISA的檢測(cè)抗原，與以往大腸埃希氏菌抗原相比，該重組抗原可規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，且特異性強(qiáng)，適于大腸埃希氏菌屬所有血清型細(xì)菌感染后抗體檢測(cè)。


圖I是重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定結(jié)果。I DNA Marker, 2 PCR 鑒定，3 :雙酶切鑒定。圖2是OmpT重組蛋白表達(dá)圖。M :蛋白Marker，I :空載體誘導(dǎo)前，2 :工程菌誘導(dǎo)2小時(shí)，3 :工程菌誘導(dǎo)3小時(shí)，4 工程菌誘導(dǎo)4小時(shí)，5 :工程菌誘導(dǎo)5小時(shí)，6 :工程菌誘導(dǎo)前，7 :空載體誘導(dǎo)5小時(shí)，8宿主菌誘導(dǎo)前。
圖3是四個(gè)種系發(fā)育群代表菌免疫血清與OmpT重組蛋白免疫印跡圖譜。A :0mpT重組蛋白與E. coli C83919血清免疫印跡，BI :0mpT重組蛋白E. coli2002-1血清免疫印跡，B2 :0mpT重組蛋白與E. coli J96血清免疫印跡，D :0mpT重組蛋白與E.coli 0157H:7EDL933 血清。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中生物材料的來(lái)源說(shuō)明I、菌種大腸埃希氏菌C83919 :購(gòu)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心；大腸埃希氏菌2002-1 :奶牛乳房炎腸桿菌OmpA的免疫原性分析及對(duì)小鼠感染模型的免疫保護(hù)效果評(píng)估，呼銳，樊自堯，佟春玉，遲佳琦，李閏婷，丁兆鳳，陳龍欣，陳亮，于立權(quán)，馬金柱，宋佰芬，朱戰(zhàn)波，崔玉東，中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會(huì)暨中國(guó)免疫學(xué)會(huì)獸醫(yī)免疫分會(huì)第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集，2010年，363-366，并由申請(qǐng)人保證從本申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放該生物材料；大腸埃希氏菌J96 :尿路致病性大腸桿菌臨床株I型菌毛FimH基因檢測(cè)及分析，尹曉琳，王秀榮，胡潔，馮惠東，魏林，河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003年第24卷第03期，136-138頁(yè)，該菌種由河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院魏林老師贈(zèng)送給本申請(qǐng)人，并由申請(qǐng)人保證從本申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放該生物材料；另外，該生物材料還公開(kāi)在奶牛乳房炎腸桿菌OmpA的免疫原性分析及對(duì)小鼠感染模型的免疫保護(hù)效果評(píng)估，呼銳，樊自堯，佟春玉，遲佳琦，李閏婷，丁兆鳳，陳龍欣，陳亮，于立權(quán)，馬金柱，宋佰芬，朱戰(zhàn)波，崔玉東，中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會(huì)暨中國(guó)免疫學(xué)會(huì)獸醫(yī)免疫分會(huì)第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集中，2010年，363-366，并由申請(qǐng)人保證從本申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放該生物材料；大腸埃希氏菌0157H 7EDL933 :大腸桿菌0157噬菌體的分離鑒定及其初步應(yīng)用，杜崇濤，碩士論文，授予單位吉林大學(xué)，導(dǎo)師馮書(shū)章，發(fā)表時(shí)間2008年；該菌種由吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院杜崇濤老師贈(zèng)送給本申請(qǐng)人，并由申請(qǐng)人保證從本申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放該生物材料；弗氏志賀菌ATCC 12022，肺炎克雷伯菌ATCC 35281，普通變形桿菌ATCC 49027，綠膿桿菌ATCC27853，金黃色葡萄球菌ATCC 25923均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所；牛巴氏桿菌CVCC 44702，雞沙門氏菌CVCC 520，奇異變形桿菌CVCC 1969，無(wú)乳鏈球菌CAU0306，均購(gòu)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。