專利名稱：液相芯片檢測大腸桿菌o157的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫技術(shù)及食品衛(wèi)生檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大腸桿菌0157 :H7是腸出血性大腸埃希氏菌的主要血清型，是重要的人類致病菌，可引起出血性腸炎(HC)、溶血性尿毒綜合癥(HUS)、血栓性血小板減少性紫癜( TTP)及死亡等。由于腸出血性大腸埃希菌(enterohemorrhagic萬.co/i, EHEC)0157:H7 對(duì)人的致病力強(qiáng)，近年來世界范圍內(nèi)由該菌引起的不同規(guī)模、不同區(qū)域的爆發(fā)流行不斷發(fā)生，發(fā)病呈明顯上升趨勢，已引起世界各國的高度重視。該菌主要通過食物、水以及直接接觸感染，動(dòng)物是其主要的宿主，因此今年來加強(qiáng)對(duì)進(jìn)口冷凍肉類、禽類及其制品的檢驗(yàn)力度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種采用液相芯片技術(shù)用于檢測大腸桿菌0157的方法，以便實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌0157的快速檢測。本發(fā)明由微球、捕獲抗體、檢測抗體、生物素標(biāo)記的抗抗體、鏈霉親和素-藻紅蛋白組成，其中微球是羧基化的21號(hào)微球、捕獲抗體是大腸桿菌0157單克隆抗體、檢測抗體是大腸桿菌0157的多克隆抗體、生物素標(biāo)記的抗抗體是經(jīng)活化的生物素標(biāo)記的羊抗兔 IgG，捕獲抗體和檢測抗體均能特異與大腸桿菌0157結(jié)合，以紅色激光激發(fā)其球型基質(zhì)上的紅色分類熒光，以綠色激光激發(fā)與生物素標(biāo)記的抗抗體相結(jié)合的藻紅蛋白，測定球型基質(zhì)上結(jié)合的報(bào)告熒光分子的數(shù)量，用于間接確定球型基質(zhì)上結(jié)合大腸桿菌0157的數(shù)量；
液相芯片的制備捕獲抗體與微球偶聯(lián)形成偶聯(lián)體
取微球原液室溫恢復(fù)30min，用超聲波清洗機(jī)進(jìn)行超聲lOmin，漩渦震蕩30s，使微球均勻分布，用無菌水分別配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200ul的微球原液置于1. 5ml的離心管中，14000 rpm，離心5min，取出后棄上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化緩沖液，混勻后，用鋁箔紙包好，置于37°C搖床120 rpm，20min，然后14000 rpm，離心 5min,小心移去上清，加入500ul稀釋至250ug/ml的捕獲抗體，重懸混勻，置于37°C搖床120 rpm,孵育池，取出后離心棄上清，用500ul的PBS進(jìn)行洗滌，洗滌后加入500ul 1 % BSA的 PBS溶液，重懸微球，37°C水浴搖床孵育兩個(gè)小時(shí)進(jìn)行封閉，封閉后4°C保存； 液相芯片檢測大腸桿菌0157的方法
將已偶聯(lián)的微球混合液室溫恢復(fù)lOmin，漩渦振蕩器震蕩約3min，取約5000個(gè)微球， 加入IO8 CFU/ml的大腸桿菌015710ul，用PBS-TBN補(bǔ)足體積到lOOul，置于37 °C搖床 120rpm，lh，取出后離心棄上清，用200ul PBS-TBN洗兩次，加入已稀釋的檢測抗體IOul，用 PBS-TBN補(bǔ)足體積到lOOul，置于37°C搖床120rpm，lh，取出后離心，棄上清，用PBS-TBN洗兩次，然后加入已稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG IOul，用PBS-TBN補(bǔ)足體積到lOOul，置于37°C搖床反應(yīng)lh，取出后離心棄上清，用PBS-TBN洗兩次，再加入SA-PE，用PBS-TBN補(bǔ)足體積到IOOul，置于37°C搖床反應(yīng)，取出后離心棄上清，用PBS-TBN洗滌兩次，重懸于IOOul PBS-TBN中，上機(jī)進(jìn)行檢測。本發(fā)明運(yùn)用液相芯片技術(shù)，提供一種用于檢測大腸桿菌0157 (.Escherichia coli 0157)的方法，以便實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌0157的快速檢測，為食品安全做出貢獻(xiàn)。液相芯片是集合流式細(xì)胞技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)及傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)為一體的新型生物分子檢測技術(shù)，其最大的特點(diǎn)是高通量，靈活性好，靈敏度高。


