專利名稱：具有心率降低特性的混合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)一種通過發(fā)酵制造得到的一種混合物，這種混合物是利用一種乳酸 菌(lactic acid bacterium)發(fā)酵得到一種食物材料，它包含動(dòng)物乳汁或植物蛋白質(zhì)，以得 到一種發(fā)酵的食物材料，它包含多肽(P^tides)或其它能降低心率的活性成份，以制造出 可降低哺乳動(dòng)物心率的產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
已有數(shù)篇報(bào)導(dǎo)明確的認(rèn)為，靜止心律的降低與增進(jìn)存活率之間有著非常強(qiáng)烈的相 關(guān)連性。在一般人群中，幾篇研究報(bào)告顯示較高的靜止心率與死亡率的增加有很強(qiáng)的正相 關(guān)性，報(bào)告中顯示男性死亡率的觀察中有2至3個(gè)峰值發(fā)生在靜止心率高達(dá)每分鐘88次的 地方，相對(duì)于群體中其靜止心率是低于每分鐘65次的其它男性人口，心率不只與心血管系 統(tǒng)所造成的死亡率有關(guān)，而且也與癌癥等其它原因所造成的死亡有關(guān)。Zaza等人曾于2001 年假設(shè)在降低心率與一般壽命的預(yù)期之間存在相關(guān)性。在現(xiàn)今發(fā)達(dá)國家中，最常見的心血管疾病為冠狀動(dòng)脈疾病(coronary artery disease, CAD)或是冠狀心臟病(coronary heart disease，CHD)，它們是心臟遭受到攻擊的 主要原因。CAD及CHD是指位在心臟表面的動(dòng)脈硬化，“動(dòng)脈硬化”是指動(dòng)脈變窄與僵硬而 阻礙到血液流動(dòng)的一種狀態(tài)。較低心率與較好的結(jié)果有關(guān)，特別是降低心律不齊的危險(xiǎn)性；較高心率可能反映 出較高的新陳代謝率和較低的迷走神經(jīng)活性，因而增加了缺血性的危險(xiǎn)率。此外，較高的心 率也可能使心室的功能惡化(Lombardi，F(xiàn) in Zaza et al.，2001)，因此并不奇怪有報(bào)道說， 較高心率是導(dǎo)致CAD或CHD的非常相關(guān)的重要因素。CAD或CHD通常以藥物治療方式來治 療，這些藥物治療是通過不同的機(jī)制來進(jìn)行，例如1. 0阻斷器，通過阻斷某種化學(xué)物質(zhì)與心臟上之0接收器之間的連結(jié)，來降低心 臟的負(fù)荷。2.硝酸鹽，直接作用于血管上，使血管松弛并允許更多的富含氧血到達(dá)心臟。3.鈣離子通道阻斷器，可增加流至心臟的血流量，并通過血管的壓縮與繃緊信號(hào) 通知來阻斷鈣離子而降低心臟負(fù)荷。4.抗血小板凝集(例如阿斯匹林)，可抑制血小板(存在于血液中的極小顆粒) 凝集血液形成凝塊，使血液凝塊與聚集的情況降低。在這種疾病的早期發(fā)展中，高心率的預(yù)防是用藥物來治療高心率的一種手段。大 量可產(chǎn)生生物活性成分的食物認(rèn)為是有益于生命健康或提升健康的。已知乳酸菌(LAB)可以使牛奶發(fā)酵而產(chǎn)生抗高血壓(anti-hypertensive)的 功效，因?yàn)榕Ｄ讨欣业鞍椎亩嚯脑谌樗峋淖饔孟逻M(jìn)行蛋白質(zhì)分解，這實(shí)施例的相關(guān)說 明是在 EP 821968 (Calpis Food Industry)、EP 1016709 (Calpis Food Industry)及 TO 0132836 (Valio Ltd.)等專利案中。Yamamoto等人于1996年發(fā)表的文章中表明使用瑞士乳桿菌 (Lactobacillushelveticus)禾口酉良胃—(Saccharomyces cerevisiae)以降低收縮壓與舒張壓，然而在其它文獻(xiàn)中觀察到的則無任何改變，包括脈搏速率。W00185984(Davisco International Foods，Inc.)也是有關(guān)具有抗高血壓功效 (血液減少功效)的多肽，這種多肽來自于乳漿蛋白的酶消化。測量心率與血壓的變化，可 以觀察到在平均動(dòng)脈血壓中有一個(gè)明顯的減少，而且除了 75毫克/公斤(mg/kg)的劑量可 以導(dǎo)致心率降低之外，其余發(fā)生在30至150毫克/公斤間的劑量與心率反應(yīng)并無任何有意 義的差異存在。Fuglsang，A.等人(2002)的文章描述，如同Yamamoto等人(1996)的結(jié)論文章， 發(fā)酵牛奶多肽具有抗高血壓的特性。在3569頁第2段第1行中，測試樣品的反應(yīng)表明與非 發(fā)酵牛奶(安慰劑)相比，發(fā)酵牛奶對(duì)心率的影響非常微小。上面所提到的Yamamoto等人(1996)的文章、Fuglsang，A.等人(2002)的文章和 W00185984文件中皆指出，雖然乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品具有降低血壓特性，但沒有理由相信它對(duì)于 降低心率也具有同樣之功效。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明提供一種有利于降低心率的產(chǎn)品。這解決方式是基于本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過乳酸菌(LAB)發(fā)酵的食物材料，最好是牛 奶，可以得到具有增加心率降低特性的活性成份。具體參見實(shí)施例1的表1。因此，本發(fā)明的第一方面是有關(guān)發(fā)酵制程所制得的混合物，這種混合物是利用種 乳酸菌發(fā)酵食物材料，包括動(dòng)物乳汁或植物蛋白質(zhì)，以得到一種發(fā)酵的食物材料，它是包含 多肽或其它具有心率降低特性的活性成份，以制造出可以降低哺乳動(dòng)物之心率的產(chǎn)品。第二方面，本發(fā)明提供一種發(fā)酵食物材料，它具有降低哺乳動(dòng)物的心率的特 性，并包含通過至少一種乳酸菌品種發(fā)酵所得的活性成份。特別是使用瑞士乳桿菌 (Lactobacillus helveticus)品種CHCC5951 (DSM 14998)發(fā)酵的食物材料是最佳實(shí)施例。認(rèn)為提取包含活的及死的菌種的食物是尤其有益于健康的，因此，本發(fā)明的第三 方面是提供一種發(fā)酵食物材料，它具有降低哺乳動(dòng)物的心率特性，并包含失活的或有活性 的瑞士乳桿菌菌種DSM 14998或其突變種。由劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例4)可知，若混合物為高濃度的降低心率合成物，可能得 到更大的效果，因此，本發(fā)明的第四方面是提供從發(fā)酵食物材料中分離出心率降低成份。更進(jìn)一方面，本發(fā)明是描述使用發(fā)酵食物材料或從中分離出心率降低活性成份 而制作成藥劑，用于治療或緩和冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)或冠狀心臟病(CHD)，例如心絞痛、 高血壓、動(dòng)脈硬化、中風(fēng)、心肌梗塞、大腦血管梗塞，以及血管成形術(shù)后再狹窄(restenosis following angioplasty)、心律不齊、心跳節(jié)律不齊、充血性心臟衰竭(Congestive Heart Failure, CHF)、主動(dòng)脈竇逆流、慢性腎衰竭、脂肪代謝障礙、脂蛋白代謝障礙等。定義在對(duì)本發(fā)明的細(xì)節(jié)進(jìn)行討論之前，以下針對(duì)本發(fā)明主要方面各定義具體詳細(xì)說 明?！敖档筒溉閯?dòng)物心率"定義為心率的降低與使用在此描述的混合物之前的心 率間的相關(guān)性。在進(jìn)行人體試驗(yàn)前，最好在動(dòng)物模式中驗(yàn)證其降低心率的特性。在一個(gè) 有用的動(dòng)物模式中是使用胃管灌食法(gavage)將發(fā)酵產(chǎn)品提供給自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats, SHR)，喂食后再使用遠(yuǎn)距測量法24小時(shí)的監(jiān)測SHR于 不同時(shí)間點(diǎn)的心率。安慰劑(Placebo)最好是與未發(fā)酵的食物材料有關(guān)，例如未發(fā)酵的牛 奶。更進(jìn)一步的說明請(qǐng)參見工作實(shí)施例1所示，但是也要對(duì)血壓正常的Wistar大鼠建立一 模式，如實(shí)施例6所述可用來評(píng)估心率的降低?！叭樗峋?是指一組革蘭氏陽性菌、過氧化氫酶陰性菌、無運(yùn)動(dòng)性者 (non-motile)、微嗜氧菌或厭氧桿菌，它們能使糖發(fā)酵而制造出酸，包括主要產(chǎn)生的乳酸，、 醋酸、甲酸和丙酸。下面通過具體實(shí)施例配合附圖詳加說明。發(fā)明詳述食物材料本發(fā)明的食物材料包含動(dòng)物乳汁蛋白質(zhì)或是植物蛋白質(zhì)。最好，食物材料包含有所列舉的動(dòng)物乳汁蛋白質(zhì)，例如全脂或脫脂動(dòng)物乳汁或乳 汁酪白質(zhì)等乳汁蛋白質(zhì)成份。食物材料包含所列舉的植物蛋白質(zhì)，最好是例如谷物、谷物蛋白質(zhì)、小麥、小麥蛋 白質(zhì)、大豆、脫脂大豆或大豆蛋白質(zhì)。伺含‘棚氏心雜■碰雕棚牛紐白妒口口口在此使用乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，提供了大量有用且具有很好的心率降低特性的多肽或 其它活性成份。因此，并不一定要從發(fā)酵食物材料中更進(jìn)一步的純化或濃縮該多肽或其它 活性成份；且發(fā)酵食物材料可以直接包裝并如食品般于市場上供應(yīng)，最好是凍干狀態(tài)的功 能食品或食品添加物等。在實(shí)施例1中這將獲得驗(yàn)證。簡言之，實(shí)施例1結(jié)果顯示，無須任何其它處理，發(fā) 酵牛奶本身即具有良好的降低心率功效。另外，凍干的發(fā)酵牛奶可懸浮于中性牛奶中，進(jìn)而 可產(chǎn)生一適當(dāng)?shù)氖称?，凍干的發(fā)酵牛奶可因而被視為一適當(dāng)?shù)氖澄锾砑赢a(chǎn)品?！肮δ苁澄?在這是指一食品，消費(fèi)者通過某種途徑得知這食品具有降低心率特 性有關(guān)的有用功能，當(dāng)這種食物被使用時(shí)，它亦可為飼料；然而最好是食品。因此，本發(fā)明在這使用的混合物的實(shí)施例是一食品，包含具有心率降低特性的多 肽或其它活性成份，這食品的制作方法包括下列步驟(1)根據(jù)這里指述的具有降低心率特性的活性成分的制備方法來準(zhǔn)備一種發(fā)酵的 食物材料；(2)將這發(fā)酵食物材料進(jìn)行干燥；以及(3)以適當(dāng)方式包裝這發(fā)酵食物材料，以得到一食品或食品添加物。其中，步驟(2)最好使用冷凍干燥法?！鞍b"應(yīng)該被理解為廣義的，其是指當(dāng)一食物材料被發(fā)酵而得到一發(fā)酵食物材 料，這發(fā)酵食物材料應(yīng)該被包裝起來，以提供給消費(fèi)者。它可以被包裝在一瓶子或一利樂包 (tetra pack)內(nèi)，最好是在包裝上或相對(duì)應(yīng)的銷售材料上能夠指明這產(chǎn)品具有心率降低特 性。這適用于在這描述的產(chǎn)品可適用任何方面或?qū)嵤├?。如?shí)施例1所示，由于經(jīng)過加熱處理的發(fā)酵食物材料亦具有心率降低特性，所以 在食品中的乳酸菌可以是失活的或有活的。使用具有降低心率特件的產(chǎn)品
