一種結(jié)核分枝桿菌（tb）核酸檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】一種應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)臨床診斷領(lǐng)域中的結(jié)核分枝桿菌（TB）核酸檢測(cè)試劑盒，試劑盒包括磁珠法核酸提取試劑盒和TB核酸擴(kuò)增試劑盒，其中磁珠法核酸提取試劑盒包括裂解結(jié)合液、漂洗液、洗脫液、磁珠液；TB核酸擴(kuò)增試劑盒包括TB-PCR反應(yīng)液、酶混合液、TB-內(nèi)標(biāo)、陰性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品；所述TB核酸擴(kuò)增試劑盒中TB-PCR反應(yīng)液包括用于檢測(cè)靶基因和內(nèi)標(biāo)的探針、用于擴(kuò)增靶基因和內(nèi)標(biāo)的上游引物以及下游引物、PCR緩沖液。該發(fā)明無(wú)需高速離心及煮沸、操作簡(jiǎn)便快速、成本低廉，生物風(fēng)險(xiǎn)小，便于自動(dòng)化和高通量檢測(cè)；檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，避免出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果；引入高效的內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)，能夠高效的監(jiān)控整個(gè)檢測(cè)過(guò)程。
【專利說(shuō)明】一種結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)臨床診斷試劑領(lǐng)域中的一種結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測(cè)試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核一直是全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，全球有2000萬(wàn)人患結(jié)核病，每年新發(fā)病人數(shù)達(dá)800-1000萬(wàn)人，全球每年約300萬(wàn)人死于結(jié)核病。結(jié)核病與艾滋病、瘧疾并列為影響全球健康的三大傳染病殺手。我國(guó)結(jié)核病患者數(shù)量居世界第二位，年發(fā)病人數(shù)約為130萬(wàn)，占全球發(fā)病的14.3%。每年因結(jié)核病死亡的人數(shù)大大超過(guò)其他傳染病死亡人數(shù)的總和。2011年3月21日，衛(wèi)生部發(fā)布了“全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查結(jié)果”。其中的數(shù)據(jù)表明，中國(guó)現(xiàn)有超過(guò)500萬(wàn)名結(jié)核病活動(dòng)性患者，而感染結(jié)核病菌的人數(shù)則超過(guò)5.5億人，占全國(guó)總?cè)丝诘?5%。我國(guó)對(duì)結(jié)核病的治愈率平均已達(dá)到87%以上，但對(duì)結(jié)核病的發(fā)現(xiàn)率約為29%。發(fā)現(xiàn)率極低已成為我國(guó)有效控制結(jié)核病大規(guī)模傳染的最大障礙和隱患。
[0003]目前國(guó)內(nèi)常用的結(jié)核診斷手段主要有痰涂片、痰培養(yǎng)方法、結(jié)核菌素試驗(yàn)和X-光方法檢測(cè)。結(jié)核菌素試驗(yàn)和X-光法結(jié)果易受其他疾病干擾，容易造成誤判。痰涂片只有當(dāng)標(biāo)本中含14~15菌/ml時(shí)方能檢出，發(fā)現(xiàn)率極低。而痰培養(yǎng)方法作為結(jié)核診斷手段的“金標(biāo)準(zhǔn)”，被廣泛使用，但其耗時(shí)長(zhǎng)(常需2個(gè)月)、操作復(fù)雜的特點(diǎn)，越來(lái)越為人所詬病，不利于結(jié)核的早期防治。故而需要尋求靈敏度更高，更快速的檢測(cè)手段。
[0004]實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在普通PCR技術(shù)之上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的技術(shù)，該技術(shù)可以對(duì)靶核酸進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。具有很高的擴(kuò)增特異性，同時(shí)檢測(cè)的靈敏度也非常高。將實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)與痰培養(yǎng)等診斷技術(shù)相結(jié)合可以提高對(duì)結(jié)核病診斷的靈敏度，提高結(jié)核發(fā)現(xiàn)率，并對(duì)結(jié)核患者的感染狀態(tài)和愈后情況進(jìn)行更為科學(xué)準(zhǔn)確的評(píng)估，有利于更準(zhǔn)確地對(duì)結(jié)核治療藥物療效進(jìn)行觀察。
