一種檢測(cè)水中大腸桿菌的微流控芯片以及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種檢測(cè)水中大腸桿菌的微流控芯片以及方法。本發(fā)明所述微流控芯片包括偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的大腸桿菌抗體以及芯片盒，還可以包括梯度濃度的大腸桿菌菌懸液、磷酸緩沖液和吐溫組成的洗滌液及磁鐵。本發(fā)明基于免疫磁珠技術(shù)對(duì)水中大腸桿菌進(jìn)行了準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的含量檢測(cè)，檢測(cè)周期短，程序簡(jiǎn)單易操作，能夠適應(yīng)污染源快速診斷的需要。
【專利說明】—種檢測(cè)水中大腸桿菌的微流控芯片以及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種檢測(cè)水中大腸桿菌的微流控芯片以及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌(Escherichia coli)是指示水體中糞便污染的最重要細(xì)菌學(xué)指標(biāo)之一，相對(duì)于總大腸菌群和糞大腸菌群，大腸桿菌對(duì)糞便污染的指示作用最強(qiáng)。目前，世界各國(guó)及國(guó)際組織都將大腸桿菌作為重要環(huán)境衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)，并對(duì)其提出了嚴(yán)格的限制。世界衛(wèi)生組織《飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(第二版)中規(guī)定，大腸桿菌在任意IOOmL用于飲用的水中不得檢出；現(xiàn)行美國(guó)飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)國(guó)家一級(jí)飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定大腸桿菌的限值為OCFU/ml ;中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，大腸桿菌在每IOOmL水樣中不得檢出。
[0003]大腸桿菌(E.coli 0157:H7)是腸出血性大腸桿菌的一個(gè)主要菌型，此菌在世界范圍內(nèi)發(fā)生過多次暴發(fā)，并造成嚴(yán)重危害。它能引起人類出血性腹瀉，并發(fā)溶血性尿毒綜合癥(HUS)、血栓性血小板減少性紫瘢(TTP)等，老人和兒童并發(fā)HUS時(shí)病死率可高達(dá)50%。因此，做好水中E.coli 0157:H7的檢測(cè)具有重要的意義。
[0004]檢測(cè)大腸桿菌的傳統(tǒng)方法主要有多管發(fā)酵法和濾膜法。多管發(fā)酵法適用于各種樣品，但操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，濾膜法主要用于檢測(cè)雜質(zhì)較少的水樣，操作比多管發(fā)酵法更為簡(jiǎn)單，但是不適合檢測(cè)高濁度和其他復(fù)雜水樣。這兩種方法都具有檢測(cè)周期長(zhǎng)，程序繁瑣的缺點(diǎn)，難以適應(yīng)污染源快速診斷的需要。目前，國(guó)內(nèi)外研究人員已經(jīng)發(fā)展了一些新方法進(jìn)行大腸桿菌的快速檢測(cè)，主要包括酶底物法、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、免疫分析法、生物傳感器法等。
[0005]與傳統(tǒng)方法相比，這些方法雖然縮短了一定的檢測(cè)時(shí)間，但是仍然不能滿足快速檢測(cè)的需要，如申請(qǐng)?zhí)?01010284474.5的快速檢測(cè)大腸桿菌的方法及所用到的微流控芯片及其制備工藝。該方法基于電化學(xué)與電測(cè)量技術(shù)的電化學(xué)生物傳感技術(shù)以及免疫熒光技術(shù)對(duì)樣品中的大腸桿菌(E.coli 0157:H7)進(jìn)行了快速檢測(cè)，但是該技術(shù)在實(shí)際檢測(cè)中除熒光檢測(cè)裝置外還需要一些電極和電子設(shè)備，仍不能更方便的快速的檢測(cè)大腸桿菌(E.coli0157:H7)o