如上所述，“降低(還原)哺乳動(dòng)物心率"定義為心率的降低與使用在這描述 的混合物前的心率間的相關(guān)性。這心率降低特性的驗(yàn)證最好是使用胃管灌食法(gavage) 將發(fā)酵產(chǎn)品提供給自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)喂食后再使用遠(yuǎn)距測量法24小時(shí)的偵測SHR 于不同時(shí)間點(diǎn)的心率和最好是連續(xù)性的。然而亦有其它動(dòng)物模式可以用來評(píng)估這發(fā)酵產(chǎn) 品對(duì)心率的功效，一個(gè)血壓正常的Wistar大鼠模式的實(shí)施例是描述如例6所示。安慰劑 (Placebo)最好是相關(guān)的未發(fā)酵的食物材料，例如未發(fā)酵的牛奶，更進(jìn)一步的詳細(xì)說明參見 工作例1。本產(chǎn)品是可用來治療冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)或冠狀心臟病(CHD)，例如心絞痛、高 血壓、動(dòng)脈硬化、中風(fēng)、心肌梗塞、大腦血管梗塞，以及血管成形術(shù)后再狹窄、心律不齊、心跳 節(jié)律不齊、充血性心臟衰竭(CHF)、主動(dòng)脈竇逆流、慢性腎衰竭、脂肪代謝障礙、脂蛋白代謝 障礙等。對(duì)于這些癥狀而言，本產(chǎn)品是一相當(dāng)好的藥劑，尤其是對(duì)心絞痛、高血壓和動(dòng)脈硬 化的效果尤佳。此外，對(duì)于心率變動(dòng)問題也產(chǎn)生興趣，在實(shí)施例1、4和5中證實(shí)發(fā)酵產(chǎn)品可有效降 低心率，但也意外地發(fā)現(xiàn)其亦可降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活性時(shí)期的心率變動(dòng)。尤其在壓力情況下觀 察心率變動(dòng)頻率的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)，即因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ街行穆首兓c死亡率相關(guān)，心率變動(dòng) 的阻尼(Damping)可能是一個(gè)重要的特征(Zaza et al 2001)。由于冠狀動(dòng)脈疾病一般是長期逐漸形成的，在其形成過程中具有許多機(jī)會(huì)來預(yù)防 或控制它，預(yù)防治療可以早一點(diǎn)開始，如這才可減低動(dòng)脈硬化生長的速度。因此，本產(chǎn)品的 另一種最好使用方法是作為一種預(yù)防方式，在這種情形下，本產(chǎn)品更可為一種食品或食物 添加物，使人們可以于日常食用或經(jīng)常性食用。本產(chǎn)品最好具有超過安慰劑10%以上的心率降低功效，且這安慰劑是如上所述與 為發(fā)酵食物材料有關(guān)。利用這定義，更好的產(chǎn)品是具有超過安慰劑15%以上的心率降低功 效；甚至更好的產(chǎn)品是具有一為20%以上的安慰劑的心率降低功效，且最好的產(chǎn)品是具有 一為25%以上的安慰劑的心率降低功效。從發(fā)酵勿材料耳又得的心率降低多肽或其它丨舌件分的純仆,如上所述，在這描述的乳酸菌的使用，是提供發(fā)酵后直接得到大量具有很好心率 降低特性的多肽或其它活性成份。然而，在一些情況下，最好對(duì)自發(fā)酵食物材料取得的心率降低多肽或其它活性成 份進(jìn)行一后續(xù)純化步驟，例如，當(dāng)多肽或其它活性成份被制作成藥劑，例如藥片，其是需要 很高濃度的心率降低多肽或其它活性成份。所以，在本發(fā)明一種實(shí)施例中，本產(chǎn)品是為一藥 劑。再者，實(shí)施例1顯示心率降低功效與產(chǎn)品的濃度因素呈比例關(guān)系。因此，本發(fā)明的一實(shí)施例是與在這描述的使用有關(guān)，即發(fā)酵食物材料需經(jīng)更進(jìn)一 步處理，以純化或濃縮該具有心率降低特性的多肽或其它活性成份，其取得的制作方法包 括下列步驟(1)準(zhǔn)備一發(fā)酵食物材料，其是根據(jù)一制法來準(zhǔn)備在這描述的具有心率降低特性 的多肽或其它活性成份；(2)對(duì)步驟(1)的發(fā)酵食物材料進(jìn)行更進(jìn)一步的處理，其處理方式是以純化或向 上濃縮這具有心率降低特性的活性成份；以及
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(3)以適當(dāng)方式包裝這發(fā)酵食物材料，以得到一產(chǎn)品。這種方式是為一種可獲得在本產(chǎn)品中相對(duì)高濃度的具有心率降低特性的多肽或 其它活性成份的解決方式。假如這產(chǎn)品是一種食品，則這過程更包含一步驟(4)，將步驟⑵取得的濃縮多肽 或其它活性成份添加至一食品中。根據(jù)上述的步驟(2)，向上濃縮的最佳實(shí)施例是將包含具有心率降低特性的多肽 或其它活性成份的發(fā)酵食物材料進(jìn)行離心，并可在分離后的上清液(supernatant)得到多 肽或其它活性成份。假如食物材料是牛奶，則其產(chǎn)物為一乳漿(whey)，如實(shí)施例1所示，乳 漿是為一具有優(yōu)異心率降低特性的產(chǎn)品。因此，本產(chǎn)品的較佳實(shí)施例為乳漿。 這離心分離法最好使用，例如，轉(zhuǎn)速在2，OOOrpm至20，OOOrpm并持續(xù)1至20分鐘， 這離心分離法亦可在一離心機(jī)中進(jìn)行的。這取得的上清液更可進(jìn)一步利用反相樹脂(reverse-phase resin)進(jìn)行純化處 理，使得到的樣品，其具有心率降低特性的多肽或其它活性成份的含量逐漸增加。這利用反 相樹脂的純化處理是以反相樹脂對(duì)多肽或其它活性成份進(jìn)行吸收及溶離(elution)，及/ 或利用利用反相色譜分析法(chromatography)，使多肽或其它活性成份的純度增加。有關(guān)這反相樹脂理論文獻(xiàn)的更多的技術(shù)說明是請(qǐng)參閱EP 821968?；蛘撸@發(fā)酵食物材料更可進(jìn)行進(jìn)一步處理，其方式是為在發(fā)酵食物材料上進(jìn)行 納米過濾(nanofiltration)，這做法可能為了從發(fā)酵食物材料中去除乳酸或單價(jià)離子。有關(guān)這納米過濾理論文獻(xiàn)的更多的技術(shù)說明是請(qǐng)參閱W0 01/32905。如實(shí)施例4所述，濃縮到21倍的乳漿產(chǎn)品在心率上有明顯的劑量依賴效應(yīng)。在這 實(shí)驗(yàn)中固定或漸進(jìn)的水平線并未達(dá)到，表示，包含更高濃度活性成份的混合物可預(yù)期到具 有更高的降低心率功效。鍾在本發(fā)明的制作過程中，這種食物材料是由處于操作狀態(tài)的乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，可 以根據(jù)食物材料的種類及/或與乳酸菌的結(jié)合不同而變化。如果食物材料并非是水性溶 液，最好將食物材料先溶解于適當(dāng)?shù)乃匀芤褐?，然后再與乳酸菌混合并發(fā)酵培養(yǎng)。乳酸菌的培養(yǎng)可以通過將先培養(yǎng)乳酸菌的菌原(starter)加入食物材料培養(yǎng)基 (medium)來完成，培養(yǎng)基可以先經(jīng)過高溫消毒(heat-sterilized)并冷卻到一預(yù)設(shè)的培養(yǎng) 溫度。乳酸菌菌原的最佳培養(yǎng)濃度為105至107個(gè)乳酸菌/每毫升培養(yǎng)基；培養(yǎng)溫度通常為 20至50°C，最好為30至45°C ；培養(yǎng)時(shí)間通常為3至48小時(shí)，最好為6至24小時(shí)。培養(yǎng)過 程最好是在pH值在3. 5至7范圍中的培養(yǎng)基中進(jìn)行，且為了有效地進(jìn)行乳酸菌培養(yǎng)，其pH 值最好是在5至6的間。再者，為進(jìn)行固定pH值的培養(yǎng)，其pH值最好維持在4至7的范圍 內(nèi)。當(dāng)乳酸菌的濃度超過108個(gè)/毫升的后，培養(yǎng)即可終止而不受限制。有關(guān)制作過程的較佳實(shí)施例為，食物材料的發(fā)酵是從每100毫升食物材料生產(chǎn)出 0. 5至25毫克具有心率降低特性的多肽或其它活性成份，更好的是從每100毫升食物材料 生產(chǎn)出1至5毫克具有心率降低特性的多肽或其它活性成份。哺乳動(dòng)物哺乳動(dòng)物包含動(dòng)物，例如馴養(yǎng)動(dòng)物(如貓和狗)、豬、牛、羊及魚，這哺乳動(dòng)物最佳 的實(shí)施例為人。
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乳酸菌如上面所述，有關(guān)"乳酸菌"的命名是指一組革蘭氏陽性菌、過氧化氫酶陰性菌、 無運(yùn)動(dòng)的(non-motile)、微量嗜氧菌或厭氧細(xì)菌，能發(fā)酵糖而制造出酸，包括大量產(chǎn)生的乳 酸、醋酸、甲酸和丙酸。另外，還包括屬于乳酸桿菌屬(genus Lactobacillus)的乳酸菌種類，例如瑞士 乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、保力卩禾lj亞乳酸桿菌(Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus)等；屬于乳球菌屬(genus Lactococcus)的乳酸菌，例如乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)；屬于鏈球菌屬(genus Streptococcus)的乳酸菌，例如唾液鏈 球菌口譽(yù)熱亞禾中(Streptococcus salivarius subsp. thermophilus)；屬于明串珠球菌屬 (genusLeuconostoc)的乳酸菌,例如乳酸明串珠球菌(Leuconostoc lactis)；屬于雙歧桿 菌屬(genus Bifidobacterium)的乳酸菌，例如長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)或 短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)；以及屬于片球菌屬(genus Pediococcus)的乳酸 菌。所用乳酸菌可以是含有其它微生物的混合物，例如酵母(yeasts)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，有許多公開可用的不同乳酸菌，請(qǐng)參照德國國家菌種培育 中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ),以及國 家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的因特 網(wǎng)分類瀏覽器。更好的是一種桿菌門(phylum Firmicutes)的乳酸菌，較好的是桿菌綱 (classBacillus)，更好的是乳酸桿菌目(order Lactobacillales)，在這目中的乳酸菌為 一種乳酸桿菌科(family Lactobacillaceae)，最好是為乳酸桿菌屬，更好地，它是為一 種瑞士乳桿菌種。更進(jìn)一步的詳細(xì)說明見伯格氏(Bergey)細(xì)菌分類手冊(cè)第二版第一冊(cè) (Bergey'sManual of Systematic Bacteriology,Second Edition,Volume 1 :The Archea and the DeeplyBranching and Phototrophic Bacteria)白勺分一特別好的瑞士乳桿菌種(Lactobacillus helveticus strain)CHCC 5951 的 樣品寄存在DSMZ內(nèi)，登記號(hào)為DSM 14998，寄存日為2002年5月15日。這種寄存是 根據(jù)微生物有機(jī)體保存專利程序的國際認(rèn)可布達(dá)佩斯協(xié)議(Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Micro organisms for the Purposes of Patent Procedure)的規(guī)定。所以，有關(guān)在這使用的乳酸菌的一個(gè)較佳實(shí)施例是登記號(hào)DSM 14998的瑞士乳桿菌。另外，一種瑞士乳桿菌種CHCC 4080的桿品寄存在DSMZ，登記號(hào)為DSM 14997，寄 存日為2002年5月15日。