專利名稱：用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及診斷領(lǐng)域，具體來說涉及用于在對(duì)象特別是兒童中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculsosis) (Mtb)感染的方法和/或用于診斷潛伏感染的方法。
相關(guān)主題 本申請(qǐng)涉及2006年3月14日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/782，364和2007年3 月14日提交的PCT申請(qǐng)NO.PCT/US2007/006534的主題，上述二者在此引為參考。
背景技術(shù)：
分枝桿菌是好氧的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌生物類屬，其在感染宿主后存活在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的內(nèi)體區(qū)室(endosomal compartments)中。人類分枝桿菌疾病包括結(jié)核病(由結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)引起)、麻瘋病(由麻瘋分枝桿菌(M. leprae)引起)、Bairnsdale 潰瘍病(由潰瘍分枝桿菌(M. ulcerans)引起)和由海分枝桿菌(Emarinum)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)、瘰病分枝桿菌(M. scrofulaceum)、蘇爾加分枝桿菌(M. szulgai)、 蟾蜍分枝桿菌(M. xenopi)、偶發(fā)分枝桿菌(M. fortuitum)、龜分支桿菌(M. chelonei)、嗜血分枝桿菌(M. haemophilum)和胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare)引起的各種感染(參見Wolinsky，E.的《微生物學(xué)包括免疫學(xué)和分子遺傳學(xué)》(Microbiology Including Immunology and Molecular Genetics)第三版中的第 37章，Harper & Row,Philadelphia, 1980)。
世界人口的三分之一帶有結(jié)核分枝桿菌，并處于發(fā)生結(jié)核病(TB)的風(fēng)險(xiǎn)中。年幼兒童具有不成比例的結(jié)核病(TB)發(fā)病負(fù)擔(dān)。一旦感染，兒童不僅比成人對(duì)TB更易感，而且更有可能發(fā)生嚴(yán)重的疾病形式。具體來說，在感染后，超過90 %的有免疫力的成人將建立無癥狀的、潛伏的TB感染(LTBI)，其具有5-10%的在壽命期內(nèi)重激活疾病的風(fēng)險(xiǎn)。然而，在大多數(shù)嬰幼兒中，原發(fā)Mtb感染將發(fā)展成活動(dòng)性TB，并且在相當(dāng)比例的患有活動(dòng)性TB的對(duì)象中，疾病將發(fā)展到更嚴(yán)重的形式(例如粟粒性TB)。除了對(duì)TB易感性增加之外，在兒童中的及時(shí)診斷因下述事實(shí)而復(fù)雜化，即患有進(jìn)行性原發(fā)感染的兒童很少呈現(xiàn)抗酸桿菌痰涂片陽性，而這在成人肺部重激活疾病中是通常能觀察到的。早期檢測(cè)是必需的，因?yàn)樵谠\斷延遲期間疾病發(fā)生進(jìn)展。
在免疫受損患者中，結(jié)核病以接近對(duì)數(shù)速率增加，并出現(xiàn)了多藥物抗性菌株。此外，以前被認(rèn)為是非病原性菌株的分枝桿菌菌株(例如鳥分枝桿菌(M. avium))現(xiàn)在已變成免疫抑制的AIDS患者的主要?dú)⑹?。此外，目前的分枝桿菌疫苗不夠好(例如用于結(jié)核分枝桿菌的BCG疫苗)或不可獲得(例如對(duì)于麻瘋分枝桿菌)(Kaufmann，S.，Microbiol. Sci. 4 324-328，1987 ；美國國會(huì)技術(shù)評(píng)估辦公室的《結(jié)核病的持續(xù)挑戰(zhàn)》(U. S. Congress, Office of Technology Assessment, The Continuing Challenge of Tuberculosis),62-67 頁， 0TA-H-574，美國政府印刷辦公室(U. S. Government Printing Office), Washington, D. C., 1993)。
抑制結(jié)核病的傳播需要有效的免疫接種和疾病的準(zhǔn)確早期診斷。目前，使用活細(xì)菌的免疫接種是誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的最有效方法。用于該目的的最常用分枝桿菌是卡介苗 (BCG)，這是牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)的無致病力菌株。但是，BCG的安全性和功效是爭(zhēng)論之源，并且某些國家例如美國不對(duì)普通公眾預(yù)防接種。
結(jié)核病的診斷通常使用皮試進(jìn)行，其涉及真皮內(nèi)暴露于結(jié)核菌素PPD(蛋白純化衍生物)。在注射后48到72小時(shí)，抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答在注射位點(diǎn)處產(chǎn)生可測(cè)量的硬結(jié)，其表明暴露于分枝桿菌抗原。但是，該測(cè)試的靈敏度和特異性不理想；用BCG免疫接種的個(gè)體不能與被感染的個(gè)體區(qū)分開。此外，它在診斷兒童或LTBI中不是特別有效。因此， 在本技術(shù)領(lǐng)域中，對(duì)用于在兒童中檢測(cè)結(jié)核病、特別是用于檢測(cè)LTBI和用于診斷TB感染的改進(jìn)的診斷方法，存在需求。