2、引物ompT基因特異性引物是根據(jù)基因序列自行設(shè)計(jì)，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。3、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)的兔抗牛IgG購(gòu)自sigma公司。4、作為感受態(tài)細(xì)胞的DH5a和E.coli rosetta (DE3)購(gòu)自博美科生物技術(shù)有限公司。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制實(shí)施例I本實(shí)施例用于說(shuō)明ompT基因的獲得以及表達(dá)載體的構(gòu)建，具體步驟如下I、按照大腸埃希氏菌ompT基因序列(GenBank Accession No. AE014075),利用01igo6. O軟件分析，自行設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物兩端分別加限制性酶切位點(diǎn)BamH I和Sal I(方框內(nèi))及保護(hù)性堿基。經(jīng)計(jì)算機(jī)BLAST軟件分析，具有較好的特異性。引物的核苷酸序列為ompT-Tl :5，-CG |GGATCC[ ATGCGGGCGAAACTTCT-3j (SEQ ID No. I)ompT~T2 :5’ -GGC lGTCG-\^ TTAAAAGGTGTACTTAAGACCAGC-3 (SEQ ID No. 2)2、以提取的E. coli 2002-1株菌體DNA作為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性45s，60. 5°C退火45s，72°C延伸90s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0擴(kuò)增出的ompT基因片段采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收目的片段。3、擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳后，紫外燈下切割目的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒(Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System)回收和純化DNA,具體步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。4、將所得片段與T載體連接，將連接產(chǎn)物10 μ L加入到新制備的感受態(tài)細(xì)胞中，輕旋混勻。冰浴30min ;42°C熱休克90s，立即冰浴2min。然后加入到ImL 37°C預(yù)熱的液體LB培養(yǎng)基中，37°C 100r/min振搖45min ;5，000r/min離心2min,棄去800 μ L上清，余下的200 μ L培養(yǎng)液涂布于固體LB平板(含100μ g/mLAmp+)，37°C培養(yǎng)12h。5、挑取轉(zhuǎn)化板上的單一菌落,無(wú)菌接至3mL LB/Amp+ (Amp+終濃度為100 μ g/mL)液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)12h后，采用試劑盒提取小量質(zhì)粒。6、取克隆重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和BamH I、Sal I雙酶切鑒定。PCR反應(yīng)體系及條件同上。混勻后37°C水浴2-3h，取出后全部上樣，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。7、將pET_32a載體提取質(zhì)粒，用BamH I和Sal I進(jìn)行雙酶切后，用DNA純化/回收試劑盒回收。同時(shí)將質(zhì)粒pMD18-T-0mpT用BamH I和Sal I進(jìn)行雙酶切，使用DNA純化/回收試劑盒回收ompT基因片段。將目的片段與載體pET-32a連接。