寄存是根據(jù)微生物有機(jī)體保存專利程序的圍際認(rèn)可布達(dá)佩斯協(xié) 議的規(guī)定。更好的菌種是登記號(hào)為FERM BP-4835的瑞士乳桿菌，登記號(hào)為FERM BP-6060的 瑞士乳桿菌，登記號(hào)為DSM 13137的瑞士乳桿菌種，瑞士乳桿菌種CNRZ32以及瑞士乳桿菌 CP790。含有分子量200kDa細(xì)朐,壁的Mlf (LAB)較好的乳酸菌是包含一種分子量約200kDa的特定細(xì)胞壁蛋白酶的，這種乳酸菌特別適合制備具有心率降低特性的多肽或其它活性成份。較佳的乳酸菌詳細(xì)說明如下。這種特定細(xì)胞壁蛋白酶在這稱為prtH200蛋白酶。如這部份說明的，prtH200 蛋白酶是與在美國威斯康星州與猶他州立大學(xué)的論文(1999，J. of Bacteriology, 181 4592-4597)中所發(fā)表的瑞士乳桿菌種CNRZ32相當(dāng)，在這論文中并未描述有使用CNRZ32種 來制造具有心率降低特性的多肽或其它活性成份。這乳酸菌的特征在于其包含編碼細(xì)胞壁蛋白酶(稱為prtH200)的基因序列，其中 定義為prtH200的基因序列是為編碼表現(xiàn)細(xì)胞壁蛋白酶活性的酶的脫氧核糖核酸(DNA)序 列，這DNA序列是選自包括下述的組(a)這DNA序列是出現(xiàn)在SEQ ID NO 1的1-5550的位置；(b)DNA 序列包含一至少 75 堿基對(duì)(base pairs, bp)的片段(fragment)，其與(a) 所定義的DNA序列的對(duì)應(yīng)片段至少有50%的同源性；(c)DNA序列是編碼表現(xiàn)細(xì)胞壁蛋白酶活性的多肽(polyp印tide)，多肽包含至少 200氨基酸(amino acids, aa)的片段，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 2的1-1849位置的多肽序 列的對(duì)應(yīng)片段至少有30%的同源性；(d)DNA序列是與包含表現(xiàn)在SEQ ID NO 1的1-5550位置的DNA序列的雙股DNA 探針在低嚴(yán)格性下進(jìn)行雜交(hybridize)；以及(e)DNA序列，是(a)、(b)、(c)或(d)中說明的DNA序列片段。存在于乳酸菌中的基因序列編碼成prtH200蛋白酶已被使用適當(dāng)設(shè)計(jì)的聚合酶 鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)引物(primer)的PCR擴(kuò)增方法證實(shí)。當(dāng)本領(lǐng) 域技術(shù)人員具有適當(dāng)設(shè)計(jì)的PCR引物，對(duì)他而言，使用其一般知識(shí)來選擇一特定適當(dāng)?shù)腜CR 擴(kuò)增法去驗(yàn)證這基因序列是否存在于乳酸菌中是相當(dāng)容易的。所以，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以篩選(screen) —定數(shù)量的乳酸菌，驗(yàn)明包含有 prtH200基因序列的乳酸菌，并因此得到具有改良工業(yè)相關(guān)特性的特選乳酸菌。一種特別好的瑞士乳桿菌種CHCC 5951的樣品是寄存在DSMZ，登記號(hào)為 DSM14998，寄存日為2002年5月15日。這寄存是根據(jù)微生物有機(jī)體保存專利程序的國際 認(rèn)可布達(dá)佩斯協(xié)議的規(guī)定。因此，有關(guān)在這部份使用的乳酸菌的一較佳實(shí)施例是為登記號(hào)DSM 14998的瑞士 乳桿菌。使用寄存的DSM 14998品種作為起始物質(zhì)，使這技藝的讀者可以藉由傳統(tǒng)的突變 技術(shù)或重新分離技術(shù)，以進(jìn)一步得到突變體或衍生物，其是保持有適合制備具有心率降低 特性的多肽或其它活性成份的能力。乳酸菌的蛋白質(zhì)水解活性(Proteolytic activity of the lactic acid bacteria)于這段描述的prtH200、orfF3及orfF4基因序列是可視為指紋，具有高度適合證 明在這描述的乳酸菌。不受限于理論，理論上有帶有這里描述的指紋基因序列而不展現(xiàn)有 利的特性的菌種存在。因此，一旦驗(yàn)證在乳酸菌中具有于這段描述的指紋基因序列存在時(shí)，其是有利于 測試乳酸菌的蛋白質(zhì)水解活性，在本文中，一個(gè)較佳的乳酸菌是具有一較佳的蛋白質(zhì)水解 活性，詳細(xì)說明如下。
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在本文中，當(dāng)一乳酸菌具有合成一活性細(xì)胞壁蛋白酶的能力時(shí)，這乳酸菌被認(rèn)為 具有蛋白質(zhì)水解活性；換言的，證明蛋白酶在細(xì)菌的細(xì)胞部份外有活性。再者，這蛋白酶應(yīng) 該具有使其降解(degrade)蛋白質(zhì)(例如牛奶中的酪蛋白)的能力，以得到具有心率降低 特性的多肽或其它活性成份。細(xì)菌的蛋白質(zhì)水解活性最好是利用一個(gè)程序檢測，包括下列步驟(1)以細(xì)菌發(fā)酵200毫升的食物材料一整夜；(2)提取(extract)產(chǎn)生的多肽或其它活性成份；以及(3)測量提取出的多肽或其它活性成份的心率降低特性，是通過測量需要抑制 50%血管收縮素轉(zhuǎn)化酶(ACE)活性的多肽濃度的一種分析法。這種ACE抑制活性檢測值在這也稱為DL50，DL50值越低，即表示包含在本產(chǎn)品中 的多肽或其它活性成份的心率降低效果越佳。在該程序的步驟(1)中，較好的食物材料為新鮮牛奶；再者，細(xì)菌最好以v/v 灌注至食物材料中，并維持于適當(dāng)?shù)臏囟冗^夜培養(yǎng)。這種適當(dāng)溫度是適合細(xì)菌生長的溫度， 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道如何去驗(yàn)證其為一特定的細(xì)菌。對(duì)乳酸桿菌種而言，其適當(dāng)溫度為 37°C，對(duì)乳酸球菌種的適當(dāng)溫度則為30°C。在工作實(shí)施例3是提供一詳細(xì)的較佳協(xié)議，以說明發(fā)酵及提取步驟，并詳細(xì)說明 這DL50的ACE活性檢測。最好，這乳酸菌是具有蛋白質(zhì)水解活性的能力，這種程序包括下列步驟(1)以細(xì)菌發(fā)酵200毫升的食物材料一整夜；(2)提取產(chǎn)生的多肽或其它活性成份；以及(3)測量提取出的多肽或其它活性成份的抗高血壓特性，是利用一種檢測法來測 量需要抑制50% ACE活性的多肽濃度。產(chǎn)生的多肽或其它活性成份的ACE抑制活性(DL50)為0.25至5.0(毫克/毫升) 之間。最好，乳酸菌具有產(chǎn)生多肽或其它活性成份的ACE抑制活性(DL50)0.25至 4.0(毫克/毫升)間的能力；更佳者，乳酸菌具有產(chǎn)生多肽或其它活性成份的ACE抑制活 性(01^50)0.25至3.5(毫克/毫升)間的能力。較低的DL50范圍是1. 0毫克/毫升而不是0. 25毫克/毫升。根據(jù)慣用的定義，有關(guān)"基因"的定義為遺傳的基本物理與功能單位。基因是一 種在特定染色體的特定位置上的整齊序列的核苷酸(例如DNA或RNA)，編碼特定功能的產(chǎn) 品(例如蛋白質(zhì)或RNA分子)。‘‘簡并弓丨物的命名(nomenclature of degenerated primers)“是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù) 的標(biāo)準(zhǔn)命名法，Y = C或T;R = A或G;M = A或C;K = G或T;S = G或C;W = A或T;H = A或C或T;B = G或T或C;V = G或C或A;D = G或A或T;N = G、A、C或T。有關(guān)"片段"的名稱是與一 DNA/氨基酸有關(guān)，這氨基酸是包含代表連續(xù)部份序 列的片段。例如，在氨基酸序列的75至300位置是具有600個(gè)氨基酸。有關(guān)"對(duì)應(yīng)片段"的名稱是與比較二序列的片段的相同長度有關(guān)，最好，這二 片段比較后的長度差異是少于50% ；換言的，假如一片段為lOObp，另一片段則最好少于 150bp。更佳者，這二片段比較后的長度差異是小于25%，以及最佳者，這二片段比較后的長度差異小于5%。prtH200細(xì)胞壁蛋白酶存在于乳酸菌中的細(xì)胞壁蛋白酶的活性已被證實(shí)，一合適的策略是通過在編碼待 檢測的細(xì)胞壁蛋白酶的基因中的致死突變(lethal mutation)構(gòu)建一種乳酸菌，然后這構(gòu) 建細(xì)菌的蛋白質(zhì)水解活性(以適當(dāng)檢測)可與相對(duì)應(yīng)的野生型細(xì)菌(wild typebacterium) 進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)證明具有致死突變的乳酸菌與野生型細(xì)菌比較后，可檢測到蛋白質(zhì)水解活 性的減少，證明編碼待檢測的細(xì)胞壁蛋白酶基因是編碼活性乳酸細(xì)胞壁蛋白酶的基因。熟悉這種技術(shù)的人士知道如何利用適當(dāng)?shù)闹滤劳蛔儊順?gòu)建一乳酸菌，其制造方式 請(qǐng)參考如Pederson等人(1999)及Yamamoto等人(1994)的論文。在本發(fā)明的申請(qǐng)日，國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)在其網(wǎng)站(http://www. ncbi. nlm. nih. rov/)上提供一種標(biāo)準(zhǔn)BLAST計(jì)算機(jī)序列同源性的搜索程序。SEQ ID NO 1 及 SEQ ID NO 2 里表現(xiàn)的瑞士乳桿菌 DSM 14998 的 prtH200 的 DNA 及氨基酸序列是登記在GeneBank數(shù)據(jù)庫中，登記號(hào)為AF 133727，且其數(shù)據(jù)庫序列標(biāo)記為g i|5758038|gb|AF133727. 1|AF133727。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)BLAST [blastp]搜尋是使用表現(xiàn)在SEQ ID NO 2的1-1849 位置的prtH200氨基酸序列作為參考序列，其中，搜尋結(jié)果如下所示(斜體字代表數(shù)據(jù)庫序 列證明，這報(bào)告明白確認(rèn)已發(fā)表的序列，且本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何藉這得到該些序列)gi 1129346 | sp | P15293 | P2P_LACLC :PII 型蛋白酶前驅(qū)物(Lactocepin)(細(xì)胞 壁-結(jié)合絲蛋白酶)有機(jī)體:Lactococcus lactis subsp. cremoris.同源性一 1600氨基酸片段與SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的對(duì)應(yīng)片段有 50%的同源性。gi 1149582 | gb | AAA25248. 1 蛋白酶有機(jī)體 Lactobacillus paracasei.同源性一 1632氨基酸片段與SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的對(duì)應(yīng)片段有 49%的同源性。gi 11381114 |gb|AAC41529. 1 (L48487)蛋白酶前驅(qū)物有機(jī)體Lactobacillus delbrueckii.同源性一 1682氨基酸片段與SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的對(duì)應(yīng)片段有 32%的同源性。gi 118568398 | gb | AAL76069. 11 (AF468027)細(xì)胞膜蛋白酶有機(jī)體 Lactobacillus pentosus.同源性一 415氨基酸片段與SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的對(duì)應(yīng)片段有 63%的同源性。gi | 9963932 |gb|AAG09771. 1 |AF243528_1 (AF243528)細(xì)胞膜蛋白酶有機(jī)體Streptococcus thermophilus.同源性一 781氨基酸片段與SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的對(duì)應(yīng)片段有 30%的同源性。gi |482386|pir| |A44833 :PII 型蛋白酶前驅(qū)物(EC 3.4.21.96)