[0005]目前，市場(chǎng)上已經(jīng)有多種結(jié)核分枝桿菌熒光定量檢測(cè)試劑產(chǎn)品。但是由于結(jié)核樣本存在于強(qiáng)堿液化過(guò)的痰液中，這些產(chǎn)品無(wú)法對(duì)這樣復(fù)雜的的樣本進(jìn)行核酸提取，從而導(dǎo)致這些產(chǎn)品的檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確度、特異性等技術(shù)指標(biāo)較差。因此，研究開(kāi)發(fā)一種能夠直接從液化結(jié)核樣本中直接純化核酸的檢測(cè)試劑盒，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測(cè)試劑盒，該發(fā)明從根本上解決現(xiàn)有結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸PCR技術(shù)存在的靈敏度低、準(zhǔn)確性差，生物風(fēng)險(xiǎn)高等問(wèn)題，其設(shè)計(jì)的TaqMan熒光探針具有靈敏度高，特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，核酸DNA提取方法簡(jiǎn)單，核酸純度高，成本較低，特別適用于結(jié)核分枝桿菌(TB)檢測(cè)，便于自動(dòng)化和高通量檢測(cè)。
[0007]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測(cè)試劑盒，試劑盒包括磁珠法核酸提取試劑盒和TB核酸擴(kuò)增試劑盒，其中磁珠法核酸提取試劑盒包括裂解結(jié)合液、漂洗液、洗脫液、磁珠液；TB核酸擴(kuò)增試劑盒包括TB-PCR反應(yīng)液、酶混合液、TB-內(nèi)標(biāo)、陰性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品；所述磁珠法核酸提取試劑盒中裂解結(jié)合液組成為含有十二烷基肌氨酸鈉0.5-2.5%，Triton X-1OO 0.5-2.5ml/100ml，異硫氰酸胍2-6.0moI/L, EDTA (PH7.5) 1-10 mM, HCl 0.1-0.3M ;所述磁珠法核酸提取試劑盒中漂洗液組成為含有 Triton X-100 0.5-2.0ml/100ml，氯化鈉 0.1-0.3mol/L, 60-80%乙醇；所述磁珠法核酸提取試劑盒中洗脫液組成為含有l(wèi)Ommol/L Tris.HCl (PH8.3)，0.01-0.05% Prolin300 ;所述磁珠法核酸提取試劑盒中磁珠液組成為直徑為I μ m的氧化硅超順納米磁珠，濃度為10-40mg/ml ;所述TB核酸擴(kuò)增試劑盒中TB-PCR反應(yīng)液包括用于檢測(cè)靶基因和內(nèi)標(biāo)的探針、用于擴(kuò)增靶基因和內(nèi)標(biāo)的上游引物以及下游引物、PCR緩沖液；TB核酸擴(kuò)增試劑盒中用于檢測(cè)祀基因的探針序列為:5-ctgcccactccgaatcgtgctgacc_3(SEQ ID N0:l)，5’端標(biāo)記為FAM熒光發(fā)生基團(tuán)，3’端標(biāo)記為BHQl熒光淬滅基團(tuán)；用于內(nèi)標(biāo)檢測(cè)的探針序列為:5’-CAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGC-’3 (SEQ ID N0:2)，5’ 端標(biāo)記為HEX熒光發(fā)生基團(tuán)，3’端標(biāo)記為BHQl熒光淬滅基團(tuán)；用于擴(kuò)增靶基因的上游引物序列為:5-tgcggatggtcgcagagatcc_3 (SEQ ID NO: 3);用于擴(kuò)增祀基因的下游引物序列為:5-agtagacgggcgacctcactg-3 (SEQ ID NO:4);用于擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的上游引物序列為:5’_ TTCGATCTCCGTCGAACCTTG-’3 (SEQ ID NO:5);用于擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的下游引物序列為:5’-ttctcaggactccagtcgcTG-’3 (SEQ ID N0:6);所述TB核酸擴(kuò)增試劑盒中用于檢測(cè)革巴基因的探針使用濃度為5-20pmol，優(yōu)選靶基因探針使用濃度為Spmol ;所述用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針使用濃度為5-20pmol，優(yōu)選內(nèi)標(biāo)探針使用濃度為Spmol ;所述用于檢測(cè)靶基因的上下游引物使用濃度為10-30pmol，優(yōu)選靶基因的上下游引物使用濃度為20pmol ;所述用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的引物使用濃度為5-20pmol，優(yōu)選內(nèi)標(biāo)引物使用濃度為Spmol ;所述TB核酸擴(kuò)增試劑盒中 PCR 緩沖液組成為 30mmol/L Tris-HC1(PH8.3)，1mmoI/L (NH4)2SO4, 30mmoI/L KCl,3mmol/L MgCl2,0.15mmol/L dNTPs ;所述TB核酸擴(kuò)增試劑盒中酶混合液包括熱啟動(dòng)Taq酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG);其中熱啟動(dòng)Taq酶的用量為3_8U/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量為
0.05-0.2U/人份；所述試劑盒中TB內(nèi)標(biāo)是將序列
5’-TTCGATCTCCGTCGAACCTTGCACTCTGCATCCTGGACTCATGCTGACTGCAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGCTCTACTGCACTCCTGCGTCATCACgcgactggagtcctgagaa-’3 (SEQ ID NO:7)插入到pUC18T載體而構(gòu)成的重組體；TB內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒使用濃度為100-500copies/次，優(yōu)選使用濃度為200copies/次；所述試劑盒需要進(jìn)行PCR反應(yīng)，其擴(kuò)增的最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間為:50°C 2min，l個(gè)循環(huán)；95°C 3min，I個(gè)循環(huán)；最后94°C 10s,60°C 30s，45個(gè)循環(huán)采集熒光信號(hào)；所述試劑盒檢測(cè)樣本類型為經(jīng)4% NaOH液化后的痰液樣本；試劑盒的檢測(cè)靈敏度為I菌/ml。
[0008]本發(fā)明的要點(diǎn)在于一種結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測(cè)試劑盒。其基本原理是:首先采用納米磁珠法提取經(jīng)4% NaOH液化后痰液樣品中TB DNA作為擴(kuò)增模板，然后應(yīng)用TaqMan熒光探針技術(shù)完成對(duì)該模板實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)過(guò)程。同時(shí)擴(kuò)增體系中引入了高效的內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)，通過(guò)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)是否正常來(lái)監(jiān)測(cè)待測(cè)樣本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假陰性。其中，通過(guò)應(yīng)用專業(yè)生物信息學(xué)軟件，分析比較了 TB基因序列，設(shè)計(jì)了高保守性、特異性和聞效性的TaqMan突光探針和引物以及內(nèi)標(biāo)的探針和引物。所述革巴基因和內(nèi)標(biāo)探針?lè)謩e標(biāo)記FAM和HEX熒光報(bào)告基團(tuán)；所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物在70-130個(gè)堿基對(duì)范圍。本發(fā)明試劑盒采用吸附效果好、易于純化的磁珠法提取痰液樣品中結(jié)核分枝桿菌核酸作為模板，應(yīng)用TaqMan熒光探針技術(shù)完成對(duì)該模板熒光定量PCR檢測(cè)過(guò)程。同時(shí)在反應(yīng)體系中添加了高效的內(nèi)標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)是否正常來(lái)監(jiān)測(cè)待測(cè)樣本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假陰性的存在。
[0009]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
1、本發(fā)明沒(méi)有目前熒光定量PCR檢測(cè)方法中常需要的高速離心及煮沸等步驟，降低了儀器的要求，同時(shí)避免了這些劇烈操作所造成的生物風(fēng)險(xiǎn)和核酸損失。
