一種食品中沙門菌的pcr檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明具體為一種食品中沙門菌的PCR檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法包括以下步驟：（1）樣品預(yù)處理：取樣后加入無菌生理鹽水溶解；（2）細(xì)菌培養(yǎng)：先進(jìn)行前增菌再進(jìn)行選擇性增菌，并進(jìn)行細(xì)菌鑒定，取鑒定后的菌落加入無菌生理鹽水配制成菌懸液；（3）DNA提取：取菌懸液離心，沉淀洗滌，煮沸，懸浮菌體，冷卻加入Tris-HCL緩沖液，離心，取上清作為模板；（4）PCR擴(kuò)增：取沙門菌的引物對(duì)步驟（3）中的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；（5）PCR產(chǎn)物檢測(cè)：取擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行凝膠電泳成像。該檢測(cè)方法可迅速檢出食品中沙門菌，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，敏感度及特異度高。
【專利說明】-種食品中沙門菌的PCR檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及食品中沙門菌的快速檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 沙門菌廣泛存在于自然界，是引起食源性疾病的首要病原菌，人與動(dòng)物均可感染， 人類感染沙門菌后可發(fā)生傷寒、副傷寒、胃腸炎等疾病，傷寒傳染性強(qiáng)、病程長(zhǎng)，患者需住院 隔離治療，是我國《傳染病防治法》中規(guī)定報(bào)道的乙類傳染病。近年來，隨著臨床抗生素的 不合理應(yīng)用，且病原菌耐藥性的產(chǎn)生及變異增加，傷害早期診斷較困難，因此，有必要開發(fā) 靈敏的病原菌的早期檢測(cè)方法。
[0003] 目前，公共衛(wèi)生、食品安全及出入境檢驗(yàn)檢疫中均將沙門菌檢測(cè)作為常規(guī)必需檢 測(cè)的項(xiàng)目。經(jīng)典的檢測(cè)方法為血培養(yǎng)，陽性率可達(dá)60% -80%，但該檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)，約 3-5d，且檢出率受采血量及服用抗生素等多種因素影響，此外，分離培養(yǎng)也較困難，因此，準(zhǔn) 確性及特異性均較差。近年來，有文獻(xiàn)報(bào)道采用PCR方法檢測(cè)食品中沙門菌，但這些方法大 多側(cè)重于單一 PCR，而食品中沙門菌含量往往極低，傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)則顯示出明顯缺陷。為 此，本發(fā)明提供一種特異性強(qiáng)靈敏度高的多重PCR檢測(cè)方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種食品中沙門菌的快速檢測(cè)方法，檢測(cè) 結(jié)果準(zhǔn)確，特異性及靈敏度均較高。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] -種食品中沙門菌的PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0007] (1)樣品預(yù)處理：準(zhǔn)確稱取固體樣品2_5g，粉碎，或量取液體樣品5-10ml，在粉碎 后的固體樣品及液體樣品中加入無菌生理鹽水進(jìn)一步溶解；
[0008] (2)細(xì)菌培養(yǎng)：將待測(cè)樣品置入培養(yǎng)基中培養(yǎng)4_6h，取2_5g培養(yǎng)后紅色可疑菌落， 繼續(xù)培養(yǎng)4_6h，將培養(yǎng)后的產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)菌鑒定，取鑒定后的菌落加入無菌生理鹽水配制成 菌懸液；
[0009] (3) DNA提?。喝〔襟E⑵中的菌懸液5-10ml，離心5-8min，沉淀洗漆，煮沸 5-8min，加入NaOH溶液懸浮菌體，冷卻加入Tris-HCL緩沖液，離心，取上清l-3ul作為模 板；
[0010] (4)PCR擴(kuò)增：取沙門菌的引物對(duì)步驟（3)中的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0011] 反應(yīng)體系：10XPCR buffer 緩沖液 2. 5-5ul，Mg2+試劑 5-10ul，PCR 引物 5-10ul， Taq DNA聚合酶2_5ul，加純化水補(bǔ)足至25ul ;
[0012] 反應(yīng)過程：95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸5min，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0013] (5) PCR產(chǎn)物檢測(cè)：取步驟（4)中反應(yīng)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5-10ul，分別進(jìn)行凝膠 電泳成像。
[0014] 優(yōu)選的，所述的培養(yǎng)基為加入了亞硒酸鹽胱氨酸增菌液的CHRMagar顯色增養(yǎng)基。
[0015] 優(yōu)選的，所述的沉淀洗滌均采用PBS緩沖液，所述的沉淀洗滌重復(fù)操作2-5次。
[0016] 優(yōu)選的，所述的NaOH溶液濃度為2-5mol/L，所述的Tris-HCL濃度為1. 2-1. 5mol/ L，PH 為 8. 2-8. 4。
[0017] 優(yōu)選的，所述的離心速度為10000-12000轉(zhuǎn)/min。
[0018] 步驟⑷中PCR擴(kuò)增采用的PCR引物為：
[0019] Inva 引物：F :CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ;
[0020] R：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ；
[0021] Hi la 引物：F :CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ;
[0022] R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT〇
[0023] 優(yōu)選的，所述的Mg2+試劑選自MgCL2或MgS0 4的一種或多種，所述的Mg2+試劑濃度 % 1. 5-2. 0mmol/L〇
[0024] 優(yōu)選的，所述的PCR引物濃度為為8-10mmol/L。
[0025] 優(yōu)選的，所述的Taq DNA聚合酶濃度為2_5U/ul。
[0026] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果體現(xiàn)在：
[0027] 1.本發(fā)明先對(duì)細(xì)菌先進(jìn)行前增菌，然后進(jìn)行選擇性增菌，并鑒定，可對(duì)食品中沙門 菌先進(jìn)行定性檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，為后續(xù)的PCR定量檢測(cè)提供了條件。