圖1是本法明捕獲抗體最佳工作濃度； 圖2是本發(fā)明靈敏度檢測結(jié)果；
圖3是本發(fā)明特異性的檢測結(jié)果； 圖4是本發(fā)明重復(fù)性檢測。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是通過大腸桿菌0157的特異抗體，與微球進(jìn)行偶聯(lián)后，制備出可以對(duì)大腸桿菌0157進(jìn)行檢測的液相芯片，在應(yīng)用時(shí)，加入樣品增菌液，使增菌液中的大腸桿菌0157被微球上的捕獲抗體所捕獲，檢測抗體也與大腸桿菌0157結(jié)合后， 再與生物素標(biāo)記的抗抗體共同孵育，然后通過生物素與鏈霉親和素-藻紅蛋白反應(yīng)，應(yīng)用 LuminexlOO檢測系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌0157的特異檢測。本發(fā)明涉及的檢測大腸桿菌0157液相芯片主要由微球、捕獲抗體、檢測抗體、生物素標(biāo)記的抗抗體、鏈霉親和素-藻紅蛋白(SA-PE)組成。其特征是，所述微球?yàn)轸然?1號(hào)微球；所述捕獲抗體是大腸桿菌0157的單克隆抗體mAb)，所述檢測抗體是大腸桿菌0157的多克隆抗體pAb)，生物素標(biāo)記的抗抗體是經(jīng)活化的生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(biotin-羊抗兔IgG)；所述捕獲抗體和檢測抗體均能特異與大腸桿菌 0157結(jié)合。以紅色激光激發(fā)其球型基質(zhì)上的紅色分類熒光，以綠色激光激發(fā)與生物素標(biāo)記的抗抗體相結(jié)合的藻紅蛋白，測定球型基質(zhì)上結(jié)合的報(bào)告熒光分子的數(shù)量，用于間接確定球型基質(zhì)上結(jié)合大腸桿菌0157的數(shù)量。上述的檢測抗體是用于識(shí)別大腸桿菌0157的另一類抗體，其作用是將與液相芯片上捕獲抗體結(jié)合的大腸桿菌0157與抗抗體結(jié)合，而抗抗體能與檢測熒光偶聯(lián)，間接將結(jié)合的大腸桿菌0157濃度與檢測熒光的強(qiáng)度結(jié)合起來，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌0157的濃度進(jìn)行定量測定。生物素標(biāo)記的抗抗體通過生物素與鏈霉親和素-藻紅蛋白結(jié)合，最后通過 LuminexlOO檢測系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌0157進(jìn)行定性定量檢測。本發(fā)明所述的大腸桿菌0157液相檢測芯片的制備方法，其步驟是 (1)捕獲抗體與微球偶聯(lián)形成偶聯(lián)體
取微球原液室溫恢復(fù)30min，用超聲波清洗機(jī)進(jìn)行超聲lOmin，漩渦震蕩30s，使微球均勻分布。用無菌水分別配制50mg/ml的EDC和NHS。然后取200ul的微球原液置于1. 5ml 的離心管中，14000 rpm，離心5min。取出后棄上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul 的活化緩沖液?；靹蚝螅娩X箔紙包好，置于37°C搖床120 rpm，20min，然后14000 rpm，離心5min，小心移去上清。加入500ul稀釋至250ug/ml的捕獲抗體，重懸混勻，置于37°C搖床120 rpm，孵育池。取出后離心棄上清，用500ul的PBS進(jìn)行洗滌，洗滌后加入500ul 1% BSA的PBS溶液，重懸微球，37°C水浴搖床孵育兩個(gè)小時(shí)進(jìn)行封閉。封閉后4°C保存。(2)應(yīng)用液相芯片檢測大腸桿菌0157的方法
將已偶聯(lián)的微球混合液室溫恢復(fù)lOmin，漩渦振蕩器震蕩約;3min。取約5000個(gè)微球， 加入IO8 CFU/ml的大腸桿菌015710ul，用PBS-TBN補(bǔ)足體積到lOOul。置于37°C搖床 120rpm, Ih。取出后離心棄上清，用200ul PBS-TBN洗兩次。加入已稀釋的檢測抗體IOul，用 PBS-TBN補(bǔ)足體積到lOOul。置于37°C搖床120rpm，lh。取出后離心，棄上清，用PBS-TBN 洗兩次。然后加入已稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG IOul，用PBS-TBN補(bǔ)足體積到lOOul。 置于37°C搖床反應(yīng)lh。取出后離心棄上清，用PBS-TBN洗兩次。再加入SA-PE，用PBS-TBN 補(bǔ)足體積到lOOul，置于37°C搖床反應(yīng)，取出后離心棄上清，用PBS-TBN洗滌兩次。重懸于 IOOul PBS-TBN中，上機(jī)進(jìn)行檢測。1.捕獲抗體最佳工作濃度的確定