發(fā)明概述 本文公開了用于診斷結(jié)核分枝桿菌(Mtb)感染的方法。在某些實(shí)施方案中，方法用于在兒童中檢測(cè)潛伏的結(jié)核病感染(LTBI)和/或檢測(cè)Mtb感染。在其他實(shí)施方案中，方法用于檢測(cè)肺外感染。方法包括分離CD8+T細(xì)胞并檢測(cè)對(duì)目標(biāo)Mtb多肽發(fā)生特異性響應(yīng)的 ⑶8+T細(xì)胞。方法可以包括檢測(cè)細(xì)胞因子例如但不限于干擾素(IFN)-Y的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，方法利用了 ESAT-6和/或CFP-10多肽，例如但不限于在兒童中檢測(cè)結(jié)核病。
在幾個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于在對(duì)象中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的方法。這些方法可用于檢測(cè)結(jié)核病，包括肺結(jié)核病和/或肺外結(jié)核病。這些方法包括將來自對(duì)象的含有T細(xì)胞、例如CD8+T細(xì)胞的生物樣品，與一種或多種分枝桿菌多肽、或呈遞一種或多種分枝桿菌多肽的抗原呈遞細(xì)胞相接觸。所述一種或多種分枝桿菌多肽可以包括ESAT9和CFP10或其抗原性表位。所述一種或多種分枝桿菌多肽也可以包括下列所顯示的氨基酸序列(a) SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 39 或 SEQ ID NO 61 所顯示的氨基酸序列之一；或(b) SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 39 或 SEQ ID NO 61所顯示的至少一個(gè)氨基酸序列的至少9到20個(gè)連續(xù)的氨基酸，其中所述9到20 個(gè)連續(xù)的氨基酸特異性結(jié)合I類主要組織相容性復(fù)合物(MHC)；或SEQ ID NO :39-83所顯示的氨基酸序列之一。確定T細(xì)胞是否特異性識(shí)別分枝桿菌多肽。
在其他實(shí)施方案中，方法還包括將有效量的分枝桿菌多肽皮下或皮內(nèi)給藥到對(duì)象的皮膚中。分枝桿菌多肽可以是ESAT6或CFP10或其抗原性表位。分枝桿菌多肽包括下列所顯示的氨基酸序列(a) SEQ IDNO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ IDNO 5, SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ IDNO : 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :12,SEQ ID NO :31 或SEQ ID NO :61 所顯示的氨基酸序列之一；或(b) SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7,SEQ ID NO 7,SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10,SEQID NO =IUSEQ ID NO :12, SEQ ID NO :39或SEQ ID NO :61所顯示的至少一個(gè)氨基酸序列的至少9到20個(gè)連續(xù)的氨基酸，其中所述9到20個(gè)連續(xù)的氨基酸特異性結(jié)合I類主要組織相容性復(fù)合物(MHC)，或 SEQ ID NO :39-83所顯示的氨基酸序列之一。在對(duì)象中檢測(cè)特異性識(shí)別分枝桿菌多肽的T 細(xì)胞的存在。
方法還可以包括在對(duì)象中檢測(cè)遲發(fā)型超敏反應(yīng)和/或可以包括檢測(cè)特異性Mtb多肽和多核苷酸。所公開的分析可以單獨(dú)或組合使用。結(jié)核分枝桿菌感染可以是潛伏或活動(dòng)感染。
此外，描述了用于在對(duì)象中檢測(cè)分枝桿菌感染的試劑和試劑盒。
從下面參考附圖進(jìn)行的幾個(gè)實(shí)施方案的詳細(xì)描述中，上述以及其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加明顯。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是顯示了使用IFN- γ ELISP0T分析離體(ex vivo)測(cè)定人類效應(yīng)細(xì)胞頻率的兩張圖。將磁性珠純化的⑶8+T細(xì)胞與DC00，000/孔)在IFN- y ELISPOT分析中一起培養(yǎng)，所述DC或被Mtb感染(H37Rv，MOI = 50)或用呈遞CFP10的肽合并物(每種肽5 μ g/ ml, 15個(gè)單體，重疊11個(gè)氨基酸)脈沖。每個(gè)響應(yīng)性T細(xì)胞群體在四種不同的T細(xì)胞濃度下測(cè)試雙份。為了確定抗原特異性T細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞頻率，將每個(gè)雙份平行樣的每個(gè)孔的平均斑點(diǎn)數(shù)對(duì)每個(gè)孔的響應(yīng)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行作圖。使用線性回歸分析確定線的斜率，其表示抗原特異性T細(xì)胞的頻率。如果實(shí)驗(yàn)和對(duì)照分析的斑點(diǎn)數(shù)的二項(xiàng)式概率顯著不同，分析被認(rèn)為是陽性的(反映出致敏T細(xì)胞應(yīng)答的存在)。