16°C連接過(guò)夜后，熱轉(zhuǎn)化至E. coli rosetta感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)Amp抗性、PCR和限制性內(nèi)切酶雙酶切進(jìn)行篩選和鑒定后，(如圖1)，目的條帶為lOOObp，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。實(shí)施例2本實(shí)施例說(shuō)明重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)以及純化，具體步驟如下I、對(duì)于序列正確的菌落，挑取單個(gè)菌落接種于含Amp+的液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過(guò)夜。取過(guò)夜培養(yǎng)物按2%的量接種于含Amp+的液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至A600值O. 5 I. O，加IPTG至終濃度為ImM，繼續(xù)在37°C振蕩培養(yǎng)，并在培養(yǎng)的不同時(shí)刻(2、3、4、5、6h)各從培養(yǎng)物中取出ImL菌液轉(zhuǎn)移到離心管中，10，000r/min離心5min，收集菌體沉淀，加入90 μ L 2 X上樣緩沖液和10 μ L lmol/L DTT懸浮混勻，煮沸5min, 10，000r/min離心5min后立即使用，或-20 V儲(chǔ)存，用前100 V加熱5min。2、SDS-PAGE凝膠電泳組裝好電泳設(shè)備，拔出樣品梳，每孔加入10 μ L的樣品，樣品在濃縮膠中采用8v/cm的電壓進(jìn)行電泳，在分離膠中采用15V/cm的電壓進(jìn)行電泳。待溴酚藍(lán)至分離膠底部約Icm時(shí)，停止電泳。取出凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液在搖床上染色30min左右，然后脫色至背景清晰，用清水沖洗、照相。SDS-PAGE表明，在IPTG的誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的大腸桿菌rosetta(DE3)可高效表達(dá)融合蛋白；時(shí)間梯度結(jié)果表明，4h_5h的誘導(dǎo)量最高(如圖2)。3、按最佳誘導(dǎo)時(shí)間培養(yǎng)重組菌,10, OOOg離心5min,沉淀重懸后超聲波破碎， 4000r/min再離心IOmin,分別取10 μ L上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳(8%分離膠,5%濃縮膠)，以確定重組蛋白是否為可溶性表達(dá)，并用NI-NTA柱純化。實(shí)施例3本實(shí)施例說(shuō)明OmpT蛋白的抗原性以及特異性驗(yàn)證。I、按“半干法”進(jìn)行將SDS-PAGE后的凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到NC膜上，用全菌體免疫血清和蛋白免疫血清分別作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗進(jìn)行western-blotting檢測(cè)表達(dá)的蛋白質(zhì)。結(jié)果四個(gè)E. coli種系發(fā)育群小鼠免疫血清作為一抗的western-blotting均出現(xiàn)清晰可見(jiàn)的一條帶(圖3),表明表達(dá)的OmpT蛋白具有良好的抗原性和保守性，純度高。2、用微量加樣器向96孔聚苯乙烯微孔反應(yīng)板(酶標(biāo)板)，以每孔25 μ L加入稀釋液(第一孔除外)。第一孔加入50 μ LOmpT純化蛋白免疫小鼠血清，從第一孔血清中取出25 μ L加入到第二孔中，用加樣器以吹打方式混合5次，混勻后用微量加樣器吸取25 μ L加入第三孔中，同樣采用吹打方式混勻，依次到第12孔，最后在第12孔取出25yL棄掉。每孔分別加入已制備的菌體抗原 25μ L :Α 群:Ε· coli C83919 ；B1 群E. coli 2002-1 ;B2 群E. coliJ96山群E. coli 0157H:7EDL933，驗(yàn)證各種系發(fā)育群E. coli抗原的保守性，結(jié)果E. coli四個(gè)種系發(fā)育群均與OmpT蛋白免疫血清發(fā)生凝集反應(yīng)；同時(shí)，與9株非E. coli對(duì)照菌株做凝集實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證其特異性，結(jié)果9株非E. coli對(duì)照菌株均未與OmpT蛋白免疫血清發(fā)生凝集反應(yīng)。實(shí)施例4本實(shí)施例用于說(shuō)明大腸埃希氏菌OmpT抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立(以牛血清檢測(cè)為例)I、ELISA檢測(cè)的試劑(I)包被液0. 05mol/L Tris-HCl 緩沖液，4°C保存。(2)樣本稀釋液含1%牛血清白蛋白(BSA)磷酸鹽-吐溫緩沖液。(3)封閉液含1%牛血清白蛋白(BSA)磷酸鹽-吐溫緩沖液。(4)酶標(biāo)二抗兔抗牛 IgG/HRP。(5)底物緩沖液(磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(pH5.0)) 0. 2mol Na2HPO4 · 12H2025. 7mL, 0. Imol 朽1 樣酸 24. 3mL,去離子水 5OmL0