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)水中大腸桿菌的微流控芯片以及方法，使得通過本發(fā)明所述微流控芯片能夠快捷、方便、準(zhǔn)確檢測(cè)出水中大腸桿菌含量。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0008]一種檢測(cè)水中大腸桿菌的微流控芯片，包括:
[0009]偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的大腸桿菌抗體以及芯片盒；
[0010]所述芯片盒由下部基片和上部蓋板組成，其內(nèi)刻有檢測(cè)反應(yīng)主通道以及和檢測(cè)反應(yīng)主通道相連接的添加試劑的分通道，所述檢測(cè)反應(yīng)主通道和添加試劑的分通道均設(shè)有可開關(guān)的開口。
[0011]作為優(yōu)選，所述添加試劑的分通道為5個(gè)，呈放射狀與檢測(cè)反應(yīng)主通道相連接，示意圖見圖1。
[0012]作為優(yōu)選，所述芯片盒規(guī)格為10mmX5mmX2mm，所述檢測(cè)反應(yīng)主通道規(guī)格為8mmX 200 μ mX 40 μ m。
[0013]作為優(yōu)選，本發(fā)明所述微流控芯片還包括:梯度濃度的大腸桿菌菌懸液、磷酸緩沖液和吐溫組成的洗滌液及磁鐵。其中，所述磁鐵優(yōu)選為電磁鐵，可直接安裝到芯片盒上，通電時(shí)有磁性，斷電時(shí)無磁性。
[0014]作為優(yōu)選，所述偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球?yàn)榕悸?lián)有大腸桿菌兔抗的磁性微球，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的大腸桿菌抗體為異硫氰酸熒光素標(biāo)記的大腸桿菌鼠抗。
[0015]作為優(yōu)選，所述洗滌液由0.05mol/L磷酸緩沖液和體積百分比為0.05%的吐溫組成，pH 為 7.2。
[0016]作為優(yōu)選，所述大腸桿菌為E.coli 0157:H7。
[0017]作為優(yōu)選,所述偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球濃度0.8mg/ml,所述異硫氰酸突光素標(biāo)記的大腸桿菌抗體濃度50 μ g/mlo
[0018]此外，本發(fā)明還提供一種檢測(cè)水中大腸桿菌的方法，包括以下步驟:
[0019]步驟1、在芯片盒上設(shè)置磁鐵，所述芯片盒由下部基片和上部蓋板組成，其內(nèi)刻有檢測(cè)反應(yīng)主通道以及和檢測(cè)反應(yīng)主通道相連接的添加試劑的分通道，所述檢測(cè)反應(yīng)主通道和添加試劑的分通道均設(shè)有可開關(guān)的開口 ；
[0020]步驟2、將偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球通過添加試劑的分通道泵入到檢測(cè)反應(yīng)主通道，通過磁鐵將偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球固定于微流控芯片主通道內(nèi)，然后將已知濃度的大腸桿菌菌懸液也通過添加試劑的分通道泵入到檢測(cè)反應(yīng)主通道；
[0021]步驟3、488nm激發(fā)光照射檢測(cè)反應(yīng)主通道，檢測(cè)525nm熒光強(qiáng)度，獲得熒光強(qiáng)度值Fl ；
[0022]步驟4、將異硫氰酸熒光素標(biāo)記的大腸桿菌抗體通過添加試劑的分通道泵入到檢測(cè)反應(yīng)主通道，通過添加試劑的分通道泵入磷酸緩沖液和吐溫組成的洗滌液沖洗整個(gè)檢測(cè)反應(yīng)主通并排出，直至525nm熒光強(qiáng)度穩(wěn)定，獲得熒光強(qiáng)度值F2，計(jì)算獲得檢測(cè)熒光強(qiáng)度值F=F2-F1 ；
[0023]步驟5、斷電消除磁鐵磁性，解除磁性微球的固定，再次泵入磷酸緩沖液和吐溫組成的洗滌液沖洗整個(gè)檢測(cè)反應(yīng)主通并排出，直至525nm熒光強(qiáng)度接近空白值；