[0028] 2.本發(fā)明中對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基不采用傳統(tǒng)的NaCl肉湯，而是采 用加入了亞硒酸鹽胱氨酸增菌液的CHRMagar顯色增養(yǎng)基，增菌效果好，多重PCR效果良好。
[0029] 3. Inva是調(diào)控沙門菌侵入上皮細(xì)胞的重要因子，也是產(chǎn)生致病性的重要因子， Hila也是毒力島SP11基因之一，與沙門菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的侵襲有關(guān)，本發(fā)明選擇沙門菌 特異的Inva及Hila基因，設(shè)計(jì)沙門菌PCR引物，進(jìn)行二重PCR擴(kuò)增，可特異性的檢測(cè)沙門 菌，提高檢測(cè)結(jié)果的特異性，減少假陽性。同時(shí)，對(duì)二重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，避 免了引物間相互干擾，提高了檢測(cè)結(jié)的敏感性。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 一種食品中沙門菌的PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0032] (1)樣品預(yù)處理：準(zhǔn)確稱取白木耳2g，粉碎，加入無菌生理鹽水進(jìn)一步溶解；
[0033] (2)細(xì)菌培養(yǎng)：將步驟（1)中得到的白木耳置入加入了亞硒酸鹽胱氨酸增菌液的 CHRMagar顯色增養(yǎng)基中培養(yǎng)4h，取2g培養(yǎng)后紅色可疑菌落，繼續(xù)培養(yǎng)4h，將培養(yǎng)后的產(chǎn)物 進(jìn)行細(xì)菌鑒定，取鑒定后的菌落加入無菌生理鹽水配制成菌懸液；
[0034] (3)DNA提?。喝〔襟E（2)中的菌懸液5ml，離心5min，采用PBS緩沖液沉淀洗滌，重 復(fù)2次，煮沸5min，加入2mol/L NaOH溶液懸浮菌體，冷卻加入濃度為1. 2mol/L，PH為8. 2 的Tris-HCL緩沖液，離心，離心速度為10000轉(zhuǎn)/min取上清lul作為模板；
[0035] (4) PCR擴(kuò)增：取沙門菌的引物對(duì)步驟⑶中的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Inva引物：F : CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ；
[0036] R ：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ；
[0037] Hila ：F ：CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ；
[0038] R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT ；
[0039] 反應(yīng)體系：10XPCR buffer 緩沖液 2. 5ul，1. 5mmol/L 的 MgCl2 試劑 5ul，8mmol/L PCR引物5ul，2U/ul的Taq DNA聚合酶2ul，加純化水補(bǔ)足至25ul ;
[0040] 反應(yīng)過程：95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸5min，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0041] (5) PCR產(chǎn)物檢測(cè)：取步驟（4)中反應(yīng)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5ul，進(jìn)行凝膠電泳成 像。
[0042] 實(shí)施例2
[0043] 一種食品中沙門菌的PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0044] (1)樣品預(yù)處理：準(zhǔn)確稱取香菇5g，粉碎，或量取液體樣品加入無菌生理鹽水進(jìn)一 步溶解；
[0045] (2)細(xì)菌培養(yǎng)：將待測(cè)樣品置入加入了亞硒酸鹽胱氨酸增菌液的CHRMagar顯色增 養(yǎng)基中培養(yǎng)h，取5g培養(yǎng)后紅色可疑菌落，繼續(xù)培養(yǎng)6h，將培養(yǎng)后的產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)菌鑒定，取 鑒定后的菌落加入無菌生理鹽水配制成菌懸液；
[0046] (3)DNA提?。喝〔襟E（2)中的菌懸液10ml，離心8min，采用PBS緩沖液沉淀洗滌， 重復(fù)5次，煮沸8min，加入5mol/L的NaOH溶液懸浮菌體，冷卻加入濃度為1. 5mol/L，PH為 8. 4的Tris-HCL緩沖液，離心，離心速度為12000轉(zhuǎn)/min取上清3ul作為模板；
[0047] (4) PCR擴(kuò)增：取沙門菌的引物對(duì)步驟⑶中的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Inva引物：F : CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ；
[0048] R ：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ；
[0049] Hila ：F ：CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ；
[0050] R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT ；
[0051] 反應(yīng)體系：10XPCR buffer 緩沖液 5ul，2. Ommol/L 的 MgS0410ul，lOmmol/L 的 PCR 引物10ul，5U/ul的Taq DNA聚合酶5ul，加純化水補(bǔ)足至25ul ;
[0052] 反應(yīng)過程：95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸5min，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0053] (5)PCR產(chǎn)物檢測(cè)：取步驟（4)中反應(yīng)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10ul，分別進(jìn)行凝膠電 泳成像。
[0054] 實(shí)施例3
[0055] -種食品中沙門菌的PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0056] (1)樣品預(yù)處理：準(zhǔn)確量取碳酸飲料5ml，加入無菌生理鹽水進(jìn)一步溶解；