(6) TMB底物顯色液0. Olg TMB干粉溶于ImL DMSO中，取底物緩沖液9. 9mL加30 μ L H2O2,再加入 DMSO 溶解的 ΤΜΒ100 μ L。(7)終止液(2Μ H2SO4):蒸餾水 178. 3mL，逐點(diǎn)加入濃 2M 的 H2SO4 21. 7mL。(8) O. 05%PBST :在上述 PBS 中加入 O. 5mL 的 Tween-20。2、反應(yīng)板均一性測(cè)定從購(gòu)買的酶標(biāo)板中隨機(jī)抽取8塊，酶標(biāo)板用3000倍稀釋后的酶標(biāo)二抗以100 μ L/孔包被，4°C包被過(guò)夜。PBST洗3次，每次間隔5min，洗滌后拍干，以200 μ L/孔加入5%脫脂乳封閉液，370C Ih,按上述方法再次洗滌。以100 μ L/孔加入TMB底物顯色液，37°C避光反應(yīng)lOmin，在酶標(biāo)儀上測(cè)其0D450數(shù)值，計(jì)算各個(gè)孔間的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，分析不同酶標(biāo)板間的均勻度。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，各孔在0D450時(shí)平均值為I. 347，變異系數(shù)為4. 6%，小于5%， 表明這種酶標(biāo)板均一性良好，能夠滿足ELISA檢測(cè)試驗(yàn)的要求。3、最佳包被緩沖液的選擇OmpT 蛋白抗原分別用碳酸鹽緩沖液(pH9.6)、PBS (pH 7. 2),Tris-HCl (pH 7.6)、檸檬酸鹽緩沖液(I. OM pH6. O)、水(pH7. O)進(jìn)行包被，每種包被液體做4個(gè)重復(fù)，4°C過(guò)夜，血清根據(jù)最佳濃度稀釋，以下按ELISA操作步驟進(jìn)行，測(cè)其0D450值并計(jì)算P/N值，用Tris-HCKpH 7. 6)作為包被緩沖液時(shí)的P/N值都一直最大。所以，選擇Tris_HCl(pH 7.6)作為最佳包被緩沖液。4、OmpT蛋白抗原最佳包被濃度及血清最佳稀釋倍數(shù)的確定陰陽(yáng)性血清分別做40-1280倍稀釋，與梯度稀釋的包被抗原做交叉反應(yīng)試驗(yàn)，每個(gè)稀釋度做4個(gè)重復(fù)。結(jié)果當(dāng)包被抗原濃度降低、陰陽(yáng)性血清濃度減小時(shí)，0D450值不斷變小。當(dāng)抗原的稀釋濃度為lyg/ L陰陽(yáng)性血清的稀釋倍數(shù)為1:640，此時(shí)P/N值最高。所以，確定最佳的抗原包被濃度為Iyg/孔，血清的稀釋倍數(shù)為1:640。5、酶標(biāo)二抗工作濃度的確定將OmpT蛋白和陰陽(yáng)性血清分別作最佳稀釋后進(jìn)行ELISA操作，酶標(biāo)二抗根據(jù)說(shuō)明書(shū)分別作I :3000,1 :6000,1 :12000、I :24000梯度稀釋進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，測(cè)其0D450時(shí)的值并計(jì)算P/N值。結(jié)果當(dāng)抗原和血清最佳工作濃度確定后，酶標(biāo)二抗以1:6000稀釋時(shí)的P/N值最大，確定酶標(biāo)二抗最佳稀釋濃度為1:6000。6、封閉液的選擇將OmpT蛋白抗原、一抗血清和酶標(biāo)二抗分別按照已確定的最佳濃度進(jìn)行稀釋。分另Ij用5%脫脂奶粉、1%明膠、1%牛血清白蛋白和10%胎牛血清做封閉液，進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)。測(cè)0D450時(shí)數(shù)值并計(jì)算P/N值。結(jié)果OmpT-ELISA用1%BSA_PBST封閉液效果最佳。7、封閉時(shí)間的確定采用已確定的最佳封閉液在37°C封閉30min、lh、l. 5h、2h，其它反應(yīng)條件按以上確定進(jìn)行，在0D450時(shí)測(cè)量其數(shù)值并做P/N計(jì)算，確定最佳的封閉時(shí)間。結(jié)果OmpT -ELISA37°C封閉Ih效果最好。8、血清稀釋液的選擇比較5%脫脂奶粉、l%BSA、PBS、Tris鹽酸鹽緩沖液作為血清稀釋液時(shí)的P/N值，確定最佳的血清稀釋液。結(jié)果1%BSA作為血清稀釋液的效果明顯好于Tris-HCl和PBS。9、抗原和血清反應(yīng)時(shí)間的確定