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有機(jī)體:Lactococcus lactis同源性一 264氨基酸片段與SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的對(duì)應(yīng)片段有 61%的同源性。這些特定的序列全部代表一個(gè)DNA序列，它編碼表現(xiàn)細(xì)胞壁蛋白酶活性的一種多 肽，包含至少200氨基酸(amino acids, aa)片段，與位于SEQ ID NO 2的1-1849位置的多 肽序列的對(duì)應(yīng)片段至少有30%的同源性。標(biāo)準(zhǔn)核苷酸-核苷酸BLAST [blastn]搜尋是使用表現(xiàn)在SEQ ID NO 1的1-5550 位置的prtH200氨基酸序列作為參考序列，其中，搜尋結(jié)果如下所示gi 1149580 |gb|M83946. 11 LBAMPRO 蛋白酶(prtP)基因有機(jī)體Lactobacillus paracasei.同源性一 102bp片段與SEQ ID NO 1的prtH200DNA序列的對(duì)應(yīng)片段有84%的
同源性。gi | 47197 |emb 1X14130. 11 SLPRT763 質(zhì)體pLP763prt 基因，細(xì)胞壁-結(jié)合絲蛋白酶有機(jī)體:Streptococcus lactis同源性一 81bp片段與SEQ ID NO 1的prtH200DNA序列的對(duì)應(yīng)片段有86%的同源性。gi | 472834 | gb | M24767. 11 STRWGPR0T. :Wg2 蛋白酶基因有機(jī)體S. Cremoris同源性一 81bp片段與SEQ ID NO 1的prtH200DNA序列的對(duì)應(yīng)片段有86%的同源性。gi 1149476 |gb|j04962. 11 LACPRASE. :PIII 型蛋白酶(prtP)及成熟蛋白質(zhì)有機(jī)體:Lactococcus lactis同源性一 81bp片段與SEQ ID NO 1的prtH200DNA序列的對(duì)應(yīng)片段有86%的同源性。gi 118568397 |gb|AF468027. 11.細(xì)胞膜蛋白酶(prtP)基因有機(jī)體 Lactobacillus pentosus同源性一 102bp片段與SEQ ID NO 1的prtH200DNA序列的對(duì)應(yīng)片段有83%的
同源性。這些特定的序列全部代表一種包含至少75個(gè)堿基對(duì)(bp)片段的DNA序列，與位 于SEQ ID NO 1的1-5550位置的DNA序列的對(duì)應(yīng)片段至少有50%的同源性。其它〃指紋〃基因序列(orfF3及orfF4)orfF3 最好，除了 prtH200基因序列的外，乳酸菌也帶有一個(gè)包括orfF3開放讀碼框 (openreading frame)的基因，這基因可視為一個(gè)附加的指紋。瑞上乳桿菌DSM 14998的orfF3的DNA及氨基酸序列是表現(xiàn)在SEQ ID N0 3及 SEQ ID NO 4。因此，在一較佳實(shí)施例中，在這段描述的乳酸菌包括這prtH200基因和基因序列 (稱為orfF3)編碼成一開放讀碼框，其中這基因序列是使用PCR引物的乳酸菌的基因組 PCR擴(kuò)增方法來進(jìn)行識(shí)別鑒定，這PCR引物是選自下列所組成的群組[正義序列(sense
13sequence)禾爾為 S ；反義序列(antisense sequence)禾爾為 A]orfF3 (a) (S) :5，CGAAGGCGATAAGTCAAACTTTGATAATGC3，(A) :5，CCCGGTTCTGTAAGATAATTTGGATCG3，；及(b) (S) :5，ASTCWRRYTTYGATRATGCW3，，(A) :5， BHKYAMSAWARTTTGGATCR3，。上述合適的PCR引物可以基于這里提供的序列進(jìn)行識(shí)別確認(rèn)。因此，在一較佳實(shí)施例中，在這段描述的乳酸菌包括這prtH200基因和基因序列 編碼成一開放讀碼框(稱為orfF3)，其中這定義為orfF3的DNA序列是為一脫氧核糖核酸 (DNA)序列編碼成一開放讀碼框，且這DNA序列是選自下列組(a)這DNA序列是出現(xiàn)在SEQ ID NO 3的1-2679的位置；(b) 一 DNA序列包含一至少75堿基對(duì)(bp)的片段(fragment)，其與(a)所定義 的DNA序列的對(duì)應(yīng)片段至少有40 %的同源性。(c) 一 DNA序列是編碼成一多肽，包含至少200氨基酸(aa)的片段，其與表現(xiàn)在 SEQ ID NO 4的1-893位置的多肽序列的對(duì)應(yīng)片段至少有30%的同源性；(d) 一 DNA序列是與包含表現(xiàn)在SEQ ID NO 3的1-2679位置的DNA序列的雙股 DNA探針在低嚴(yán)格性下進(jìn)行雜交(hybridize)；以及(e) 一 DNA序列，其是為(a)、(b)、(c)或(d)中說明的DNA序列片段。名稱〃開放讀碼框(open reading frame)“表示一段DNA，它包含轉(zhuǎn)譯的起始信 號(hào)、形成蛋白質(zhì)的足夠長的正確順序的氨基酸三聯(lián)密碼子、轉(zhuǎn)譯的終止信號(hào)，并因此而驗(yàn)證 一蛋白質(zhì)編碼基因的存在。在本發(fā)明的申請(qǐng)日，一標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)BLAST [blastp]搜尋是使用表現(xiàn)在 SEQID NO 4的1-893位置的演繹orfF3氨基酸序列作為參考序列，且其相對(duì)限制的最終結(jié) 果是與已發(fā)表的同源序列有關(guān)。然而，不限于理論，理論上，在這段描述的orfF3基因編碼成一細(xì)胞壁蛋白酶是為 可信的，因此，在一較佳實(shí)施例中在這段描述的orfF3基因可編碼成一細(xì)胞壁蛋白酶。0rfF4 最好，除了 prtH200基因序列的外，這乳酸菌亦包括一含有開放讀碼框的基因，在 這稱為orfF4。瑞士乳桿菌DSM 14998的orfF4的DNA及氨基酸序列是表現(xiàn)在SEQ ID N0 5及 SEQ ID NO 6。因此，在一較佳實(shí)施例中，在這段描述的乳酸菌包括這prtH200基因和基因序列 (稱為orfF4)編碼成一開放讀碼框，其中這基因序列是使用PCR引物的乳酸菌的基因組 PCR擴(kuò)增方法來進(jìn)行識(shí)別鑒定，這PCR引物是選自包括下列組成的組[正義序列(sense sequence)禾爾為 S ；反義序列(antisense sequence)禾爾為 A]orfF4 (a) (S) :5，GGTGTTGCTCCTGAAGC 3，(A) :5， ACTCTAGCACCAGCTAATTGAACATCATG3，上述合適的PCR引物可以基于在這揭露的序列進(jìn)行識(shí)別確認(rèn)。因此，在一較佳實(shí)施例中，在這段描述的乳酸菌是包括這prtH200基因和基因序 列編碼成一開放讀碼框(稱為orfF4)，其中這定義為orfF4是DNA序列編碼成一開放讀碼
14框，且這DNA序列是選自下列所組成的群組(a)這DNA序列是表現(xiàn)在SEQ ID NO 5的1-4881的位置；(b) 一 DNA序列包含一至少75堿基對(duì)(bp)的片段，其與(a)所定義的DNA序列的 對(duì)應(yīng)片段至少有40%的同源性。(c) 一 DNA序列是編碼成一多肽，包含至少200氨基酸(aa)的片段，其與表現(xiàn)在 SEQ ID NO 6的1-1627位置的多肽序列的對(duì)應(yīng)片段至少有30%的同源性；(d) 一 DNA序列是與包含表現(xiàn)在SEQ ID NO 5的1-4881位置的DNA序列的雙鏈 DNA探針在低嚴(yán)格性下進(jìn)行雜交；以及(e) 一 DNA序列，其是為(a)、(b)、(c)或(d)中說明的DNA序列片段。在本發(fā)明的申請(qǐng)日，一標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)BLAST [blastp]搜尋是使用表現(xiàn)在 SEQID NO 6的1-1627位置的orfF4氨基酸序列作為參考序列，且其相對(duì)限制的最終結(jié)果是 與已發(fā)表的同源序列有關(guān)。然而，無須受限于學(xué)理，理論上，在這段描述的orfF4基因編碼成一細(xì)胞壁蛋白酶 是為可信的，因此，在一較佳實(shí)施例中在這段描述的orfF4基因是可編碼成一細(xì)胞壁蛋白 酶。最好，在這段描述的乳酸菌是包括于這敘述的prtH200基因、orfF3基因以及 orfF4基因。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增如上所述，在這描述的基因序列的存在最好利用使用PCR引物的PCR擴(kuò)增來證實(shí) 的，且這PCR引物的設(shè)計(jì)是根據(jù)在這所教導(dǎo)者。當(dāng)本領(lǐng)域技術(shù)人員具有適當(dāng)設(shè)計(jì)的PCR引 物時(shí)，對(duì)他而言，使用其一般知識(shí)來選擇一特定適當(dāng)?shù)腜CR擴(kuò)增程序去驗(yàn)證這些基因是否 存在于乳酸菌中是相當(dāng)容易的。最好，這PCR擴(kuò)增協(xié)議是根據(jù)實(shí)施例2所描述的內(nèi)容來訂定的。一旦進(jìn)行PCR擴(kuò)增，不管產(chǎn)生的PCR擴(kuò)增序列是否相當(dāng)于在這段描述的基本片段， 對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，是為其研究慣常的程序。由于本領(lǐng)域技術(shù)人員一班概略地知道一 陽性PCR片段會(huì)有多大的長度，所以通?？苫赑CR片段的長度來進(jìn)行驗(yàn)明，且陽性PCR片 段是與在這段描述的基因PCR片段有關(guān)。選擇性地，PCR片段可以做DNA測序，然后得到的 DNA序列可與在這表明的序列相比較；再者，相對(duì)這PCR片段的基因致死變種的乳酸菌是可 被構(gòu)建，然后這構(gòu)建細(xì)菌的蛋白質(zhì)水解活性(參下面)可以與相對(duì)的野生細(xì)菌進(jìn)行比較，且 在這二細(xì)菌間的蛋白質(zhì)水解活性的量測變化是可被實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，而不管相當(dāng)于擴(kuò)增PCR片段 的基因是否為如這段所描述的編碼一種乳酸細(xì)胞壁蛋白酶。總的，不管一特定乳酸菌是否包含給予相對(duì)陽性PCR片段的基因能力，本領(lǐng)域技 術(shù)人員是可使用在這教導(dǎo)所設(shè)計(jì)的PCR引物來進(jìn)行驗(yàn)明。 PCR是用來研究這基因是否存在于乳酸菌中最好的方式，然而，他亦可以以其它進(jìn) 行，例如，利用Southern點(diǎn)雜文分析法(Southern blot analysis)。PCR 引物如上述說明的，關(guān)于PrtH200基因的適當(dāng)PCR引物為PrtH200 (a) (S)5，CGATGATAATCCTAGCGAGC3，，(A)5，TGGCAGAACCTGTGCCTA3，；
(b):(S) 5，GCCAAGACGCCTCTGGTA3，，