[0010]2、4% NaOH液化是痰液預(yù)處理的常規(guī)步驟，本發(fā)明可與此常規(guī)步驟很好融合，解決了 NaOH的高pH對(duì)后續(xù)PCR的影響。
[0011]3、本發(fā)明檢測(cè)靈敏度高，重復(fù)性好。使用自主開(kāi)發(fā)的磁珠法核酸提取技術(shù)，從樣品中獲得結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸，消除提取物對(duì)PCR反應(yīng)的干擾，加大了檢測(cè)樣本量，提高了檢測(cè)靈敏度和穩(wěn)定性，使靈敏度達(dá)到I個(gè)菌/mL，遠(yuǎn)高于常規(guī)檢測(cè)方法。
[0012]4、本發(fā)明引物和探針保守性高、特異性強(qiáng)，同時(shí)通過(guò)在PCR體系中的UNG酶+dUTP措施，高效降解可能的污染產(chǎn)物，避免假陽(yáng)性，有利于提高結(jié)核檢測(cè)的準(zhǔn)確性和特異性。本發(fā)明引入了高效的內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)，能夠高效的監(jiān)控整個(gè)提取和PCR擴(kuò)增過(guò)程，避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
[0013]5、本發(fā)明使用磁珠法與核酸提取相結(jié)合，操作簡(jiǎn)便、快速、成本低廉，并且易于開(kāi)發(fā)為自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)， 減輕了操作人員的負(fù)擔(dān)，并降低了生物風(fēng)險(xiǎn)的可能性，有利于自動(dòng)化和大量樣品的高通量檢測(cè)。
[0014]一種結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測(cè)試劑盒與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有無(wú)需高速離心及煮沸、操作簡(jiǎn)便快速、成本低廉，生物風(fēng)險(xiǎn)小，便于自動(dòng)化和高通量檢測(cè)；檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，避免出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果；引入高效的內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)，能夠高效的監(jiān)控整個(gè)檢測(cè)過(guò)程等優(yōu)點(diǎn)，將廣泛的應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)臨床診斷領(lǐng)域中。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0016]圖1是本發(fā)明對(duì)四種濃度TB陽(yáng)性樣本的重復(fù)性測(cè)試檢測(cè)結(jié)果圖。
[0017]圖2是本發(fā)明對(duì)I菌/ml中檢所TB靈敏度國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的重復(fù)測(cè)試結(jié)果圖。
[0018]圖3是本發(fā)明檢測(cè)內(nèi)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019]以下實(shí)施例將有助于對(duì)本發(fā)明的了解，但這些實(shí)施例僅為了對(duì)本發(fā)明加以說(shuō)明，本發(fā)明并不限于這些內(nèi)容。
[0020]實(shí)施例一
(一)TB DNA的熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)例 I)試劑準(zhǔn)備
a、根據(jù)待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、臨界陽(yáng)性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照數(shù)量，按比例(磁珠懸浮液10μ I/人份+TB內(nèi)標(biāo)0.1 μ I/人份)取相應(yīng)量的磁珠懸浮液及TB內(nèi)標(biāo)，充分混勻成磁珠懸浮液-Mix后備用；
b.PCR反應(yīng)液的配制PCR 緩沖液組成為 30mmol/L Tris-HCl (PH8.3), 10mmol/L(NH4) 2S04, 30mmol/LKCl,
4.5mmol/LMgC12,0.15mmol/L dNTPs。擴(kuò)增靶基因的上游引物以及下游引物，使用濃度為20pmol,靶基因檢測(cè)的探針使用濃度為8pmol，內(nèi)標(biāo)的上游引物以及下游引物使用濃度為8pmol,內(nèi)標(biāo)探針使用濃度為8pmol。