[0024]步驟6、按照步驟1-步驟5的方法，用梯度濃度的大腸桿菌菌懸液分別獲得多個(gè)熒光強(qiáng)度值F，然后獲得不同濃度大腸桿菌菌懸液的濃度對(duì)數(shù)值與對(duì)應(yīng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0025]步驟7、將待測(cè)水樣按照步驟1-步驟5的方法獲得檢測(cè)熒光強(qiáng)度值，代入到步驟6得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得水中大腸桿菌的濃度。
[0026]所述標(biāo)準(zhǔn)曲線可經(jīng)軟件計(jì)算得到計(jì)算方程，直接帶入計(jì)算。
[0027]本發(fā)明所述方法檢測(cè)原理為:
[0028]利用微流控芯片外部的磁鐵來固定偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球，接著捕獲大腸桿菌，然后再用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的大腸桿菌抗體標(biāo)記所捕獲的大腸桿菌，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，如此制作標(biāo)準(zhǔn)曲線以及檢測(cè)待測(cè)水樣熒光強(qiáng)度，獲得待測(cè)水樣的大腸桿菌含量，最后斷電消除磁鐵磁性，用洗滌液沖洗檢測(cè)反應(yīng)主通道，準(zhǔn)備進(jìn)行下一次檢測(cè)。
[0029]其中，作為優(yōu)選，所述添加試劑的分通道為5個(gè)，呈放射狀與檢測(cè)反應(yīng)主通道相連接，不意圖見圖1。
[0030]作為優(yōu)選，所述芯片盒規(guī)格為10mmX5mmX2mm，所述檢測(cè)反應(yīng)主通道規(guī)格為8mmX 200 u mX 40 U m。
[0031]作為優(yōu)選，所述偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球?yàn)榕悸?lián)有大腸桿菌兔抗的磁性微球，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的大腸桿菌抗體為異硫氰酸熒光素標(biāo)記的大腸桿菌鼠抗。
[0032]作為優(yōu)選，所述洗滌液由0.05mol/L磷酸緩沖液和體積百分比為0.05%的吐溫組成，pH 為 7.2。
[0033]作為優(yōu)選，所述大腸桿菌為E.coli 0157:H7。
[0034]作為優(yōu)選，所述偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球濃度0.8mg/ml，所述異硫氰酸熒光素標(biāo)記的大腸桿菌抗體濃度50 V- g/mlo
[0035]取同一檢測(cè)水樣分別進(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果為52cfu/ml，而傳統(tǒng)濾膜法檢測(cè)結(jié)果為52cfu/ml。兩者數(shù)據(jù)沒有明顯差異，表明本發(fā)明檢測(cè)方法準(zhǔn)確度很高。
[0036]此外，經(jīng)過對(duì)比檢測(cè)，本發(fā)明方法最低檢出大腸桿菌濃度為5cfu/ml，檢測(cè)范圍為5至lX108cfu/ml，整體耗時(shí)為30min左右；而申請(qǐng)?zhí)?01010284474.5的方法最低檢出大腸桿菌濃度為6.4cfu/ml，線性范圍為6.4至I X 107cfu/ml，整體耗時(shí)大于80min。
[0037]由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明基于免疫磁珠技術(shù)對(duì)水中大腸桿菌進(jìn)行了準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的含量檢測(cè)，檢測(cè)周期短，程序簡(jiǎn)單易操作，能夠適應(yīng)污染源快速診斷的需要。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1所示為本發(fā)明所述芯片盒結(jié)構(gòu)示意圖，其中A所示為添加試劑的分通道，B所示為檢測(cè)反應(yīng)主通道；
[0039]圖2所示為不同濃度大腸桿菌菌懸液的濃度對(duì)數(shù)值與對(duì)應(yīng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中Ctl為大腸桿菌菌懸液的濃度。