圖ι所示當(dāng)單抗?jié)舛葹?50ug/ml時(shí)，其MFI值達(dá)到最大，故單抗最佳的工作濃度為 250ug/mlo2.偶聯(lián)是否成功的檢測
權(quán)利要求
1. 一種液相芯片檢測大腸桿菌0157的方法，其特征在于由微球、捕獲抗體、檢測抗體、生物素標(biāo)記的抗抗體、鏈霉親和素-藻紅蛋白組成，其中微球是羧基化的21號(hào)微球、捕獲抗體是大腸桿菌0157單克隆抗體、檢測抗體是大腸桿菌0157的多克隆抗體、生物素標(biāo)記的抗抗體是經(jīng)活化的生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，捕獲抗體和檢測抗體均能特異與大腸桿菌 0157結(jié)合，以紅色激光激發(fā)其球型基質(zhì)上的紅色分類熒光，以綠色激光激發(fā)與生物素標(biāo)記的抗抗體相結(jié)合的藻紅蛋白，測定球型基質(zhì)上結(jié)合的報(bào)告熒光分子的數(shù)量，用于間接確定球型基質(zhì)上結(jié)合大腸桿菌0157的數(shù)量；液相芯片的制備捕獲抗體與微球偶聯(lián)形成偶聯(lián)體取微球原液室溫恢復(fù)30min，用超聲波清洗機(jī)進(jìn)行超聲lOmin，漩渦震蕩30s，使微球均勻分布，用無菌水分別配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200ul的微球原液置于1. 5ml的離心管中，14000 rpm，離心5min，取出后棄上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化緩沖液，混勻后，用鋁箔紙包好，置于37°C搖床120 rpm，20min，然后14000 rpm，離心 5min,小心移去上清，加入500ul稀釋至250ug/ml的捕獲抗體，重懸混勻，置于37°C搖床120 rpm,孵育池，取出后離心棄上清，用500ul的PBS進(jìn)行洗滌，洗滌后加入500ul 1 % BSA的 PBS溶液，重懸微球，37°C水浴搖床孵育兩個(gè)小時(shí)進(jìn)行封閉，封閉后4°C保存； 液相芯片檢測大腸桿菌0157的方法將已偶聯(lián)的微球混合液室溫恢復(fù)lOmin，漩渦振蕩器震蕩約3min，取約5000個(gè)微球， 加入IO8 CFU/ml的大腸桿菌015710ul，用PBS-TBN補(bǔ)足體積到lOOul，置于37 °C搖床 120rpm，lh，取出后離心棄上清，用200ul PBS-TBN洗兩次，加入已稀釋的檢測抗體IOul，用 PBS-TBN補(bǔ)足體積到lOOul，置于37°C搖床120rpm，lh,取出后離心，棄上清，用PBS-TBN洗兩次，然后加入已稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG IOul，用PBS-TBN補(bǔ)足體積到lOOul，置于37°C搖床反應(yīng)lh，取出后離心棄上清，用PBS-TBN洗兩次，再加入SA-PE，用PBS-TBN補(bǔ)足體積到lOOul，置于37°C搖床反應(yīng)，取出后離心棄上清，用PBS-TBN洗滌兩次，重懸于IOOul PBS-TBN中，上機(jī)進(jìn)行檢測。
全文摘要
一種液相芯片檢測大腸桿菌O157的方法，屬于免疫技術(shù)及食品衛(wèi)生檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的目的是提供一種采用液相芯片技術(shù)用于檢測大腸桿菌O157的方法，以便實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌O157的快速檢測。本發(fā)明首先制備液相芯片，捕獲抗體與微球偶聯(lián)形成偶聯(lián)體，然后應(yīng)用液相芯片檢測大腸桿菌O157。本發(fā)明運(yùn)用液相芯片技術(shù)，提供一種用于檢測大腸桿菌O157(EscherichiacoliO157)的方法，以便實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌O157的快速檢測，為食品安全做出貢獻(xiàn)。液相芯片是集合流式細(xì)胞技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)及傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)為一體的新型生物分子檢測技術(shù)，其最大的特點(diǎn)是高通量，靈活性好，靈敏度高。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102520167SQ201110360550
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月15日
發(fā)明者劉金華, 王亞麗, 王振國, 羅雁非, 蔡陽 申請(qǐng)人:吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心