(A) 5，TAGGTATAGTTTCCATCAGGA3，；
(c):(S)5，AARGTWCCWTAYGGYYWYAAYTA3'
(A) 5’ GCCATDSWDGTRCCDSWCATDTK3
PrtH200:(a)(S)是表現(xiàn)在SEQ ID NO 7 ；
PrtH200:(a)(A)是表現(xiàn)在SEQ ID NO 8 ；
PrtH200:(b)(S)是表現(xiàn)在SEQ ID NO 9 ；
PrtH200:(b)(A)是表現(xiàn)在 SEQ ID NO 10 ；
PrtH200:(c)(S)是表現(xiàn)在SEQ ID NO 11 ；及
PrtH200:(c)(A)是表現(xiàn)在 SEQ ID NO 12。當(dāng)使用(a)的引物時(shí)，擴(kuò)增的PrtH200PCR片段較佳的長度應(yīng)該介于400bp至 800bp的間，更佳的長度則介于500bp至700bp的間。當(dāng)使用(b)的引物時(shí)，這擴(kuò)增的 PrtH200PCR片段較佳的長度應(yīng)該介于200bp至500bp的間，更佳的長度則介于250bp至 375bp的間。當(dāng)使用(c)的引物時(shí)，擴(kuò)增的PrtH200PCR片段較佳的長度應(yīng)該介于400bp至 800bp的間，更佳的長度則介于500bp至700bp的間。最佳的PrtH200相關(guān)的PCR引物是為編號(hào)(a)的引物以及編號(hào)(b)的引物。如上述說明者，關(guān)于orfF3的適當(dāng)PCR引物為orfF3 (a) (S) :5，CGAAGGCGATAAGTCAAACTTTGATAATGC3，(A) :5，CCCGGTTCTGTAAGATAATTTGGATCG 3，；及(b) (S) :5，ASTCWRRYTTYGATRATGCW 3，，(A) :5， BHKYAMSAWARTTTGGATCR 3，。orfF3 (a) (S)是表現(xiàn)在 SEQ ID NO 13orfF3 (a) (A)是表現(xiàn)在 SEQ ID NO 14orfF3 (b) (S)是表現(xiàn)在 SEQ ID NO 15 ；及orfF3 (b) (A)是表現(xiàn)在 SEQ ID NO 16。當(dāng)使用(a)的引物時(shí)，擴(kuò)增的orfF3PCR片段較佳的長度應(yīng)該介于1250bp至 1900bp的間，更佳的長度則介于1500bp至1725bp的間。當(dāng)使用(b)的引物時(shí)，擴(kuò)增的 orfF3PCR片段較佳的長度應(yīng)該介于1250bp至1900bp的間，更佳的長度則介于1500bp至 1725bp 的間。最佳的orfF3相關(guān)的PCR引物是為編號(hào)(a)的引物。如上述說明者，關(guān)于orfF4的適當(dāng)PCR引物為orfF4 (a) (S) :5，GGTGTTGCTCCTGAAGC3，，(A) :5， ACTCTAGCACCAGCTAATTGAACATCATG3，。orfF4 (a) (S)是表現(xiàn)在 SEQ ID NO 17 ；及orfF4 (a) (A)是表現(xiàn)在 SEQ ID NO 18。當(dāng)使用(a)的引物時(shí)，擴(kuò)增的orfF4PCR片段較佳的長度應(yīng)該介于700bp至1150bp 的間，更佳的長度則介于875bp至1025bp的間。DNA序列的同源/ 一致性參照上述內(nèi)容，DNA序列的同源/ 一致性是由兩序列間的同源性程度所決定的。
在本發(fā)明的申請(qǐng)日，國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)在其網(wǎng)站(http://www. ncbi. nlm. nih. rov/)上提供一種標(biāo)準(zhǔn)BLAST計(jì)算機(jī)序列同源性的搜索程序。BLAST 程序是敘述于[Altschul et al (1997)，“ Gapped BLAST and PS I-BLAST a newgeneration of protein database search programs" , Nucleic Acids Res. 25 3389-3402]。在本文中，較佳的計(jì)算機(jī)同源搜尋程序是為"標(biāo)準(zhǔn)核苷酸-核苷酸 BLAST [blastn]“搜尋，且在本申請(qǐng)案的申請(qǐng)日，在NCBI網(wǎng)站已具有過濾性(filter)低復(fù) 雜性；預(yù)期性(expect) :10，及序列長度11等設(shè)定。程序里引入?yún)⒖夹蛄?，且這程序是驗(yàn)明已發(fā)表序列與參考序列的對(duì)應(yīng)片段間的同 源性百分比。使用標(biāo)準(zhǔn)核苷酸-核苷酸BLAST計(jì)算機(jī)程序，在這描述的prtH200序列通常為 含有至少75堿基對(duì)(bp)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 1的1-5550位置的 prtH20DNA序列的對(duì)應(yīng)片段至少有60%的同源性；更佳者，含有至少75堿基對(duì)(bp)片段的 DNA序列與表現(xiàn)在SEQ ID NO 1的1-5550位置的prtH20DNA序列的對(duì)應(yīng)片段至少有70%的 同源性；最佳者，含有至少75堿基對(duì)(bp)片段的DNA序列與表現(xiàn)在SEQ ID NO 1的1-5550 位置的prtH20DNA序列的對(duì)應(yīng)片段至少有80%的同源性。就上述所提供的同源性百分比而言，這片段通常為至少100堿基對(duì)(bp)，最好的 片段為至少200堿基對(duì)，更佳者的片段為至少400堿基對(duì)，最佳者的片段則為至少1500堿基對(duì)。使用標(biāo)準(zhǔn)核苷酸-核苷酸BLAST計(jì)算機(jī)程序，在這描述的orfF3序列通常為含有 至少75堿基對(duì)(bp)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 3的1-2679位置的orfF3DNA 序列的對(duì)應(yīng)片段至少有60%的同源性；更佳者，含有至少75堿基對(duì)(bp)片段的DNA序列與 表現(xiàn)在SEQ ID NO 3的1-2679位置的orfF3DNA序列的對(duì)應(yīng)片段至少有70%的同源性；以 及，最佳者，含有至少75堿基對(duì)(bp)片段的DNA序列與表現(xiàn)在SEQ ID NO 3的1-2679位 置的orfF3DNA序列的對(duì)應(yīng)片段至少有80%的同源性。就上述所提供的同源性百分比而言，這片段通常為至少100堿基對(duì)(bp)，最好的 片段為至少200堿基對(duì)，更佳者的片段為至少400堿基對(duì)，最佳者的片段則為至少1500堿基對(duì)。使用這標(biāo)準(zhǔn)核苷酸-核苷酸BLAST計(jì)算機(jī)程序，在這描述的orfF4序列通常為含 有至少75堿基對(duì)(bp)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 5的1-4881位置的orfF4DNA 序列的對(duì)應(yīng)片段至少有60%的同源性；更佳者，含有至少75堿基對(duì)片段的DNA序列與表現(xiàn) 在SEQ ID NO 5的1-4881位置的orfF4DNA序列的對(duì)應(yīng)片段至少有70%的同源性；以及，最 佳者，含有至少75堿基對(duì)片段的DNA序列與表現(xiàn)在SEQ IDN0 5的1-4881位置的orfF4DNA 序列的對(duì)應(yīng)片段至少有80 %的同源性。就上述所提供的同源性百分比而言，這片段通常為至少100堿基對(duì)(bp)，最好的 片段為至少200堿基對(duì)，更佳者的片段為至少400堿基對(duì)，最佳者的片段則為至少1500堿基對(duì)。選擇性地，這同源/ 一致性是可適當(dāng)?shù)乩萌魏我阎挠?jì)算機(jī)程序工具來決定， 例如，在GCG程序軟件包中所提供的GAP。
使用GAP來進(jìn)行DNA序列比對(duì)是具有下列設(shè)定GAP創(chuàng)造罰分(creation penalty)為 5. 0，且 GAP 延伸罰分(extension penalty)為 0. 3 ；當(dāng)使用 GAP 時(shí)，關(guān)于 BLAST 程序所提供的同源性百分比亦可為較佳的同源性。氨基酸序列的同源性相似于核苷酸同源分析，在本文中，一較佳的計(jì)算機(jī)同源搜尋程序是為"標(biāo)準(zhǔn)蛋 白質(zhì)-蛋白質(zhì)BLAST[blastp]“搜尋，且在本中請(qǐng)案的中請(qǐng)日，在NCBI網(wǎng)站已具有統(tǒng)計(jì) 是；過濾性低復(fù)雜性；預(yù)期性10 ；序列長度3 ；矩陣:BL0SUM 62 ；間隔損失存在11延伸 1等設(shè)定。使用這標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)BLAST計(jì)算機(jī)程序，在這描述的prtH200序列是編碼 成一多肽(polyp印tide)，釋出細(xì)胞壁蛋白酶活性，包含有至少200氨基酸(amino acids, aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 2的1-1849位置的prtH200多肽序列的對(duì) 應(yīng)片段至少有40%的同源性；最好，這一編碼成多肽，釋出細(xì)胞壁蛋白酶活性，包含有至少 200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 2的1-1849位置的prtH200多 肽序列的對(duì)應(yīng)片段至少有50%的同源性；更佳者，這一編碼成多肽，釋出細(xì)胞壁蛋白酶活 性，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 2的1-1849位置 的prtH200多肽序列的對(duì)應(yīng)片段至少有65%的同源性；最佳者，這一編碼成多肽，釋出細(xì)胞 壁蛋白酶活性，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 2的 1-1849位置的prtH200多肽序列的對(duì)應(yīng)片段至少有80%的同源性。就上述所提供的同源性百分比而言，這片段通常為至少300氨基酸(aa)，最好的 片段為至少400氨基酸，更佳者的片段為至少800氨基酸，最佳者的片段則為至少1200氨 基酸。使用這標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)BLAST計(jì)算機(jī)程序，在這描述的orfF3序列是編碼成 一多肽(polyp印tide)，包含有至少200氨基酸(amino acids, aa)片段的DNA序列，其與 表現(xiàn)在SEQ ID NO 4的1-893位置的orfF3多肽序列的對(duì)應(yīng)片段至少有40%的同源性；最 好，這一編碼成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 4的1-893位置的orfF3多肽序列的對(duì)應(yīng)片段至少有50%的同源性；更佳者，這一編碼成多 肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 4的1-893位置 的orfF3多肽序列的對(duì)應(yīng)片段至少有65%的同源性；最佳者，這一編碼成多肽，包含有至少 200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 4的1-893位置的orfF3多肽序 列的對(duì)應(yīng)片段至少有80 %的同源性。就上述所提供的同源性百分比而言，這片段通常為至少300氨基酸(aa)，最好的 片段為至少400氨基酸，更佳者的片段為至少800氨基酸，最佳者的片段則為至少1200氨基酸。