【具體實(shí)施方式】
[0040]本發(fā)明公開了一種檢測(cè)水中大腸桿菌的微流控芯片以及方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述產(chǎn)品和方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0041]以下就本發(fā)明所提供的一種檢測(cè)水中大腸桿菌的微流控芯片以及方法做進(jìn)一步說明。
[0042]實(shí)施例1:大腸桿菌0157:H7菌懸液的制備
[0043]將經(jīng)多次挑單菌落純化的0157:H7菌種在LB瓊脂斜面上37°C培養(yǎng)20h，用0.5%福爾馬林無菌生理鹽水洗脫下來，9000r/min離心IOmin后棄上清液，再用無菌生理鹽水重復(fù)清洗兩次，然后制成濃度為I X IO7-1 X 108/ml菌懸液。然后放入100°c水浴中煮沸3h。取出待冷卻后放入冰箱冷減備用。
[0044]實(shí)施例2:偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球的制備
[0045]選取健康的新西蘭大耳兔，實(shí)施例1中滅活大腸桿菌菌懸液與弗氏不完全佐劑(1:1)乳化,于皮下注射免疫原,初次免疫劑量Iml/只，皮下分點(diǎn)注射；3次追加免疫劑量均為0.2ml/只，不加佐劑，最后一次免疫后8天頸動(dòng)脈放血法采血分離血清。
[0046]采用正辛酸-飽和硫酸銨法提取兔抗大腸桿菌免疫血清IgG。兩步沉淀法:先加正辛酸去雜蛋白，后加硫酸銨使抗體沉淀。凝膠層析脫鹽后在進(jìn)行超濾離心濃縮得到純化兔抗大腸桿菌兔抗作為捕獲抗體，并用280nm和260nm的吸收差法測(cè)定蛋白濃度。
[0047]配制0.llmol/L的磷酸緩沖液(PBS,pH=7.2)、0.5mol/L氨基己酸溶液及0.05wt%的吐溫混合液作為活化液。取200 μ L的活化液加入2mg的磁性微球，加入2mg的碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)，室溫混勻反應(yīng)15min。重復(fù)3次。
[0048]配制0.05mol/L磷酸緩沖液和0.05%吐溫的混合液(pH=7.2)作為洗滌液。用200 μ L的洗滌液洗滌已活化的磁球I次。加入兔抗大腸桿菌抗體，室溫下偶聯(lián)反應(yīng)2h。
[0049]洗滌已偶聯(lián)的磁球3次。加入200 μ L含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)和0.3%甘氨酸(Gly)的包被液，室溫反應(yīng)45min。洗滌已包被的磁球3次。加入200 μ L含有2%BSA的封閉液，放入4°C冰箱保存待用。
[0050]實(shí)施例3:異硫氰酸熒光素標(biāo)記的大腸桿菌抗體的制備
[0051]選取健康豚鼠，實(shí)施例1中滅活大腸桿菌菌懸液與弗氏不完全佐劑(1:1)乳化，初次免疫注射加入完全佐劑(1:1)，第2次加入不完全佐劑(1:1)。豚鼠抗原免疫I?3次均注射于四肢大腿內(nèi)側(cè)皮下淋巴結(jié)，均采用多點(diǎn)注射法。第4、5、6次注射加強(qiáng)，進(jìn)行腹腔注射。于次日注射后第7天抽血，用特異性抗原測(cè)定效價(jià)，心臟放血，分離純化抗體作為檢測(cè)抗體進(jìn)行下一步FITC標(biāo)記。
[0052]取大腸桿菌鼠抗的適量體積溶液，蛋白總量為lmg，用pH9.0的碳酸鹽緩沖液對(duì)抗體溶液進(jìn)行透析，使蛋白處于堿性環(huán)境中。用FITC對(duì)該抗體進(jìn)行標(biāo)記。其中FITC與蛋白質(zhì)含量比值為1:10，向反應(yīng)體系中逐滴滴入溶于二甲基亞砜的FITC，按照反應(yīng)條件為4°C、2h，20°C、4h，37°C、30min，避光反應(yīng)進(jìn)行FITC標(biāo)記。反應(yīng)完成后用超濾離心管9000r/min離心反應(yīng)液lOmin，重復(fù)該操作，每次收集離出液，測(cè)定熒光值(F488/525)，直至離出液無熒光值。測(cè)定標(biāo)記后檢測(cè)抗體的F488/525值。
[0053]實(shí)施例4:本發(fā)明所述微流控芯片