[0021 ] c、根據(jù)待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、臨界陽(yáng)性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照數(shù)量，按比例(TB PCR反應(yīng)液19 μ I/人份+酶混合液I μ I/人份)取相應(yīng)量的TB PCR反應(yīng)液及TB酶混合液，充分混勻成PCR-Mix，瞬時(shí)離心后將上述準(zhǔn)備好的試劑轉(zhuǎn)移至標(biāo)本處理區(qū)備用，酶混合液組成包括熱啟動(dòng)Taq酶4U、尿嘧啶糖基化酶(UNG) 0.2U。
[0022]2)標(biāo)本提取
a、在樣本中加入4倍體積的4% NaOH溶液，震蕩混勻后，靜置液化30min。
[0023]b、取液化后的樣本上清、臨界陽(yáng)性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各200 μ I于1.5ml離心管，每管中加入400 μ I裂解液及10 μ I磁珠懸液，震蕩混勻10秒鐘后，室溫靜置10分鐘，瞬時(shí)離心，裂解液組成為含有十二烷基肌氨酸鈉0.5-2.5%，Triton X-100 0.5-2.5ml/100ml，異硫氰酸胍 2-6.0moI/L, EDTA (PH7.5) 1-10 mM, HCl 0.1-0.3M ；
C、將離心管置于磁力架上吸附約2分鐘，棄掉上清液，瞬時(shí)離心，吸干殘液；
d、加入漂洗液600μ1，用移液器反復(fù)吸打10次后，瞬時(shí)離心，所述漂洗液組成為含有Triton X-100 0.5 ~2.0ml/100ml，氯化鈉 0.1 ~0.3mol/L，60 ~80% 乙醇。在磁力架上吸附2分鐘，棄掉上清液，然后瞬時(shí)離心，將離心管再置于磁力架上吸附約2分鐘，吸干殘液；
e、加入100μ I洗脫液，震蕩混勻10秒鐘，然后室溫靜置2分鐘，所述洗脫液為含有1mmoI/L Tris.HCl (ΡΗ8.3),0.01-0.05% Prolin300 ;將離心管放置在磁力架上吸附 2 分鐘，吸出上清液備用，如果樣本當(dāng)天不使用，則要保存在-20 V條件下。
[0024]3)加樣
向含有PCR反應(yīng)液的反應(yīng)管中，分別加入陽(yáng)性對(duì)照、臨界陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、提取后樣本各30 μ 1，蓋緊管蓋，將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至檢測(cè)區(qū)，置于PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。
[0025]4) PCR 擴(kuò)增

【權(quán)利要求】
1.一種結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于:試劑盒包括磁珠法核酸提取試劑盒和TB核酸擴(kuò)增試劑盒，其中磁珠法核酸提取試劑盒包括裂解結(jié)合液、漂洗液、洗脫液、磁珠液；TB核酸擴(kuò)增試劑盒包括TB-PCR反應(yīng)液、酶混合液、TB-內(nèi)標(biāo)、陰性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述磁珠法核酸提取試劑盒中裂解結(jié)合液組成為含有十二烷基肌氨酸鈉0.5-2.5%，TritonX-100 0.5-2.5ml/100ml，異硫氰酸胍 2-6.0moI/L, EDTA (PH7.5) 1-10 mM, HCl 0.1-0.3M ；所述磁珠法核酸提取試劑盒中漂洗液組成為含有Triton X-100 0.5-2.0ml/100ml，氯化鈉0.1-0.3mol/L，60-80%乙醇；所述磁珠法核酸提取試劑盒中洗脫液組成為含有l(wèi)Ommol/LTris.HCl (PH8.3),0.01-0.05% Prolin300 ;所述磁珠法核酸提取試劑盒中磁珠液組成為直徑為I μ m的氧化硅超順納米磁珠，濃度為10-40mg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述TB核酸擴(kuò)增試劑盒中TB-PCR反應(yīng)液包括用于檢測(cè)靶基因和內(nèi)標(biāo)的探針、用于擴(kuò)增靶基因和內(nèi)標(biāo)的上游引物以及下游引物、PCR緩沖液；TB核酸擴(kuò)增試劑盒中用于檢測(cè)靶基因的探針序列為:5_ctgcccactccgaatcgtgctgacc_3 (SEQ ID NO:1), 5'端標(biāo)記為 FAM 突光發(fā)生基團(tuán)，3’端標(biāo)記為BHQl熒光淬滅基團(tuán)；用于內(nèi)標(biāo)檢測(cè)的探針序列為:5’-CAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGC-’3 (SEQ ID NO: 2)，5’端標(biāo)記為HEX熒光發(fā)生基團(tuán)，3’端標(biāo)記為BHQl熒光淬滅基團(tuán)；用于擴(kuò)增祀基因的上游引物序列為:5_tgcggatggtcgcagagatcc_3 (SEQ ID N0:3)；用于擴(kuò)增祀基因的下游引物序列為:5-agtagacgggcgacctcactg_3 (SEQ ID N0:4);用于擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的上游引物序列為:5’_ TTCGATCTCCGTCGAACCTTG-’3 (SEQ ID N0:5);用于擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的下游引物序列為:5’-ttctcaggactccagtcgcTG-’3 (SEQ ID N0:6)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述TB核酸擴(kuò)增試劑盒中 用于檢測(cè)靶基因的探針使用濃度為5-20pmol，優(yōu)選靶基因探針使用濃度為8pmol ;所述用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針使用濃度為5-20pmol，優(yōu)選內(nèi)標(biāo)探針使用濃度為Spmol ;所述用于檢測(cè)靶基因的上下游引物使用濃度為10-30pmol，優(yōu)選靶基因的上下游引物使用濃度為20pmol ;所述用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的引物使用濃度為5-20pmol，優(yōu)選內(nèi)標(biāo)引物使用濃度為8pmol。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述TB 核酸擴(kuò)增試劑盒中 PCR 緩沖液組成為 30mmol/L Tris-HCl (PH8.3)，10mmol/L(NH4)2S04,30mmol/L KCl,3mmol/L MgCl2,0.15mmol/L dNTPs。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述TB核酸擴(kuò)增試劑盒中酶混合液包括熱啟動(dòng)Taq酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG);其中熱啟動(dòng)Taq酶的用量為3-8U/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量為0.05-0.2U/人份。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中 TB 內(nèi)標(biāo)是將序列 5’ -TTCGATCTCCGTCGAACCTTGCACTCTGCATCCTGGACTCATGCTGACTGCAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGCTCTACTGCACTCCTGCGTCATCACgcgactggagtcctgagaa-’3 (SEQ ID NO:7)插入到pUC18T載體而構(gòu)成的重組體；TB內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒使用濃度為100-500copies/次,優(yōu)選使用濃度為200copies/次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒需要進(jìn)行PCR反應(yīng)，其擴(kuò)增的最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間為:50°C 2min, I個(gè)循環(huán)；95°C3min，I個(gè)循環(huán)；最后94°C 10s，60°C 30s，45個(gè)循環(huán)采集熒光信號(hào)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒檢測(cè)樣本類型為經(jīng)4% NaOH液化后的痰液樣本；試劑盒的檢測(cè)靈敏度為I菌/ml。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104164507SQ201410403854
【公開(kāi)日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年8月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月18日
【發(fā)明者】李望豐, 肖樊, 趙世源, 關(guān)爾鑫, 王丹, 蔡一榮, 曲俊杰, 董博, 趙雪楠 申請(qǐng)人:東北制藥集團(tuán)遼寧生物醫(yī)藥有限公司