使用這標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)BLAST計(jì)算機(jī)程序，在這描述的orfF4序列是編碼成 一多肽，包含有至少200氨基酸(amino acids, aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQID NO 6的1-1627位置的orfF4多肽序列的對(duì)應(yīng)片段至少有40%的同源性；最好，這一編碼成多 肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID N06的1-1627位置 的orfF4多肽序列的對(duì)應(yīng)片段至少有50%的同源性；更佳者，這一編碼成多肽，包含有至少 200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 6的1-1627位置的orfF4多肽序列的對(duì)應(yīng)片段至少有65%的同源性；最佳者，這一編碼成多肽，包含有至少200氨基酸(aa) 片段的DNA序列，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 6的1-1627位置的orfF4多肽序列的對(duì)應(yīng)片段至 少有80%的同源性。就上述所提供的同源性百分比而言，這片段通常為至少300氨基酸(aa)，最好的 片段為至少400氨基酸，更佳者的片段為至少800氨基酸，最佳者的片段則為至少1200氨基酸。選擇性地，這同源性是可適當(dāng)?shù)乩萌魏我阎挠?jì)算機(jī)程序工具來決定，例如，在 GCG程序軟件包中所提供的GAP。使用GAP來進(jìn)行DNA序列比對(duì)是具有下列設(shè)定GAP創(chuàng)造罰分為3. 0，且GAP延伸 罰分為0. 1 ；當(dāng)使用GAP時(shí)，關(guān)于BLAST程序所提供的同源性百分比亦可為較佳的同源性。雜交反應(yīng)(Hybridisation)這雜交反應(yīng)根據(jù)前文所預(yù)期是包含一同功DNA序列(analogous DNA sequence), 其是雜交至一雙鏈DNA探針。在一核苷酸探針與一同源DNA或RNA序列的間決定雜交反應(yīng) 為低嚴(yán)格性、中嚴(yán)格性或高嚴(yán)格性的適當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件是包含，將含有欲雜交DNA片段或RNA的 濾膜(fliter)預(yù)浸(pre-soaking)在 5x SSC(氯化鈉 / 檸檬酸鈉，Sambrooket al. 1989) 溶液中 10 分鐘，并將濾膜置于 5x SSC、5x Denhard，s 溶液(Sambrook et al. 1989) ,0. 5% SDS及l(fā)OOmug/ml超聲波處理變性的鮭魚精DNA(Sambrook et al. 1989)的溶液中進(jìn)行預(yù)雜 交(prehybridization),隨后在含有 10ng/ml 隨機(jī)弓|物(Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132 :6_13)、P-dCTP-標(biāo)記(特定活性> 1 X lOcpm/mug)探針的相 同溶液中雜交12小時(shí)，且其溫度為45°C。然后這濾膜在2x SSC、0.5% SDS溶液下清洗二 次30分鐘，其溫度為至少55°C (低嚴(yán)格性)，最好的溫度為至少60°C (中嚴(yán)格性)，仍為較 佳的溫度為至少65°C (中/高嚴(yán)格性)，更佳者的溫度為至少70°C (高嚴(yán)格性)，以及最佳 者的溫度為至少75°C (很高嚴(yán)格性)。利用用X光片(X-ray film)檢測在上述條件下的寡核苷酸探針雜交的分子。


圖1為以濃度3 (含有濃縮14. 3倍的固體乳漿顆粒的乳漿混合物)或安慰劑治療 的動(dòng)物的心率測量示意圖，每一數(shù)據(jù)點(diǎn)代表8個(gè)動(dòng)物的平均值，其中這些動(dòng)物的活性周期 是符合無光線的周期，如以黑色條表示的周期。圖2為在動(dòng)物接受含有固體乳漿成份的乳漿混合物后，于周期12-15小時(shí)的動(dòng)物 心率降低示意圖，這固體乳漿成份是分別經(jīng)濃縮2、6、14. 3及21次，相對(duì)于在牛奶發(fā)酵后取 得的乳漿中所含有的固體成份數(shù)量。這些動(dòng)物是以胃管喂食法給予乳漿產(chǎn)品，即利用一胃 管喂食。(0)表示安慰劑，動(dòng)物心率的測定是如例1所述，且與未經(jīng)治療動(dòng)物的心率相比較。實(shí)施例實(shí)施例1 心率降低特性的體內(nèi)(in vivo)試驗(yàn)材料與方法菌禾中與培養(yǎng)(Strains and cultivation)將菌種涂布在耐甲氧西林葡萄球菌瓊脂(MRS agar)上，并在厭氧性、37°C的環(huán)境 下培養(yǎng)48小時(shí)，選擇單一菌落(colony)，再接種至MRS培養(yǎng)液中，并于37°C下過夜培養(yǎng)。準(zhǔn)
19備來自隔夜的貯存培養(yǎng)菌，將其貯存在-80°C的20%甘油中；再將這一菌種置于牛奶中預(yù) 培養(yǎng)過夜，以(v/v)活化到新鮮牛奶中準(zhǔn)備發(fā)酵。樣品的制備乳漿樣品1將含有(v/v)單一菌落菌種的牛奶(蛋白質(zhì)含量9.5%)發(fā)酵16小時(shí)，這發(fā)酵 產(chǎn)品先經(jīng)過離心，將顆粒狀物去除，且乳漿是通過0. 45毫米濾膜進(jìn)行過濾，并冷凍干燥的。 第二次發(fā)酵，在與第一次發(fā)酵的相同條件下進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)離心后取得乳漿部份，其顆粒狀物 是已去除，并將乳漿通過0. 45毫米濾膜進(jìn)行過濾并冷凍的。在喂食大鼠的前，這乳漿是用 來溶解冷凍干燥乳漿粉末并濃縮21倍。溶解在乳漿中的冷凍干燥發(fā)酵牛奶樣品2將含有(v/v)單菌落菌種的牛奶(蛋白質(zhì)含量9.5%)發(fā)酵16小時(shí)，且所有 產(chǎn)品皆為冷凍干燥。第二次發(fā)酵，在與第一次發(fā)酵的相同條件下進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)離心，以去除 顆粒狀物，并將乳漿通過0. 45厘米濾膜進(jìn)行過濾并冷凍的。在喂食大鼠的前，這乳漿是用 來溶解冷凍干燥乳漿粉末并濃縮5倍。溶解在牛奶中的冷凍干燥發(fā)酵牛奶樣品3將含有(v/v)單菌落菌種的牛奶(蛋白質(zhì)含量9.5%)發(fā)酵16小時(shí)，且所有 產(chǎn)品皆為冷凍干燥。在喂食大鼠的前，這牛奶(蛋白質(zhì)含量9. 5% )是用來溶解冷凍干燥乳 漿粉末并因此濃縮5倍。隔夜牛奶發(fā)酵產(chǎn)品樣品4將含有(v/v)單菌落菌種的牛奶(蛋白質(zhì)含量9. 5% )發(fā)酵16小時(shí)。經(jīng)熱處理的隔夜牛奶發(fā)酵產(chǎn)品樣品5將含有(v/v)單菌落菌種的牛奶(蛋白質(zhì)含量9. 5% )發(fā)酵16小時(shí)。自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneous Hypertensive Rats)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)是來自于 IFFA CREDO (a Charles River company)，里
昂，法國。每一次治療是在9:15至9:30的間以胃管灌食法實(shí)施，且每一只動(dòng)物接受總體積 2. 5毫升的劑量。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分成三組別第1組(n = 16)接受治療1 (牛奶；n = 16)第2組(n = 12)接受連續(xù)治療，每一次實(shí)施是間隔3天的間隔組別(1)安慰劑(牛奶)(2)樣品1 (懸浮在乳漿中的冷凍干燥乳漿，并濃縮21倍)(3)樣品2 (懸浮在乳漿中的冷凍干燥發(fā)酵牛奶，并濃縮5倍)(4)樣品3 (懸浮在中性pH值牛奶中的冷凍干燥發(fā)酵牛奶，并濃縮5倍)(5)樣品4(只是發(fā)酵牛奶產(chǎn)品)(6)樣品5 (在發(fā)酵后經(jīng)過加熱處理的發(fā)酵牛奶)(7)樣品6 (未經(jīng)過發(fā)酵，但具有乳酸菌的牛奶)在所有SHR進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的前，先使其適應(yīng)動(dòng)物環(huán)境9星期，這外，在進(jìn)行第一次胃管灌食法的前，所有動(dòng)物須先習(xí)慣胃管灌食法，并測量3天的心臟收縮壓。研究參數(shù)(Investigated parameters)在經(jīng)胃管喂食24小時(shí)后，利用遙測技術(shù)(telemetry, Data Sciences Int.)測定 清醒的SHR在不同時(shí)間點(diǎn)的心臟收縮壓及心率。簡言的，在喂食前24小時(shí)及喂食后48小時(shí)的間，每15分鐘記錄其心臟收縮壓、心 臟舒張壓及心率的平均值(超過一分鐘周期)。藉由這些追蹤記錄，計(jì)算每一組別的心臟收縮壓、心臟舒張壓以及心率的24小時(shí) 平均值。再者，心臟收縮壓與心臟舒張壓的變動(dòng)是由每個(gè)樣本與未經(jīng)治療的數(shù)值相比較， 是計(jì)算喂食24小時(shí)，且在喂食后的時(shí)間3至6、12至15及21至24小時(shí)周期。統(tǒng)計(jì)(Statistics)所有結(jié)果皆以平均值士平均標(biāo)準(zhǔn)誤差來表示，在未經(jīng)治療數(shù)值與每一本體經(jīng)胃 管喂食后取得的值間的差異是使用配對(duì)student，的t-試驗(yàn)(paired student's t-test) 來計(jì)算統(tǒng)計(jì)，且這計(jì)算是利用計(jì)算機(jī)程序SISTAT 8. 0來進(jìn)行。MM在表1中是顯示測定心率的變動(dòng)。表1胃管喂食后的心率(心跳次數(shù)/分鐘，beats/min) * :p < 0. 05vs.未經(jīng)治療 未經(jīng)治療1及未經(jīng)治療2是分別作為研究編號(hào)1與研究編號(hào)2的控制組，未經(jīng)治療1 是作為樣品1的安慰劑且未經(jīng)治療2則是作為其它樣品的安慰劑。由于本研究是分別以二 種不同的體內(nèi)研究來進(jìn)行，故在這是具有2種安慰劑。上述的結(jié)果證明，濃縮21倍的(例1)濃縮的乳漿產(chǎn)品是具有最強(qiáng)的心率降低特性。這些結(jié)果亦證明，無須濃縮發(fā)酵牛奶產(chǎn)品來取得一顯著的心率降低功效。樣品4 和樣品5是為發(fā)酵整晚的發(fā)酵牛奶產(chǎn)品，且其是具有心率降低功效，然而，這心率降低功效 是與產(chǎn)品的濃縮倍數(shù)成比例關(guān)系。