抗原抗體反應(yīng)會(huì)隨著時(shí)間的增加，反應(yīng)量也增加,但達(dá)到一定的時(shí)間后，反應(yīng)即達(dá)到平衡，OmpT蛋白抗原按上述確定的最佳反應(yīng)條件，陰性與陽(yáng)性血清各做8個(gè)重復(fù)，37°C分另Ij作用O. 5h、lh、l. 5h、2h四個(gè)反應(yīng)時(shí)間的驗(yàn)證。測(cè)其0D450時(shí)數(shù)值，確定P/N值最大的反應(yīng)時(shí)間。結(jié)果OmpT蛋白抗原在37°C下與血清反應(yīng)I. 5h時(shí)P/N值最大，陰性平均值也較小。10、酶標(biāo)二抗的作用時(shí)間的確定OmpT蛋白抗原按最佳包被濃度包被酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜，將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、陰性血清以最佳稀釋倍數(shù)稀釋，酶標(biāo)二抗作I :6000稀釋，酶標(biāo)二抗的作用時(shí)間設(shè)O. 5h、lh、l. 5h、2h四個(gè)反應(yīng)組，每組陰性和陽(yáng)性對(duì)照各做8個(gè)重復(fù)，按照ELISA操作程序進(jìn)行，測(cè)其在0D450數(shù)值，比較P/N值確定反應(yīng)時(shí)間。結(jié)果OmpT酶標(biāo)二抗作用1.5h時(shí)，P/N值最大，且陽(yáng)性值都大于
I.0，陰性值都小于O. 2，因此OmpT-ELISA酶標(biāo)二抗的作用時(shí)間確定為I. 5h。11、底物顯示時(shí)間的確定
按照已確定的ELISA反應(yīng)程序依次包被、封閉、加入陰陽(yáng)性血清，各做8個(gè)重復(fù)，再和酶標(biāo)二抗反應(yīng)I. 5h之后加入TMB底物顯色，370C孵育反應(yīng)設(shè)5min、IOmin, 15min、20min四個(gè)顯色時(shí)間，測(cè)定在0D450時(shí)數(shù)值。選取陽(yáng)性平均值接近I. O,陰性O(shè)D平均值比較小，且P/N值最大的一組作為最佳的底物顯色時(shí)間。結(jié)果在37°C條件，與底物作用IOmin的陽(yáng)性0D450值可以達(dá)到1.0以上，而陰性0D450值在O. 2以下，P/N值最大，底物顯色時(shí)間確定為IOmin012、間接ELISA方法陽(yáng)性臨界值的確定用OmpT蛋白抗原包被酶標(biāo)板，按照前面已建立的間接ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)170份血清凝集試驗(yàn)判定為陰性的牛血清。每份血清做三次重復(fù),記錄樣本的0D450值并計(jì)算平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差⑶。當(dāng)樣本0D450值彡X+3S時(shí)，判定此血清為陽(yáng)性血清；相反，判定為陰性血清。結(jié)果間接ELISA方法陰陽(yáng)血清的判定值為O. 335。即血清樣品0D450值彡O. 335就可以判斷為陽(yáng)性，< O. 335為陰性。13、特異性和敏感性試驗(yàn)用已建立間接ELISA方法，對(duì)170份E. coli凝集實(shí)驗(yàn)為陰性和170份全菌疫苗免疫凝集實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性的牛血清稀釋640倍后進(jìn)行檢測(cè)。陰性血清的檢出率體現(xiàn)所建立間接ELISA方法的特異性，陽(yáng)性血清的檢出率體現(xiàn)所建立的間接ELISA方法的敏感性。即間接ELISA方法特異性=(ELISA陰性血清數(shù)量)/ (全菌凝集實(shí)驗(yàn)陰性血清數(shù)量)X 100% ；ELISA方法敏感性=(ELISA陽(yáng)性血清數(shù)量)/ (全菌疫苗免疫陽(yáng)性血清數(shù)量)X 100%。結(jié)果間接ELISA方法的特異性為96. 5%，敏感性為100%。14、檢測(cè)靈敏度試驗(yàn)將陽(yáng)性和陰性血清平行倍比稀釋，按建立的間接ELISA方法檢測(cè)血清中抗體的含量，將P/N ^ 2. I的最大血清稀釋度作為ELISA檢測(cè)方法的靈敏度。