圖2是一組顯示了對(duì)Mtb抗原的離體⑶8+T細(xì)胞頻率與Mtb感染相關(guān)的圖。如上所述(參見圖1)，為了確定離體CD8+T細(xì)胞頻率，將用Mtb感染或用同源肽合并物脈沖的自體DC與⑶8+T細(xì)胞在IFN- y ELISP0T分析中一起溫育。對(duì)沒有Mtb感染跡象的對(duì)象、患有 LTBI的對(duì)象以及患有活動(dòng)性TB的對(duì)象(培養(yǎng)物證實(shí)的肺部結(jié)核病)進(jìn)行評(píng)估。"Mtb感染” 包括患有LTBI和活動(dòng)性結(jié)核病。當(dāng)P = < 0. 05時(shí)(Wilcoxon/Kruskal-Wallis)，注明了 P 值。
圖3a到3d是一組顯示了界定抗原特異性和HLA限制性(T細(xì)胞克隆D466D6的表征)的數(shù)字圖像。對(duì)于圖3a-3c中顯示的結(jié)果來說，為了鑒定T細(xì)胞克隆D466D6所識(shí)別的抗原和最小表位，將T-細(xì)胞(5000個(gè)細(xì)胞/孔)與自體LCL (20, 000/孔)和5 μ g/ml抗原一起溫育。在共培養(yǎng)18小時(shí)后通過ELISP0T評(píng)估IFN- γ。對(duì)于圖3a中顯示的結(jié)果來說， 抗原由呈遞已知CD4+抗原的肽合并物構(gòu)成，肽合并物由15個(gè)氨基酸(aa)長、具有11個(gè)重疊氨基酸的肽組成。對(duì)于圖北中顯示的結(jié)果來說，抗原由合在一起組成肽合并物的各個(gè)15 個(gè)氨基酸的CFP10肽構(gòu)成。對(duì)于圖3c中顯示的結(jié)果來說，抗原由各個(gè)嵌套的CFPKV1Ji (10個(gè)氨基酸、9個(gè)氨基酸或8個(gè)氨基酸)構(gòu)成，用于表位的進(jìn)一步作圖。對(duì)于圖3d中顯示的結(jié)果來說，使用以CFPlO2, (5 μ g/ml)脈沖過的、在一個(gè)或兩個(gè)等位基因處表達(dá)與D466匹配的HLA等位基因的LCU20，000/孔)作為APC，鑒定限制性等位基因。2小時(shí)后，清洗細(xì)胞并與T-細(xì)胞(500個(gè)細(xì)胞/孔)在IFN- y ELISP0T分析中溫育。
圖4是顯示了確認(rèn)D466D6的最小表位作圖的線圖。為了確認(rèn)最小表位，將自體 LCL(20, 000/孔)用所標(biāo)明濃度的肽進(jìn)行脈沖，并與T-細(xì)胞(1000個(gè)細(xì)胞/孔)共培養(yǎng)。 在共培養(yǎng)18小時(shí)后通過ELISP0T評(píng)估IFN- γ。每個(gè)點(diǎn)表示兩份平行測(cè)定的平均值。
圖5是一組顯示了 CFPlO的免疫優(yōu)勢(shì)模式的分布情況(profiling)的條形圖。 為了確定效應(yīng)細(xì)胞頻率，將自體DC 00，000/孔)用每種各15聚體肽(5yg/ml)、肽合并物( ？；5118/每種肽)或從源自于每種供體的T細(xì)胞克隆確定的最小表位(ME) (D466 CFPlO2^11 ；D480 :CFP103_n ；D481 =CFPlO75^83 ；5μ g/ml)脈沖，并針對(duì) 250，000 個(gè)磁性珠純化的⑶8+T細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試。在共培養(yǎng)18小時(shí)后通過ELISP0T評(píng)估IFN-γ的釋放。每個(gè)點(diǎn)表示兩份平行測(cè)定的平均值。
圖6是一組概括了最小表位作圖數(shù)據(jù)的圖。為了確定最小表位，將自體 LCU20，000/孔)用所標(biāo)明濃度的肽脈沖，并與T-細(xì)胞(1000個(gè)細(xì)胞/孔)共培養(yǎng)。在共培養(yǎng)18小時(shí)后通過ELISP0T評(píng)估IFN- γ。每個(gè)點(diǎn)表示兩份平行測(cè)定的平均值。
圖7是顯示了 D504克隆的最小表位作圖的線圖。為了確定最小表位，將自體 LCU20，000/孔)與T-細(xì)胞克隆(1000個(gè)細(xì)胞/孔)和所標(biāo)明濃度的肽共培養(yǎng)。在共培養(yǎng) 18小時(shí)后通過ELISP0T評(píng)估IFN- γ。每個(gè)點(diǎn)表示兩份平行測(cè)定的平均值。
圖8是顯示了患有肺外(EP)TB與患有胸內(nèi)(IT)TB的烏干達(dá)兒童相比，Mtb特異性 ⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答的圖。使用干擾素(IFN) - γ特異性ELISP0T并使用ESAT-6和CFP-10肽作為抗原來源，在年齡為10歲或以下的烏干達(dá)兒童中測(cè)量Mtb特異性⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答。兒童患有EP(η = 35)或 IT TB(n = 43)。TB群體主要由淋巴結(jié)核(scofula)構(gòu)成(30/35[86% ]) 結(jié)果顯示成每250，000個(gè)貧⑶4/⑶56的外周血單核細(xì)胞(PBMC)的斑點(diǎn)形成單位(SFU)。 進(jìn)行兩份平行測(cè)定，陽性應(yīng)答被定義為高于培養(yǎng)基對(duì)照2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的應(yīng)答。