[0057] (2)細(xì)菌培養(yǎng)：將待測(cè)樣品置入加入了亞硒酸鹽胱氨酸增菌液的CHRMagar顯色增 養(yǎng)基中培養(yǎng)5h，取3g培養(yǎng)后紅色可疑菌落，繼續(xù)培養(yǎng)5h，將培養(yǎng)后的產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)菌鑒定，取 鑒定后的菌落加入無菌生理鹽水配制成菌懸液；
[0058] (3)DNA提?。喝〔襟E（2)中的菌懸液8ml，離心6min，采用PBS緩沖液沉淀洗滌， 重復(fù)3次，煮沸6min，加入3. 5mol/L的NaOH溶液懸浮菌體，冷卻加入1. 3mol/L，PH為8. 3 的Tris-HCL緩沖液，離心，離心速度為11000轉(zhuǎn)/min，取上清2ul作為模板；
[0059] (4) PCR擴(kuò)增：取沙門菌的引物對(duì)步驟⑶中的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Inva引物：F : CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ；
[0060] R ：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ；
[0061] Hi 1 a :F :CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ;
[0062] R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT ；
[0063] 反應(yīng)體系：10XPCR buffer 緩沖液 4ul，1. 8mmol/L 的 MgCL2 試劑 8ul，9mmol/L 的 PCR引物5-10ul，3U/ul的Taq DNA聚合酶3. 5ul，加純化水補(bǔ)足至25ul ;
[0064] 反應(yīng)過程：95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸5min，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0065] (5) PCR產(chǎn)物檢測(cè)：取步驟（4)中反應(yīng)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5-10ul，分別進(jìn)行凝膠 電泳成像。
[0066] 上述實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限定，本領(lǐng)域 技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保 護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種食品中沙門菌的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 樣品預(yù)處理：準(zhǔn)確稱取固體樣品2-5g，粉碎，或量取液體樣品5-10ml，在粉碎后的 固體樣品及液體樣品中加入無菌生理鹽水進(jìn)一步溶解； (2) 細(xì)菌培養(yǎng)：將待測(cè)樣品置入培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6h，取2-5g培養(yǎng)后紅色可疑菌落，繼續(xù) 培養(yǎng)4-6h，將培養(yǎng)后的產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)菌鑒定，取鑒定后的菌落加入無菌生理鹽水配制成菌懸 液； (3) DNA提?。喝〔襟E（2)中的菌懸液5-10ml，離心5-8min，沉淀洗滌，煮沸5-8min，力口 入NaOH溶液懸浮菌體，冷卻加入Tris-HCL緩沖液，離心，取上清l-3ul作為模板； (4) PCR擴(kuò)增：取沙門菌的引物對(duì)步驟（3)中的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 反應(yīng)體系：l〇XPCR buffer 緩沖液 2. 5-5ul，Mg2+試劑 5-10ul，PCR 引物 5-10ul，Taq DNA聚合酶2-5ul，加純化水補(bǔ)足至25ul ; 反應(yīng)過程：95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，進(jìn)行30個(gè)循 環(huán)；最后72°C延伸5min，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； (5) PCR產(chǎn)物檢測(cè)：取步驟（4)中反應(yīng)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5-10ul，進(jìn)行凝膠電泳成像。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟⑵中所述 的培養(yǎng)基為加入了亞硒酸鹽胱氨酸增菌液的CHRMagar顯色增養(yǎng)基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟⑶中所述 的沉淀洗滌均采用PBS緩沖液，所述的沉淀洗滌重復(fù)操作2-5次。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟⑶中所述 的 NaOH 溶液濃度為 2-5mol/L，所述的 Tris-HCL 濃度為 1. 2-1. 5mol/L，PH 為 8. 2-8. 4。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟⑶中所述 的離心速度為10000-12000轉(zhuǎn)/min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟（4)中PCR 擴(kuò)增采用的PCR引物為： Inva 引物：F :CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ; R ：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ； Hila 引物：F :CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ; R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟⑷中所述 的Mg2+試劑選自MgCL 2或MgS04的一種或多種，所述的Mg2+試劑濃度為1. 5-2. Ommol/L。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟⑷中所述 的PCR引物濃度為為8-10mmol/L。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟⑷中所述 的Taq DNA聚合酶濃度為2-5U/ul。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104195240SQ201410404056
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月16日
【發(fā)明者】郭狄 申請(qǐng)人:中山鼎晟生物科技有限公司