結(jié)果通過(guò)對(duì)血清的倍比稀釋后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血清稀釋度達(dá)到1:6400時(shí)，P/N值仍大于2. 1，說(shuō)明所建立的間接ELISA方法有很高的靈敏度。15、重復(fù)性試驗(yàn)(I)批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)用同一次純化的OmpT重組蛋白包被酶標(biāo)板，取8份不同的血清，在一起按已確立的間接ELISA檢測(cè)程序測(cè)定，每份樣品做6個(gè)平行孔，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果檢測(cè)樣品的變異系數(shù)(CV)在2%-9%之間，都小于10%。此方法有很好的重復(fù)性。(2)批間重復(fù)性試驗(yàn)用同一次純化的OmpT重組蛋白抗原包被4塊酶標(biāo)板，取8份不同待測(cè)樣本，在4個(gè)時(shí)間按照已確立的間接ELISA檢測(cè)程序測(cè)定樣本，每份血清樣本設(shè)6個(gè)平行孔，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；用4次不同批次純化的OmpT重組蛋白抗原包被酶標(biāo)板，取8份不同的血清樣本在同樣條件下進(jìn)行檢測(cè)，每份血清樣本設(shè)6個(gè)平行孔，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果檢測(cè)樣品的變異系數(shù)(CV)在2%-9%之間，都小于10%。此方法有很好的重復(fù)性。實(shí)施例5本實(shí)施例用于說(shuō)明大腸埃希氏菌OmpT抗體間接ELISA檢測(cè)板的制備及檢測(cè)流程，具體步驟如下
(I)將已純化重組OmpT蛋白用(λ 05M Tris-HCKpH 7. 6)緩沖液稀釋10 μ g/mL后，用微量加樣器吸取稀釋好的樣品加入孔內(nèi)，100 μ L/孔，4°C冰箱12 14h，PBST洗板3次，每次3min，然后拍干；洗滌冰箱過(guò)夜后取出ELISA板，甩干內(nèi)容物，加入洗液PBST，200 μ L/孔，震蕩5min，甩干，洗滌3次，最后一次甩干拍打干凈；(2)加入 1%BSA-PBST, 100 μ L/ 孔，37°C lh，洗板 3 次后密封。(3)待檢血清稀釋加入I :640稀釋的待檢血清到包被好的酶標(biāo)反應(yīng)板，100 μ L/孔，37°C孵育，I. 5h，洗板三次；(4)加酶標(biāo)物被檢測(cè)物種的特異IgG抗體或采用酶標(biāo)記的SPA，100yL/孔，37。。I. 5h，洗板三次；(5)顯色將配置好的TMB底物溶液100 μ L/孔加入，37°C避光IOmin ；(6)終止反應(yīng)加入終止液2mol/L的H2S0450 μ L/孔，室溫下5min ；(7)確定血清陰陽(yáng)性臨界值，按照前面已建立的間接ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)陰性的血清。每份血清做三次重復(fù)，記錄樣本的0D450值并計(jì)算平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(S)。當(dāng)樣本0D450值彡x+3S時(shí)，判定此血清為陽(yáng)性血清；相反,判定為陰性血清。(8)結(jié)果判斷利用酶標(biāo)儀，空白孔調(diào)零，讀取450nm波長(zhǎng)處吸光度，即0D450值。大于臨界值的為陽(yáng)性，小于臨界值的為陰性。試驗(yàn)例I本試驗(yàn)例用于驗(yàn)證本發(fā)明的大腸埃希氏菌OmpT抗體間接ELISA檢測(cè)板的準(zhǔn)確性，具體步驟如下取10份已經(jīng)感染大腸埃希氏菌的陽(yáng)性血清，以及被9株對(duì)照菌(弗氏志賀菌ATCC12022、肺炎克雷伯菌ATCC 35281、普通變形桿菌ATCC 49027、綠膿桿菌ATCC27853、牛巴氏桿菌CVCC 44702、雞沙門氏菌CVCC 520、奇異變形桿菌CVCC 1969、無(wú)乳鏈球菌CAU0306、金黃色葡萄球菌ATCC 25923)感染后的抗體血清，應(yīng)用本發(fā)明的ELISA檢測(cè)板進(jìn)行檢測(cè)，判定方法同實(shí)施例5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的ELISA檢測(cè)板準(zhǔn)確率可達(dá)100%，可以作為檢測(cè)大腸埃希氏菌的一種簡(jiǎn)單有效的方法。