圖9是流程圖，描述了征募、受試者排除和ELISP0T的執(zhí)行與分析。*是指在HE對(duì) CP TB分析中包含的年齡組。
圖10是顯示了直到15歲的健康的暴露兒童接觸者各年齡層的⑶8和⑶4ELISP0T 應(yīng)答的比較的圖。顯示了每250，000個(gè)T細(xì)胞中高于背景的斑點(diǎn)形成單位。初始征募數(shù)顯示在圖9a中。進(jìn)行了 Cochran Armitage趨勢(shì)檢驗(yàn)對(duì)于CD8 ELISPOT, ρ = 0. 055 ；對(duì)于 PBMCELISPOT, ρ = 0.2。
圖Ila是顯示了在通過臨床研究組分層的彡10歲的烏干達(dá)兒童中陽性ELISP0T 分析的比例的圖。描繪了 HE和確診的TB(C-TB)亞組的⑶8和PBMC T細(xì)胞應(yīng)答。對(duì)于 ⑶8分析來說，患有C-TB的兒童明顯更可能具有陽性分析(p = 0. 001) [HE兒童為20% (Cl 0.09-0. 34)，相比于 C-TB 兒童的 58% (Cl 0.37-0.77)]。在比較 CP-TB 與 HE 時(shí)也注意到了這一發(fā)現(xiàn)。同樣地，對(duì)于PBMC分析來說，在C-TB臨床亞組中陽性分析的比例較高(p = 0. 02)[陽性分析的HE兒童為37% (CI0. 24-0. 50)，相比于C-TB兒童的65% (Cl 0. 42-0. 83)]。與CD8分析不同的是，當(dāng)CP-TB與HE相比時(shí)，陽性比例與HE群體沒有明顯差異。
圖lib是在通過臨床研究組和通過年齡分層的彡10歲的烏干達(dá)兒童中陽性 ELISP0T分析的比例的圖。對(duì)于< 5歲兒童中的⑶8分析來說，患有確診的TB的兒童與 HE相比更可能具有陽性CD8ELISP0T(p = 0. 009) [HE兒童為12% (Cl 0. 03-0. 31)，相比于C-TB兒童的47% (Cl 0. 24-0. 71)]。同樣地，當(dāng)CP-TB群體與HE相比時(shí)，CP-TB具有明顯更高的陽性⑶8分析比例。通過在彡5歲兒童中對(duì)PBMC分析進(jìn)行比較，陽性分析與臨床研究組不相關(guān)[HE兒童為37% (Cl 0.21-0. 55)，而C-TB為56% (Cl 0. 30-0. 78)]，無論使用 C-TB還是CP-TB進(jìn)行比較都是如此。對(duì)于> 5歲的兒童來說，數(shù)量少，因此沒有進(jìn)行比較統(tǒng)計(jì)。但是，兩種分析都鑒定到高比例的患有C-TP的兒童[對(duì)于>5歲兒童的⑶8分析來說， 具有陽性分析的 HE 為 30% (Cl 0. 11-0. 54)，相比于 C-TB 兒童的 86% (Cl 0.0.42-0.99)]。 通過在> 5歲兒童中對(duì)⑶4分析進(jìn)行比較，具有陽性分析的HE為36% (Cl 0. 17-0. 59)，而 C-TB 兒童為 100% (Cl 0. 47-1. 0)。
圖Ua-12d是一組圖，其中CD8ELISP0T結(jié)果對(duì)于< 5歲的兒童(12A)和> 5歲的兒童(12C)被表示成高于預(yù)定截止值的斑點(diǎn)形成單位(SFU)。( 5歲和> 5歲的兒童的 PBMC ELISP0T結(jié)果顯示在(12B)和(12D)中。通過CD8T細(xì)胞ELISP0T分析，患有CP-TB或 C-TB的< 5歲的烏干達(dá)兒童具有顯著且強(qiáng)烈的應(yīng)答，而健康的暴露兒童沒有表現(xiàn)出這種應(yīng)答(12A)。通過比較，在HE接觸者中存在可以通過PBMCELISP0T測(cè)量到的應(yīng)答，并且這種應(yīng)答在量值上與患有CP-TB或C-TB的兒童(12B)沒有差別。當(dāng)使用預(yù)定截止值分類分析時(shí)，患有確診的或可能的TB的< 5歲的兒童更可能具有陽性⑶8ELISP0T(p = 0. 01)，然而與PBMC ELISP0T和臨床亞組不存在類別關(guān)聯(lián)性。對(duì)于> 5歲的兒童來說，由于用于⑶8 (η =7)和PBMC(η = 5)的C-TB組中兒童數(shù)量少，沒有進(jìn)行量值和分類統(tǒng)計(jì)的比較，但是出于說明性目的顯示了 SFU。對(duì)于> 5歲的組來說，HE與CP-TB組相比，在SFU量值上或通過分類分析沒有發(fā)現(xiàn)差異(12C和12D)。量值的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用Wilx0c0n雙邊秩和檢驗(yàn)；對(duì)于分類分析來說，進(jìn)行了卡方分析。
序列表 在所附的序列表中列出的核酸和氨基酸序列，使用如37C.F.R. 1.822中所定義的核苷酸堿基的標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫和氨基酸的三字母編碼來顯示。每個(gè)核酸序列只顯示了一條鏈，但是應(yīng)該理解在提及所顯示的鏈時(shí)包含了互補(bǔ)鏈。在所附的序列表中 SEQ ID NO 1-12是Mtb多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO 13-14 是 Mtb 肽的氨基酸。
SEQ ID NO 15-25是編碼Mtb多肽的多核苷酸的核酸序列。
SEQ ID NO :26-38是特定Mtb表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO 39-83是使用的特定CFPlO和ESAT6Mtb多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO :84是示例性接頭的氨基酸序列。