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顯然地，包含多肽或其它活性成份的產(chǎn)品的乳漿部份是為心率降低功效的決定因 素，并可在這產(chǎn)品中觀察到一劑量_心率降低功效。樣品3是為懸浮在中性pH值牛奶中的冷凍干燥發(fā)酵牛奶，可降低心率。證明在這 描述的發(fā)酵產(chǎn)品是具有廣泛的應(yīng)用，這是因?yàn)樗扇芙庠诓煌后w中，以得到所需的最終 的適當(dāng)使用。不同PH值并不影響產(chǎn)品的心率降低活性。發(fā)酵后經(jīng)熱處理的樣品5也可降低心率，一般來說，所有在這樣品內(nèi)的細(xì)菌皆被 殺死，因此，即證明在最終產(chǎn)品中并不需要活的細(xì)菌。樣品6是沒有經(jīng)過發(fā)酵，但其含有活的細(xì)菌，其無法降低心率，故證明發(fā)酵步驟為 必須的。實(shí)施例2 :PCR擴(kuò)增反應(yīng)模板DNA(template DNA)是通過酚-氯仿(phenol-chloroform)抽提法取得的， 如前面所述(Marmur(1961, Journal of Molecular Biology，3，208-218)。最終制備的是 在TE緩沖液+RNA酶中的基因組模板DNA。這PCR反應(yīng)的制備如下所述(1)1.0 Pi 的模板 DNA;10 u 1 的正向引物(forward primer) (5pmol/u 1)；1. 0 li 1 的反向引物(reverse primer) (5pmol/li 1)；1. 0 ii 1、2. 5mM 的 dNTP (dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP 的混合物)；5. 0u lMg 緩沖液(20mM MgS04)；0. 5u 1DNA 聚合酶(Pwo, 100U)；以及10. 5 U 1 7jC (H20)。(2) PCR擴(kuò)增的熱程序是為30個(gè)循環(huán)，包括在94°C下1分鐘，在50°C下90秒(當(dāng) 引物Tm在55°C左右)、55°C下90秒(當(dāng)引物Tm在62°C左右)、45°C下90秒(當(dāng)引物Tm 在50°C左右)以及在72°C下1分鐘。在30個(gè)循環(huán)完成后，這些樣品冷卻到4°C。(3)這PCR產(chǎn)品是跑在60V的1.5%瓊脂糖膠(agarose gel)中，在紫外光下自 瓊脂糖膠中分離，并根據(jù)制造商操作指南(Qiagen，Cat. No. 28704)來使用器材QIAquick GelExtraction Kit 進(jìn)行純化。實(shí)施例3 蛋白質(zhì)水解(ACE)活性分析保存菌種的制備(stock culture)乳酸桿菌(Lactobacillus)菌種接種在耐甲氧西林葡萄球菌瓊脂(MRS agar)上， 并在厭氧性(anaerobically)、37°C的環(huán)境下培養(yǎng)48小時(shí)，選擇單一菌落(colony)，再接 種至MRS培養(yǎng)液中，并于37°C下培養(yǎng)過夜。乳酸桿菌種是形成在M17瓊脂上，并在好氧性 (aerobically)、30°C的環(huán)境下培養(yǎng)48小時(shí)，選擇單一菌落，再接種至M17培養(yǎng)液中，并于 30°C下培養(yǎng)過夜。從上述過夜培養(yǎng)物里得到保存菌種，在20%甘油中貯存在-80°C。發(fā)酵牛奶的制備與多肽或其它活性成份的提取在以實(shí)施例1 (1% v/v)的隔夜貯存培養(yǎng)菌接種至200毫升新鮮牛奶中進(jìn)行發(fā)酵， 并根據(jù)使用的菌種不同判斷其溫度是整夜保持在37°C或30°C。在該新鮮牛奶中，多肽或其它活性成份的提取是可藉由使用下列程序來得到-在室溫下進(jìn)行10分鐘、3000g的離心。
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-分離出上清液，并以NaOH調(diào)整酸堿值至pH8. 3 (ACE活性試驗(yàn)的最佳pH值)。-在室溫下對(duì)取得的上清液進(jìn)行10分鐘、3000g的離心。-分離出上清液(乳漿)，其是包含多肽或其它活性成份。-利用Lowry 試驗(yàn)(Lowry et al, 1951. J. Biol. Chem, 193 :265_275)，測定在乳菜
中的多肽濃度(每毫升乳漿中含有的多肽毫克數(shù))。乳漿是直接以ACE分析并在-20°C下冷凍的，且這乳漿包含多肽或其它活性成份， 即是實(shí)施例3的"多肽溶液"。ACE活性分析發(fā)酵牛奶中的多肽是進(jìn)行體外(in vitro) ACE活性試驗(yàn)。多肽濃度為DL 50 (mg/ ml)，其是抑制50 %的ACE活性，這值越低，發(fā)酵牛奶就具有越好的抗高血壓功效。提取出的 多肽或其它活性成份是以下列的程序來進(jìn)行檢測這試驗(yàn)分析主要是ACE 降解一 HHL(hippuryl-L-histidyl-L-leucine)基質(zhì)，并加 入染色劑(color reagent)進(jìn)行染色。若存在有多肽或其它活性成份，這多肽或其它活性 成份是抑制ACE，并有較少的HHL基質(zhì)降解，亦即在加入染色劑的后，形成有較少的顏色。溶液制備培養(yǎng)緩沖液(Incubationbuffer) :188mmole/l 硼酸，pH值為 8. 3，及 1. 375mmole/ 1的氯化鉀。(將2. 91克硼酸與25. 63克氯化鉀溶解在200ml的蒸餾水中，以lmol/1的氫 氧化鉀(potassium hydroxide)將pH值調(diào)整為8. 3，并以250毫升蒸餾水稀釋的；貯存在 室溫下)?；|(zhì)溶液(Substratesolution) 5. 8mmol/l 的 HHL。(將 250 毫克的 HHL 溶解在 90毫升的培養(yǎng)緩沖液中，并以相同緩沖液補(bǔ)充到100毫升，這基質(zhì)溶液是可使用至少2星 期)。終止溶液(Stopsolution) :100mmol/l 的 HEPES，pH倌為 9，2. 5mmol 的 EDTA。(將 23. 83克的HEPES與0. 93克的EDTA溶解在800毫升的蒸餾水中，以lmol/1的氫氧化鈉將 pH值調(diào)整為9，并以蒸餾水稀釋到1公升；貯存在室溫下)。染餼劑136mmol/l的三聚氯氰(cyanuric chloride)在 1，4_ 二氧陸圜(1， 4-dioxane)中。(將12. 50毫克的三聚氯氰溶解在400毫升的1，4_ 二氧陸圜中，并補(bǔ)加1， 4- 二氧陸圜至500毫升，貯存在室溫下及暗棕色玻璃瓶內(nèi))。分析(所有溶液先冷卻至室溫)-制造一經(jīng)由培養(yǎng)緩沖液連續(xù)稀釋的多肽溶液，這連續(xù)6次稀釋是將未稀釋的多 肽溶液稀釋至空白(只有培養(yǎng)緩沖液)。-對(duì)每次稀釋而言，放置10u 1的多肽溶液、40 u 1的基質(zhì)(HHL)溶液(25g/l)以 及25iU的ACE(0. 25單位/毫升)于一玻璃管中。-陽性對(duì)照包括2.5 ill的ACE、10 u 1的培養(yǎng)緩沖液以及40 u 1的基質(zhì)(HHL)溶液。-陰性對(duì)照包括12u 1的培養(yǎng)緩沖液以及40 u 1的基質(zhì)(HHL)溶液。-在37°C下培養(yǎng)1小時(shí)。-加入300u 1的終止溶液停止反應(yīng)，隨后以150 ill的染色劑混合。-沉積5分鐘，并在室溫下以3300g離心30分鐘，以去除變質(zhì)的蛋白質(zhì)和過量的三
23
-轉(zhuǎn)移每一樣品的300u 1上清液至微量滴定盤(microtiter plate)的孔洞中。-在405nm下一水作對(duì)照進(jìn)行讀取。這SCE抑制百分比是以下列公式表示的ACE抑制活性=(0D 405nm陽性對(duì)照-0D 405nm樣品)/ (0D 405nm陽性對(duì) 照-0D405nm陰性對(duì)照)每次稀釋是具有其所屬的ACE抑制百分比值，提供一曲線表示ACE抑制百分比與 乳漿的多肽濃度的函數(shù)。DL 50 (具50%抑制活性的多肽濃度)的獲得是藉由讀取位在該 曲線與軸上對(duì)應(yīng)的50% ACE抑制點(diǎn)的交叉點(diǎn)的多肽濃度而得到。實(shí)施例4 劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)為了更進(jìn)一步證實(shí)在實(shí)施例1的結(jié)果，一劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行是藉由調(diào)控含有不 同的量來自發(fā)酵牛奶的乳漿中分離的發(fā)酵奶的冷凍干燥乳漿給自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)。一般而言，使用的材料、方法與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是與實(shí)施例1所描述的內(nèi)容相同。簡言的，將具有瑞士乳桿菌品種CHCC5951 (DSM 14998)的牛奶接種1 % (v/v)菌種 發(fā)酵16小時(shí)，這發(fā)酵牛奶先經(jīng)過離心，將顆粒狀物去除，并將乳漿冷凍干燥。在與第一次發(fā) 酵的相同條件下進(jìn)行第二次發(fā)酵，經(jīng)離心，再將顆粒狀物去除，并將乳漿放置在4°C下。這乳 漿是用來溶解冷凍干燥乳漿粉末，以產(chǎn)生包含固體乳漿成份的混合物，其是經(jīng)2、6及14. 3 次的濃縮，相對(duì)于在第二次發(fā)酵中獲得的乳漿固體成份數(shù)量。在喂食這混合物給大鼠之前 很短時(shí)間進(jìn)行溶解的最后一步。如實(shí)施例1所示，末發(fā)酵牛奶是作為安慰劑。以最低濃度的劑量開始，在三組分開試驗(yàn)-周期的相同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上進(jìn)行試驗(yàn)，每 一試驗(yàn)-周期的間是以三天的間隔分開的，這期間的動(dòng)物并不接受發(fā)酵乳漿產(chǎn)品，以排除 前次劑量的影響。上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在表2的表格中。表2胃管喂食后的心率(beats/min)
組別周期相對(duì)于安慰劑的變動(dòng)0-243-612-1521-240-24 3-6 12-15 2124未經(jīng)治療306 ±2265 ±5337 ±5273 ±2安慰劑304 ±2268±2333±3278 + 4-2 +3 - 4+5安慰劑314±11282±12335±12295 ±14濃度1302 ±7278±10324±7274 ±7-12 -4 -11-21安慰劑314±9278 + 8346 ±9288 ±8濃度2309 + 9287±10334±9289±11-5 +8 -12+ 1安慰劑311±9278 土 9337±11279 ±8濃度3297 + 9279±15314±7277±10-14 +1 -24-2 注未經(jīng)治療大鼠是指未接受牛奶及乳漿產(chǎn)品者，安慰劑是非發(fā)酵牛奶，濃度1、2及3分別為包含有固體乳漿成份的濃縮2、6及14. 3次的乳漿混合物，且動(dòng)物的活性周期是 符合無光線周期，亦即時(shí)間周期9至21。在第3圖中是顯示一濃度3(14. 3倍濃縮)的完全周期。另外，冷凍干燥乳漿粉末是產(chǎn)生包含固體乳漿成份的混合物，其是經(jīng)21次的濃 縮，相對(duì)于在第二次發(fā)酵中獲得的乳漿固體成份數(shù)量。將濃縮2、6、14. 3次以及21次的的 乳漿產(chǎn)品喂食給動(dòng)物的結(jié)果是如第2圖所示。這結(jié)果顯示濃縮至21倍的乳漿產(chǎn)品對(duì)心率作用有一個(gè)明顯的劑量依賴效應(yīng)。乳 漿產(chǎn)品的劑量越高，具有越大的心率降低效應(yīng)。固定或漸進(jìn)的水平線并未達(dá)到，表示，包含 更高濃度活性成份的混合物可預(yù)期到具有更高的降低心率功效。實(shí)施例5 降低在高活性期間的心率變動(dòng)在這些動(dòng)物的活性周期間，其心率是增加的。本研究的動(dòng)物活性周期幾乎與無光 線周期相符合，即第1圖所示的黑色條狀的周期。然而，由觀察第1圖結(jié)果可判斷，未經(jīng)治療 動(dòng)物相對(duì)于以14. 3倍濃縮發(fā)酵乳漿產(chǎn)品治療的動(dòng)物而言，具有較大的心率以及心率變動(dòng)。為了對(duì)心率變動(dòng)進(jìn)行定量，估計(jì)在時(shí)間周期12及15小時(shí)的間所觀察到的心率值 變動(dòng)。標(biāo)準(zhǔn)誤差(standard deviation)是用以估計(jì)已經(jīng)治療及未經(jīng)治療動(dòng)物，且這估計(jì)是 利用在實(shí)施例1中所描述的SISTAT 8.0程序來進(jìn)行，并用來計(jì)算變動(dòng)值((標(biāo)準(zhǔn)誤差)2 = 變動(dòng)值)。用于已治療動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)誤差是估計(jì)為5. 9，則其相對(duì)的變動(dòng)值為(5. 