[0054]梯度濃度的大腸桿菌0157:H7菌懸液(濃度C0: 10U02U03U0\IO5UO6UO7UO8,109cfu/ml)、濃度為50 μ g/ml異硫氰酸突光素標(biāo)記的大腸桿菌鼠抗、0.8mg/ml偶聯(lián)有大腸桿菌兔抗的磁性微球、0.05mol/L磷酸緩沖液和體積百分比為0.05%的吐溫組成的洗滌液(ρΗ7.2)、磁鐵、芯片盒；
[0055]所述芯片盒由下部基片和上部蓋板組成，其內(nèi)刻有檢測(cè)反應(yīng)主通道以及和檢測(cè)反應(yīng)主通道相連接成放射狀分布的5個(gè)添加試劑的分通道，所述檢測(cè)反應(yīng)主通道和添加試劑的分通道均設(shè)有可開關(guān)的開口，示意圖見圖1。
[0056]實(shí)施例5:本發(fā)明所述方法
[0057]采用實(shí)施例4中的微流控芯片。[0058]在芯片盒上設(shè)置磁鐵，將偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球通過添加試劑的分通道泵入到檢測(cè)反應(yīng)主通道，通過磁鐵將偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球固定于微流控芯片主通道內(nèi)，然后將已知濃度的大腸桿菌菌懸液也通過添加試劑的分通道泵入到檢測(cè)反應(yīng)主通道；
[0059]488nm激發(fā)光照射檢測(cè)反應(yīng)主通道，檢測(cè)525nm熒光強(qiáng)度，獲得熒光強(qiáng)度值Fl ；
[0060]將異硫氰酸熒光素標(biāo)記的大腸桿菌抗體通過添加試劑的分通道泵入到檢測(cè)反應(yīng)主通道，通過添加試劑的分通道泵入磷酸緩沖液和吐溫組成的洗滌液沖洗整個(gè)檢測(cè)反應(yīng)主通并排出，直至525nm熒光強(qiáng)度穩(wěn)定，獲得熒光強(qiáng)度值F2，計(jì)算獲得檢測(cè)熒光強(qiáng)度值F=F2-F1 ；
[0061]斷電消除磁鐵磁性，解除磁性微球的固定，再次泵入磷酸緩沖液和吐溫組成的洗滌液沖洗整個(gè)檢測(cè)反應(yīng)主通并排出，直至525nm熒光強(qiáng)度接近空白值；
[0062]按照前述獲得檢測(cè)熒光強(qiáng)度值F的方法，用梯度濃度的大腸桿菌菌懸液分別獲得多個(gè)熒光強(qiáng)度值F，然后獲得不同濃度大腸桿菌菌懸液的濃度對(duì)數(shù)值與對(duì)應(yīng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2);
[0063]將待測(cè)水樣按照步驟1-步驟5的方法獲得檢測(cè)熒光強(qiáng)度值，代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得水中大腸桿菌的濃度。
[0064]實(shí)施例6:待測(cè)水樣中大腸桿菌含量的檢測(cè)
[0065]檢測(cè)方法:實(shí)施例5檢測(cè)方法以及本領(lǐng)域傳統(tǒng)的濾膜法
[0066]取同一檢測(cè)水樣分別進(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果為52cfu/ml，而傳統(tǒng)濾膜法檢測(cè)結(jié)果為52cfu/ml。兩者數(shù)據(jù)沒有明顯差異，表明本發(fā)明檢測(cè)方法準(zhǔn)確度很高。
[0067]此外，經(jīng)過對(duì)比檢測(cè)，本發(fā)明方法最低檢出大腸桿菌濃度為5cfu/ml，檢測(cè)范圍為5至lX108cfu/ml，整體耗時(shí)為30min左右；而申請(qǐng)?zhí)?01010284474.5的方法最低檢出大腸桿菌濃度為6.4cfu/ml，線性范圍為6.4至I X 107cfu/ml，整體耗時(shí)大于80min。
[0068]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)水中大腸桿菌的微流控芯片，其特征在于，包括: 偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的大腸桿菌抗體以及芯片盒； 所述芯片盒由下部基片和上部蓋板組成，其內(nèi)刻有檢測(cè)反應(yīng)主通道以及和檢測(cè)反應(yīng)主通道相連接的添加試劑的分通道，所述檢測(cè)反應(yīng)主通道和添加試劑的分通道均設(shè)有可開關(guān)的開口。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述微流控芯片，其特征在于，還包括: 梯度濃度的大腸桿菌菌懸液、磷酸緩沖液和吐溫組成的洗滌液及磁鐵。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述微流控芯片，其特征在于，所述洗滌液由0.05mol/L磷酸緩沖液和體積百分比為0.05%的吐溫組成，pH為7.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述大腸桿菌為E.coli0157:H7o