詳細(xì)描述 公開了用于在對(duì)象中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的方法。對(duì)象是兒童或患有LTBI的對(duì)象。方法包括檢測(cè)T細(xì)胞、特別是特異性識(shí)別結(jié)核分枝桿菌(Mtb)多肽的CD8+T細(xì)胞的存在。方法包括用于檢測(cè)生物樣品中反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的存在的體外分析方法，并且還包括檢測(cè)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的體內(nèi)分析方法。這些方法用于在兒童中檢測(cè)結(jié)核病，包括肺結(jié)核病和肺外結(jié)核病。這些方法也用于在患有潛伏性結(jié)核病感染的成人中檢測(cè)肺外結(jié)核病。
術(shù)語 除非另外指出，否則技術(shù)術(shù)語按照常規(guī)用法使用。分子生物學(xué)常見術(shù)語的定義可見于牛津大學(xué)出版社(Oxford University Press) 1994年出版的Beniamin Lewin的《基因 V》(Genes V) (ISBN0-19-854287-9) ；Blackwell Science Ltd.公司 1994 年出版的 Kendrew等主編的《分子生物學(xué)百科全書》(The Encyclopedia of Molecular Biology) (ISBN 0-632-02182-9)和 VCH Publishers, Inc.公司 1995 年出版的 Robert A. Meyers 主編的《分子生物學(xué)和生物技術(shù)綜合桌面參考》(Molecular Biology and Biotechnology a Comprehensive Desk Reference)(ISBN 1-56081-569-8)中。
為了便于審閱本公開的各種實(shí)施方案，提供了下列具體術(shù)語的解釋 佐劑用于增加抗原性的介質(zhì)。佐劑包括在其上吸附抗原的礦物質(zhì)(明礬、氫氧化鋁或磷酸鹽)的懸液；或油包水乳液，其中抗原溶液乳化在礦物油(弗氏(Freimd)不完全佐劑)中，有時(shí)包含有殺死的分枝桿菌(弗氏完全佐劑)以進(jìn)一步增加抗原性(抑制抗原的降解和/或引起巨噬細(xì)胞流入)。免疫刺激性寡核苷酸(例如包含CpG基序的寡核苷酸) 也可以用作佐劑(例如參見美國專利No. 6，194，388、美國專利No. 6，207，646、美國專利 No. 6，214，806、美國專利 No. 6，218，371、美國專利 No. 6，239，116、美國專利 No. 6，339，068、 美國專利No. 6，406，705和美國專利No. 6，429，199)。佐劑包括生物分子(“生物佐劑”)， 例如共刺激分子。示例性佐劑包括 IL-2、RANTES, GM-CSF, TNF- α、IFN- y、G-CSF, LFA-3、 CD72、B7-1、B7-2、0X-40L 和 41BBL。
擴(kuò)增對(duì)于核酸分子(例如DNA或RNA分子)來說是指使用技術(shù)增加樣本中核酸分子的拷貝數(shù)。擴(kuò)增的實(shí)例是聚合酶鏈反應(yīng)，其中將從對(duì)象收集的生物樣品與寡核苷酸引物對(duì)在允許引物與樣品中的核酸模板雜交的條件下相接觸。引物在適合條件下延伸、 與模板解離、然后再次退火、延伸和解離，以擴(kuò)增核酸的拷貝數(shù)。擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過電泳、 限制性內(nèi)切酶切割圖樣、寡核苷酸雜交或連接、和/或使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行核酸測(cè)序來表征。擴(kuò)增的其他實(shí)例包括例如在美國專利No. 5，744，311中公開的鏈置換擴(kuò)增、在美國專利No. 6，033，881中公開的無轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增、在WO 90/01069中公開的修復(fù)鏈反應(yīng)擴(kuò)增、在 EP-A-320308中公開的連接酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增、在美國專利No. 5，427，930中公開的間隙填補(bǔ)連接酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增以及在美國專利No. 6，025，134中公開的NASBA RNA無轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。
抗原能夠在動(dòng)物中刺激抗體產(chǎn)生或T細(xì)胞應(yīng)答的化合物、組合物或物質(zhì)，包括注射或吸收到動(dòng)物中的組合物?？乖c特異性體液或細(xì)胞免疫的產(chǎn)物、包括由異源免疫原誘導(dǎo)的產(chǎn)物反應(yīng)。術(shù)語“抗原”包括所有相關(guān)的抗原性表位?！氨砦弧被颉翱乖瓫Q定簇”是指抗原上B和/或T細(xì)胞對(duì)其應(yīng)答的位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)表位呈現(xiàn)出與MHC分子相結(jié)合時(shí)，T細(xì)胞對(duì)表位發(fā)生應(yīng)答。表位可以由相鄰的氨基酸或通過蛋白質(zhì)的三級(jí)折疊而并置的不相鄰氨基酸形成。由相鄰氨基酸形成的表位典型地在暴露于變性溶劑后得以保留，而通過三級(jí)折疊形成的表位典型地在用變性溶劑處理后喪失。表位典型地包含至少3個(gè)、更通常至少5個(gè)、約9個(gè)或約8-10個(gè)處于獨(dú)特空間構(gòu)型中的氨基酸。確定表位的空間構(gòu)型的方法包括例如χ-射線晶體學(xué)和二維核磁共振。