9)2 = 34. 8。用于未經(jīng)治療動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)誤差是估計(jì)為10. 4，則其相對(duì)的變動(dòng)值為(10. 4)2 = 108.2。假定主要數(shù)據(jù)是為正常分布的，34. 8的變動(dòng)值的統(tǒng)計(jì)意義與位于95%層級(jí)的 108. 2變動(dòng)值有所不同。因此，相對(duì)于以14. 3倍濃縮發(fā)酵乳漿產(chǎn)品治療的動(dòng)物的心率變動(dòng)而言，是可推斷 出在已治療動(dòng)物中的活性周期的心率變動(dòng)是相當(dāng)?shù)卮??？傊?，心率變?dòng)是藉由以瑞上乳桿菌品種CHCC5951 (DSM 14998)發(fā)酵的乳漿產(chǎn) 品來使之穩(wěn)定，這一點(diǎn)可以成為這產(chǎn)品的重要特征，因?yàn)樵谝粚?shí)驗(yàn)性兔模型(Zaza etal 2001)中觀察到心率變化與死亡率的關(guān)連性，以及特別是在緊張?zhí)幘诚聦掖斡^察到心率的變動(dòng)。實(shí)施例6 以瑞士乳桿菌品種CHCC5951發(fā)酵的乳漿產(chǎn)品與以不同菌種發(fā)酵的類似 商業(yè)性產(chǎn)品間的比較這實(shí)施例的目的是用來比較以商業(yè)性乳酸菌發(fā)酵的乳漿產(chǎn)品，表明具有以瑞士乳 桿菌品種CHCC5951 (DSM 14998)發(fā)酵的產(chǎn)品的血壓還原特性。這二種產(chǎn)品在血壓與心率功效的檢測，是將這二混合物提供給Wistar大鼠，并測 量麻醉動(dòng)物的心臟收縮壓、心臟舒張壓以及心率。假如沒有特別提及，材料與方法是與實(shí)施例1所描述的內(nèi)容相同。簡言之，將含有瑞士乳桿菌品種CHCC5951 (DSM 14998)的牛奶以(v/v)接種發(fā) 酵16小時(shí)，且產(chǎn)生的產(chǎn)品是經(jīng)冷凍干燥而得到冷凍干燥牛奶粉末。第二次發(fā)酵，在與第一 次發(fā)酵的相同條件下進(jìn)行發(fā)酵及離心，且其顆粒狀物是已去除，并將乳漿通過0. 45厘米濾 膜進(jìn)行過濾并冷凍的；在喂食大鼠之前很短時(shí)間，冷凍干燥牛奶粉末才溶解在乳漿中。溶解
25粉末的乳漿體積相當(dāng)于得到這些粉末的乳將體積的1/5 (如4. 28克的粉末溶解在30毫升 的乳漿中)。本例中所指的混合物是5倍濃度的。這混合物是在9:15時(shí)至9:30時(shí)的間提 供給整夜血壓正常的Wistar大鼠上，并以每公斤7. 5毫升的x5混合物的劑量進(jìn)行胃管灌 食法；再口服(oral administration)之后，測量麻醉動(dòng)物的動(dòng)脈血壓值與心率值，以計(jì)算 14:30時(shí)至16:30時(shí)之間的混合物的功效。得到的結(jié)果如表3所示。表3兩種不同發(fā)酵產(chǎn)品的血壓與心率功效 經(jīng)胃管喂食后5-7小時(shí)，在這三種群組的心臟收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈血壓及心 率的值(平均士 SEM)。*表示在已治療與未經(jīng)治療大鼠間的p< 0.05層級(jí)的顯著差異。在以Tukey試驗(yàn) 倍數(shù)比較后，再使用AN0VA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過這些數(shù)據(jù)，可以推斷出商業(yè)性產(chǎn)品與CHCC5951發(fā)酵產(chǎn)品皆可降低血壓，并可 達(dá)到相同的程度。然而，表3中的數(shù)據(jù)意外地顯示，只有CHCC5951發(fā)酵產(chǎn)品可有效降低心率。以上所述的實(shí)施例僅是為說明本發(fā)明的技術(shù)思想及特點(diǎn)，其目的在使熟習(xí)這項(xiàng)技 藝的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，不能以此限定本發(fā)明的專利范圍，即凡是依 本發(fā)明所揭示的精神所作的均等變化或修飾，仍應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。序列表<110> 科.漢森有限公司(Chr. Hansen A/S)<120> 具有心率降低特性的混合物(Composition with heart rate reducing properties)<130>P1040PC00<160>18<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>5550<212>DNA<213> 瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)
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權(quán)利要求
一種混合物用于生產(chǎn)降低哺乳動(dòng)物心率的一種產(chǎn)品，所述混合物通過包括利用乳酸菌發(fā)酵包括動(dòng)物乳汁或植物蛋白質(zhì)的食物材料以得到發(fā)酵食物材料的過程而制得，所述發(fā)酵食物材料包含具有心率降低特性的活性成份。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述發(fā)酵食物材料包含多肽或其它具有心率降低特 性的活性成份。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中所述產(chǎn)品是一種食品及飼料。
4.如前述權(quán)利要求中任何之一所述的應(yīng)用，其中所述心率降低是用來治療或緩和冠狀 動(dòng)脈疾病(CAD)或冠狀心臟病(CHD)，諸如心絞痛、高血壓、動(dòng)脈硬化、中風(fēng)、心肌梗塞、大 腦血管梗塞，以及血管成形術(shù)后再狹窄、心律不齊、心跳節(jié)律不整、充血性心臟哀竭(CHF)、 主動(dòng)脈竇逆流、慢性腎哀竭、脂肪代謝障礙、脂蛋白代謝障礙。
5.如前述權(quán)利要求中任何之一所述的應(yīng)用，其中所述治療產(chǎn)生心率變動(dòng)的降低。
6.如前述權(quán)利要求中任何之一所述的應(yīng)用，其中所述發(fā)酵食物材料經(jīng)進(jìn)一步處理，以 純化或濃縮所述具有心率降低特性的多肽或其它活性成份，其包括下列步驟(1)制備一發(fā)酵食物材料，其是根據(jù)一制法來制備所述具有心率降低特性的活性成份；(2)對(duì)步驟(1)所述發(fā)酵食物材料進(jìn)行進(jìn)一步處理，以純化或濃縮所述具有心率降低 特性的活性成份；以及(3)以適當(dāng)方式包裝所述發(fā)酵食物材料，以得到所述產(chǎn)品。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中步驟(2)所述的濃縮是以離心機(jī)進(jìn)行，并得到含有所 述活性成份的上清液。
8.如權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其中所述食物材料為乳汁，所述產(chǎn)品是為乳漿。
9.如前述權(quán)利要求中任何之一所述的應(yīng)用，其中所述的乳酸菌選自乳酸桿 菌屬(genusLactobacillus)、乳球菌屬(genus Lactococcus)、鏈球菌屬(genus Streptococcus)、明串珠球菌屬(genus Leuconostoc)、雙歧桿菌屬(genus Bifidobacterium)以及片球菌屬(genusPediococcus)所組成的群組。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中所述乳酸桿菌屬的乳酸菌一種瑞士乳桿菌 (Lactobacillus helveticus)0
11.如前述權(quán)利要求中任何之一所述的應(yīng)用，其中所述的乳酸菌包含一基因序列編碼 成一細(xì)胞壁蛋白酶(稱為prtH200)，其中所述基因序列定義為prtH200是編碼表現(xiàn)出細(xì)胞 壁蛋白酶活性的一種酶的一段DNA序列，該DNA序列是選自下列所組成的群組(a)表現(xiàn)在SEQID NO 1的1-5550的位置的DNA序列；(b)一 DNA序列，其包含一至少75堿基對(duì)(bp)的片段，其與(a)所定義的DNA序列的 對(duì)應(yīng)片段至少有50%的同源性；(c)一 DNA序列，其編碼一多肽，釋出細(xì)胞壁蛋白酶活性，包含至少200氨基酸(aa)的 片段，其與表現(xiàn)在SEQ ID NO 2的1-1849位置的多肽序列的對(duì)應(yīng)片段至少有30%的同源 性；(d)— DNA序列，其與包含表現(xiàn)在SEQ ID NO 1的1-5550位置的DNA序列的雙股DNA 探針在低嚴(yán)格性下進(jìn)行雜交；以及(e)一 DNA序列，其為(a)、(b)、(c)或(d)中說明的DNA序列的片段。
12.如前述權(quán)利要求中任何之一所述的應(yīng)用，其中所述的乳酸菌為一具有登記號(hào)為 DSM 14998的瑞士乳桿菌種或其突變體。
13.一種發(fā)酵食物材料，其具有降低哺乳動(dòng)物心率的特性，并包含用至少一種乳酸菌種 發(fā)酵食物材料而產(chǎn)生的活性物質(zhì)。
14.如權(quán)利要求13所述的發(fā)酵食物材料，其中所述乳酸菌是為選自乳酸桿菌屬、乳球 菌屬、鏈球菌屬、明串珠球菌屬、雙歧桿菌屬以及片球菌屬所組成的群組中的一種或多種乳 酸菌。
15.如權(quán)利要求13或14所述的發(fā)酵食物材料，其中所述乳酸桿菌中的至少一種是一種 瑞士乳桿菌。
16.如權(quán)利要求13或15所述的發(fā)酵食物材料，其中所述乳酸菌中的至少一種是登記號(hào) 為DSM 14998的一種瑞士乳桿菌種或其突變體。
17.一種發(fā)酵食物材料，其具有降低哺乳動(dòng)物心率的特性，并包含死的或活的瑞士乳桿 菌種DSM 14998或其突變體。
18.自前述權(quán)利要求中任何之一所述的發(fā)酵食物材料分離出的降低心率的活性成份。
19.如前述權(quán)利要求13-17中任何之一所述的發(fā)酵食物材料用于生產(chǎn)治療或緩和冠狀 動(dòng)脈疾病(CAD)或冠狀心臟病(CHD)，例如心絞痛、高血壓、動(dòng)脈硬化、中風(fēng)、心肌梗塞、大 腦血管梗塞，以及血管成形術(shù)后再狹窄、心律不齊、心跳節(jié)律不整、充血性心臟衰竭(CHF)、 主動(dòng)脈竇逆流、慢性腎衰竭、脂肪代謝障礙、脂蛋白代謝障礙的藥物。
20.如權(quán)利要求18所述的發(fā)酵食物材料中分離出的降低心率的活性成份，用于生產(chǎn)治 療或緩和冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)或冠狀心臟病(CHD)，例如心絞痛、高血壓、動(dòng)脈硬化、中風(fēng)、 心肌梗塞、大腦血管梗塞，以及血管成形術(shù)后再狹窄、心律不齊、心跳節(jié)律不整、充血性心臟 衰竭(CHF)、主動(dòng)脈竇逆流、慢性腎衰竭、脂肪代謝障礙、脂蛋白代謝障礙的藥物。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于一種具有心率降低特性的混合物，它是通過發(fā)酵過程得到的。發(fā)酵過程包括利用乳酸菌發(fā)酵包含動(dòng)物乳汁或植物蛋白質(zhì)的食物材料，以得到發(fā)酵的食物材料，這種發(fā)酵食物材料包含具有降低心率特性的活性成份，以制造出可降低哺乳動(dòng)物的心率及/或心率變動(dòng)的產(chǎn)品。
文檔編號(hào)A61K38/00GK101890046SQ200910000409
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2004年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月7日
發(fā)明者班奈迪特·佛林巴爾德 申請(qǐng)人:科·漢森有限公司