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述微流控芯片，其特征在于，所述偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球濃度0.8mg/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述微流控芯片，其特征在于，所述異硫氰酸熒光素標(biāo)記的大腸桿菌抗體濃度50 μ g/mlo
7.—種檢測(cè)水中大腸桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1、在芯片盒上設(shè)置磁鐵，所述芯片盒由下部基片和上部蓋板組成，其內(nèi)刻有檢測(cè)反應(yīng)主通道以及和檢測(cè)反應(yīng)主通道相連接的添加試劑的分通道，所述檢測(cè)反應(yīng)主通道和添加試劑的分通道均設(shè)有可開關(guān)的開口； 步驟2、將偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球通過添加試劑的分通道泵入到檢測(cè)反應(yīng)主通道，通過磁鐵將偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球固定于微流控芯片主通道內(nèi)，然后將已知濃度的大腸桿菌菌懸液也通過添加試劑的分通道泵入到檢測(cè)反應(yīng)主通道； 步驟3、488nm激發(fā)光照射檢測(cè)反應(yīng)主通道，檢測(cè)525nm熒光強(qiáng)度，獲得熒光強(qiáng)度值Fl ； 步驟4、將異硫氰酸熒光素標(biāo)記的大腸桿菌抗體通過添加試劑的分通道泵入到檢測(cè)反應(yīng)主通道，通過添加試劑的分通道泵入磷酸緩沖液和吐溫組成的洗滌液沖洗整個(gè)檢測(cè)反應(yīng)主通并排出，直至525nm熒光強(qiáng)度穩(wěn)定，獲得熒光強(qiáng)度值F2，計(jì)算獲得檢測(cè)熒光強(qiáng)度值F=F2-F1 ； 步驟5、斷電消除磁鐵磁性，解除磁性微球的固定，再次泵入磷酸緩沖液和吐溫組成的洗滌液沖洗整個(gè)檢測(cè)反應(yīng)主通并排出，直至525nm熒光強(qiáng)度接近空白值； 步驟6、按照步驟1-步驟5的方法，用梯度濃度的大腸桿菌菌懸液分別獲得多個(gè)熒光強(qiáng)度值F，然后獲得不同濃度大腸桿菌菌懸液的濃度對(duì)數(shù)值與對(duì)應(yīng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線.步驟7、將待測(cè)水樣按照步驟1-步驟5的方法獲得檢測(cè)熒光強(qiáng)度值，代入到步驟6得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得水中大腸桿菌的濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述洗滌液由0.05mol/L磷酸緩沖液和體積百分比為0.05%的吐溫組成，pH為7.2。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述大腸桿菌為E.coli0157:H7o
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述偶聯(lián)有大腸桿菌抗體的磁性微球濃度.0.8mg/ml,所述異硫氰酸突光素標(biāo)記的大腸桿菌抗體濃度50 μ g/mlo
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103777013SQ201410069183
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月27日
【發(fā)明者】單旭亮, 毛芳芳, 崔海松 申請(qǐng)人:杭州綠潔水務(wù)科技有限公司