抗原可以是組織特異性抗原或疾病特異性抗原。這些術(shù)語不是排他性的，因?yàn)榻M織特異性抗原也可以是疾病特異性抗原。組織特異性抗原在為數(shù)有限的組織中表達(dá)，例如單一組織。組織特異性抗原可以被一種以上組織表達(dá)，例如但不限于在一種以上的生殖組織中、例如在前列腺和子宮組織兩者中表達(dá)的抗原。疾病特異性抗原的表達(dá)與疾病過程同步。疾病特異性抗原的具體的非限制性實(shí)例是其表達(dá)與結(jié)核病相關(guān)或預(yù)示結(jié)核病的抗原。 疾病特異性抗原可以是被τ細(xì)胞或B細(xì)胞識(shí)別的抗原。Mtb特異性抗原對(duì)Mtb有特異性。
抗體免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有與抗原、例如 Mtb多肽特異性結(jié)合(發(fā)生免疫反應(yīng))的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。
天然存在的抗體(例如IgG、IgM、IgD)包括4條多肽鏈，通過二硫鍵互相連接的兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)。但是，已經(jīng)顯示，抗體的抗原結(jié)合功能可以由天然存在的抗體的片段來執(zhí)行。因此，術(shù)語“抗體”也打算指示這些抗原結(jié)合片段。術(shù)語抗體所涵蓋的結(jié)合片段的具體的、非限制性的實(shí)例包括(i)由HQ和Cm結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fab片段；(ii)由 Vh和Chi結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fd片段；(iii)由抗體的單臂的Vl和Vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段；(iv) 由Vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的dAb片段(Ward等，Nature 341 =544-546,1989) ； (ν)分離的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)；以及(vi)F(ab' )2片段，包含在鉸鏈區(qū)由二硫鍵相連的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段。
免疫球蛋白及其某些變體是已知的，并有許多已經(jīng)在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中制備(參見例如美國專利 No. 4，745，055 ；美國專利 No. 4，444，487 ；WO 88/03565 ；EP 256，654 ；EP 120，694 ；EP 125，023 ；Faoulkner 等，Nature 298 :286，1982 ；Morrison, J. Immunol. 123 793，1979 ；Morrison 等，Ann Rev. Immunol 2 :239,1984)。
動(dòng)物活的多細(xì)胞脊椎生物，該類別包括例如哺乳動(dòng)物和鳥類。術(shù)語哺乳動(dòng)物包括人類和非人類哺乳動(dòng)物二者。同樣地，術(shù)語“對(duì)象”包括人類和獸醫(yī)對(duì)象兩者。“兒童”是年齡小于約18歲的人類對(duì)象。在某些實(shí)施方案中，“幼兒”是年齡約1到約5歲的人類對(duì)象。 “少兒“是年齡約6到約12歲的人類對(duì)象?！皨雰骸笔悄挲g小于1歲的人類對(duì)象?！扒嗌倌辍?是年齡約13到約18歲的人類對(duì)象。“青春期前對(duì)象”尚未經(jīng)歷青春期，在某些實(shí)例中是年齡小于約11歲的人類對(duì)象。
抗原呈遞細(xì)胞(APC):能夠向T細(xì)胞呈遞抗原以便激活T細(xì)胞的細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞是參與初級(jí)免疫應(yīng)答的主要抗原呈遞細(xì)胞(APC)。它們的主要功能是獲得組織中的抗原、 向淋巴器官遷移并呈遞抗原，以便激活T細(xì)胞。
當(dāng)接收到適合的成熟指令時(shí)，樹突狀細(xì)胞接收信號(hào)以經(jīng)歷快速的形態(tài)和生理變化，促進(jìn)免疫應(yīng)答的啟動(dòng)和發(fā)展。其中包括上調(diào)參與抗原呈遞的分子；產(chǎn)生對(duì)于生成Thl應(yīng)答來說關(guān)鍵的促炎性細(xì)胞因子、包括IL-12;以及分泌幫助驅(qū)動(dòng)周圍幼稚Th細(xì)胞分化、擴(kuò)增和遷移的趨化因子?？偲饋碚f，這些上調(diào)的分子促進(jìn)了樹突狀細(xì)胞協(xié)調(diào)最終為宿主提供保護(hù)的其他周圍淋巴細(xì)胞的活化和效應(yīng)子功能的能力。