權(quán)利要求
1.一種大腸埃希氏菌OmpT抗體間接ELISA檢測(cè)方法，其特征在于所述的ELISA中酶標(biāo)板上的檢測(cè)抗原為OmpT重組蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的大腸埃希氏菌OmpT抗體間接ELISA檢測(cè)方法,其特征在于所述的OmpT重組蛋白是通過(guò)以下方法制備而成 (1)提取大腸埃希氏菌的DNA； (2)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已公布序列AE014075設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出ompT基因，引物序列如下ompT-Tl :5’ -CG i|GGATCd ATGCGGGCGAAACTTCT-3，(SEQ ID No. I)ompT-T2 :5’ -GGC |GTCGACl TTAAAAGGTGTACTTAAGACCAGC-3j (SEQ ID No. 2) (3)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物回收和純化； (4)PCR產(chǎn)物與T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)酶切鑒定，篩選陽(yáng)性克隆，序列測(cè)定； (5)BamHI,Sal I雙酶切陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒以及pET_32a，構(gòu)建pET-32a-ompT表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后挑取陽(yáng)性克隆，雙酶切鑒定； (6)將陽(yáng)性克隆的培養(yǎng)液用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)OmpT重組蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大腸埃希氏菌OmpT抗體間接ELISA檢測(cè)方法,其特征在于所述的PCR擴(kuò)增條件為941預(yù)變性5111111，941變性458，60. 5°C退火45s，72°C延伸90s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。
4.一種大腸埃希氏菌OmpT抗體間接ELISA檢測(cè)方法,其特征在于該方法包括以下步驟 (1)待檢血清按照1:640稀釋后，與酶標(biāo)板上的OmpT重組蛋白37°C孵育I.5h，洗板三次； (2)加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)的兔抗牛IgG與待檢血清37°C孵育I.5h ； (3)加入TMB底物進(jìn)行顯色I(xiàn)Omin； (4)終止反應(yīng)后檢測(cè)OD450,OD450值彡0. 335為陽(yáng)性，OD450值< 0. 335為陰性。
5.權(quán)利要求I或4所述的方法在檢測(cè)大腸埃希氏菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種大腸埃希氏菌OmpT抗體間接ELISA檢測(cè)方法，所述的ELISA中酶標(biāo)板上的檢測(cè)抗原為OmpT重組蛋白。檢測(cè)方法包括以下步驟待檢血清按照1:640稀釋后，與酶標(biāo)板上的OmpT重組蛋白37℃孵育1.5h，洗板三次；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)的兔抗牛lgG與待檢血清37℃孵育1.5h；加入TMB底物進(jìn)行顯色10min；終止反應(yīng)后檢測(cè)OD450，OD450值≥0.335為陽(yáng)性，OD450值＜0.335為陰性。本發(fā)明用大腸埃希氏菌的標(biāo)志性基因OmpT制備的重組蛋白作為ELISA的檢測(cè)抗原，該重組抗原可規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，且特異性強(qiáng)，適于大腸埃希氏菌屬所有血清型細(xì)菌感染后抗體檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102707054SQ201210199910
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者佟春玉, 崔玉東, 朱戰(zhàn)波, 馬金柱 申請(qǐng)人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)