cDNA(互補(bǔ)DNA)—段缺乏內(nèi)部非編碼區(qū)段(內(nèi)含子)和決定轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列的 DNA。cDNA在實(shí)驗(yàn)室中通過從細(xì)胞提取的信使RNA的反轉(zhuǎn)錄來合成。
⑶4 分化簇因子4，一種介導(dǎo)與II類MHC分子相互作用的T細(xì)胞表面蛋白。在HIV 感染期間⑶4也作為HIV在T細(xì)胞上的主要受體位點(diǎn)。表達(dá)⑶4的細(xì)胞通常是輔助性T細(xì)胞。
⑶8 分化簇因子8，一種介導(dǎo)與I類MHC分子相互作用的T細(xì)胞表面蛋白。表達(dá) ⑶8的細(xì)胞通常是細(xì)胞毒性T細(xì)胞?！阿?+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫”是通過向⑶8+T細(xì)胞呈遞抗原而執(zhí)行的免疫應(yīng)答。
cDNA(互補(bǔ)DNA)—段缺乏內(nèi)部非編碼區(qū)段(內(nèi)含子)和決定轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列的 DNA。cDNA在實(shí)驗(yàn)室中通過從細(xì)胞提取的信使RNA的反轉(zhuǎn)錄來合成。
保守變體“保守”氨基酸取代是基本上不影響或降低分枝桿菌多肽的活性或抗原性的氨基酸取代。保守取代的具體的、非限制性的實(shí)例包括下述例子
原始?xì)埢Ｊ厝〈?
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)人類對(duì)象中結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的方法， 其包含從來自疑似患有結(jié)核病的人類兒童或來自疑似具有結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的人類對(duì)象的生物樣品分離CD8+T細(xì)胞；以及將CD8+T細(xì)胞與一種或多種分枝桿菌多肽相接觸；確定CD8+T細(xì)胞是否特異性識(shí)別分枝桿菌多肽，其中特異性識(shí)別分枝桿菌多肽的T細(xì)胞的存在檢測(cè)出對(duì)象中的結(jié)核分枝桿菌，從而將兒童鑒定為患有結(jié)核病，或?qū)?duì)象鑒定為具有結(jié)核分枝桿菌潛伏感染。
2.權(quán)利要求1的方法，其中兒童的年齡小于5歲，或其中兒童的年齡是5到10歲。
3.權(quán)利要求1的方法，其中兒童是嬰兒。
4.權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)象疑似具有結(jié)核分枝桿菌潛伏感染。
5.權(quán)利要求1的方法，其中兒童疑似患有肺結(jié)核病。
6.權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)的方法，其中對(duì)象或兒童疑似具有結(jié)核分枝桿菌的肺外感染。
7.權(quán)利要求6的方法，其中肺外感染包括淋巴結(jié)炎、胸膜結(jié)核、骨和關(guān)節(jié)結(jié)核、中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核、腹部結(jié)核、粟粒性結(jié)核或結(jié)核性心包炎。
8.權(quán)利要求6-7任一項(xiàng)的方法，其中對(duì)象是青春期前的少年。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中確定CD8+T細(xì)胞是否特異性識(shí)別分枝桿菌多肽包含測(cè)量細(xì)胞因子的表達(dá)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中細(xì)胞因子是干擾素-Y(IFN-Y)0
11.權(quán)利要求10的方法，其中測(cè)量IFN-Y的表達(dá)使用特異性結(jié)合IFN-γ的抗體進(jìn)行測(cè)定。
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種分枝桿菌多肽包含下列所顯示的氨基酸序列(a)SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO :7,SEQ ID NO :8、SEQ IDNO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12, SEQ ID NO 39或SEQ ID NO :61所顯示的氨基酸序列之一；或(b)SEQID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO :7, SEQ ID N0:7、SEQ IDNO :8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :39或SEQ ID NO :61所顯示的至少一個(gè)氨基酸序列的至少9到 20個(gè)連續(xù)的氨基酸，其中所述9到20個(gè)連續(xù)的氨基酸特異性結(jié)合I類主要組織相容性復(fù)合物(MHC)；以及(c)SEQID NO :39-83所顯示的氨基酸序列之一。
13.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中分枝桿菌多肽包含SEQIDNO :39所顯示的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中分枝桿菌多肽包含SEQIDNO :61所顯示的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中分枝桿菌多肽包含SEQIDNO :39所顯示的氨基酸序列特異性結(jié)合I類主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的9到20個(gè)連續(xù)氨基酸。
16.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中分枝桿菌多肽包含SEQIDNO :61所顯示的氨基酸序列特異性結(jié)合I類主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的9到20個(gè)連續(xù)氨基酸。
17.權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的方法，其中生物樣品是血液、分離的外周血單核細(xì)胞、分離的單核細(xì)胞、痰液、肺活檢樣本、淋巴結(jié)活檢樣本、唾液、腦脊液或分離的CD3+T細(xì)胞。
18.權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的方法，其中將CD8+T細(xì)胞在體外與分枝桿菌多肽共同培養(yǎng)。
19.權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的方法，其還包括檢測(cè)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。
20.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的方法，其還包括在來自對(duì)象的樣品中檢測(cè)分枝桿菌多肽或編碼多肽的多核苷酸的存在，其中分枝桿菌多肽包含SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ IDNO 9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、或 SEQ ID NO :39-83 之一所顯示的氨基酸序列之一所示的氨基酸序列。
21.權(quán)利要求19的方法，其包含檢測(cè)分枝桿菌多肽的存在。
22.權(quán)利要求21的方法，其中檢測(cè)分枝桿菌多肽的存在包含使用特異性結(jié)合分枝桿菌多肽的抗體。
23.權(quán)利要求20的方法，其包含檢測(cè)多核苷酸的存在。
24.權(quán)利要求23的方法，其中確定多核苷酸的存在包含使用聚合酶鏈反應(yīng)。
25.一種檢測(cè)對(duì)象中特異性結(jié)合分枝桿菌多肽的表達(dá)CD8的T細(xì)胞的方法，其中對(duì)象是兒童、疑似具有潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染的對(duì)象、或疑似具有肺外結(jié)核分枝桿菌感染的對(duì)象，所述方法包含(A)將從對(duì)象分離到的外周血單核細(xì)胞與試劑相接觸，所述試劑包含(1)分枝桿菌多肽，其包含SEQID NO =USEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ IDNO :11 或 SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO 61 或 SEQ IDNO :39-83 任一個(gè)所顯示的至少一個(gè)氨基酸序列的至少9到20個(gè)連續(xù)的氨基酸，其中所述9到20個(gè)連續(xù)的氨基酸特異性結(jié)合I類主要組織相容性復(fù)合物(MHC)；(2)HLA重鏈多肽和β 2-微球蛋白；以及(3)鏈親和素，其中試劑是標(biāo)記或未標(biāo)記的；并且(B)檢測(cè)與外周血單核細(xì)胞結(jié)合的試劑的存在，由此檢測(cè)特異性結(jié)合分枝桿菌多肽的表達(dá)⑶8的T細(xì)胞。
26.權(quán)利要求25的方法，其還包含對(duì)結(jié)合試劑的CD8+T細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行定量。
27.權(quán)利要求25的方法，其中試劑是標(biāo)記的。
28.權(quán)利要求25的方法，其中試劑用熒光團(tuán)標(biāo)記。
29.權(quán)利要求25的方法，其中對(duì)象是兒童，并且其中檢測(cè)到特異性結(jié)合分枝桿菌多肽的表達(dá)CD8的T細(xì)胞表明所述兒童患有肺結(jié)核病。
全文摘要
公開了用于在對(duì)象中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(Mtb)感染的方法，其中對(duì)象是兒童，具有潛伏的結(jié)核分枝桿菌感染的對(duì)象。還公開了用于在對(duì)象中檢測(cè)肺外結(jié)核分枝桿菌感染的方法。方法包括檢測(cè)特異性識(shí)別Mtb多肽的CD8+T細(xì)胞的存在。方法包括用于在生物樣品中檢測(cè)CD8+T細(xì)胞存在的體外分析。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102187224SQ200980137173
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2009年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月22日
發(fā)明者德波拉赫·A·樂文索恩, 戴維·M·樂文索恩 申請(qǐng)人:俄勒岡健康科學(xué)大學(xué), 美國政府退役軍人事務(wù)部