專利名稱：一種牛結核桿菌抗體免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明提供一種牛結核桿菌抗體免疫膠體金檢測試紙條，用于動物結核桿菌抗體 的檢測，本發(fā)明還公開了上述試紙條的制備方法，屬于血清學檢測技術領域。
背景技術：
牛結核病的檢測，在我國主要靠血清學變態(tài)反應(GB/T 18645-2002)，該檢測方法 人為操作因素大，主要靠眼觀，主觀因素較多，誤差較高。另外，傳統(tǒng)的方法還不能把接種 BCG的牛，從感染野毒菌的牛區(qū)分開來，對流行病學調查，疫源的布控帶來了嚴重的干擾。因 此發(fā)明一種方便、快捷、準確，并能區(qū)分人與動力是野毒感覺還是接種BCG的診斷方法和診 斷工具有重要的現(xiàn)實意義。CFPlO基因和MPT64基因只存在于致病性結核分枝桿菌群(包括人型結核桿菌、牛 型結核桿菌和非洲分枝桿菌)，而人與動物所用的結核菌病疫苗BCG菌株缺乏這些基因(或 者基因沉默)。并且CFP10、MPT64蛋白在人與動物身上表現(xiàn)出高免疫原性。因此CFPlO蛋 白和MPT64蛋白可以作為診斷動物和人致病性結核分枝桿菌感染的特異性診斷試劑。免疫膠體金技術自問世以來，得到了迅速發(fā)展。已廣泛應用于免疫組織(或細胞) 化學檢測和免疫學檢測領域，特別是膠體金免疫層析技術具有操作簡單、檢測快速靈敏、結 果清楚，易于判斷和保存，且無需任何儀器設備等優(yōu)點，適合于臨床的快速診斷和基層、農(nóng) 村等流行病學調查大規(guī)模應用。經(jīng)檢索未見有結核桿菌抗體免疫膠體金檢測試紙條公開的文獻報道。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是公開一種檢測結核桿菌抗體免疫膠體金試紙條，解決了當前結核 桿菌病檢測特異性低，不準確、誤差多、靈敏度低的缺點，不能區(qū)分人與動物是野毒感染還 是人工感染。本發(fā)明還提供了上述試紙條的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的檢測結核桿菌抗體免疫膠體金檢測試紙條，是以金黃色葡萄球菌A蛋白 (SPA)標記膠體金制作金標墊，以結核桿菌CFPlO和MPT64蛋白包被硝酸纖維膜作為檢測抗 原線(T)，用兔抗牛IgG作為質控線(C)。本發(fā)明檢測試紙條的制備方法如下用金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)標記膠體金技術制作金標墊。再克隆出結核桿菌 CFPlO和MPT64基因，把它連接到原核表達載體pET_28a上，而后把重組質粒轉化大腸桿菌 中，表達并純化出CFPlO和MPT64蛋白，用純化的CFPlO和MPT64蛋白包被硝酸纖維膜作為 檢測線抗原線(T)；檢測牛時用兔抗牛工gG作為質控線(C)，即得檢測試紙條。本發(fā)明用純化的CFPlO和MPT64蛋白為檢測抗原，就能特異性的檢測出動物血清 中是否含有結核桿菌抗體，而接種BCG的人與動物卻沒有該抗體。用純化的CFPlO和MPT64 蛋白進一步的制備出膠體金試紙條，保留了其特異性強的特點，并增強了其靈敏度高、穩(wěn)定性。本發(fā)明結核桿菌抗體檢測膠體金試紙條的積極效果在于檢測特異性高、靈敏度高、準確性高、穩(wěn)定性好、方便、快捷，并能區(qū)分人與動物是自然感染還是接種了 BCG。具有操 作簡單、檢測快速、結果清楚，易于判斷和保存，且無需任何儀器設備等優(yōu)點，適合于臨床的 快速診斷和基層、農(nóng)村等流行病學調查大規(guī)模應用。
圖1為膠體金抗體檢測試紙條測試結果圖片。
具體實施例方式下列實施例旨在進一步舉例說明，而不是限制本發(fā)明。本領域技術人員可以理解 至IJ，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明的任何平行改變和改動都將落入本 發(fā)明的待批權利要求范圍內。實施例1膠體金探針的制備1、材料及方法(1)兔抗牛IgG購自北京鼎國生物技術有限公司；兔抗牛IgG、購自北京意宏安生 物科技有限公司；蛋白定量試劑盒購自聯(lián)星生物科技公司。(2)膠體金的制備采用檸檬酸鈉還原法，取硅化過的三角瓶，加入IOOmL去離子及ImL 1 %氯金酸， 微波爐加熱沸騰；迅速加入不同劑量的檸檬酸三鈉，此時可觀察到淡黃色的氯金酸水 溶液很快變成灰色，續(xù)而轉成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過程約3min，繼續(xù)煮沸15min， 冷卻后用去離子水補足體積至100mL。電鏡下觀察膠體金顆粒的平均直徑、分散程度及均勻度。 (3)膠體金標記SPA探針的制備取IOOmL三角瓶，加入50mL膠體金；三角瓶中加入磁性轉子后放置在磁力攪拌器 上，開啟攪拌器邊攪拌邊加入0. lmol/L K2CO3，調pH至6. 2左右；根據(jù)膠體金總量計算出所 要標記的SPA總量。加入金標抗體封閉液，加入10%穩(wěn)定劑BSA至終濃度為1 %，繼續(xù)攪拌 35min ；然后4°C，3000rpm離心30min，棄沉淀；上清液4°C，13000rpm離心，40min，棄上清加 入金標抗體洗滌液重懸沉淀；4°C，13000rpm離心，40min，棄上清，重復洗滌2 3次，最后 的沉淀物用金標保存液做適量稀釋。(4)金標墊的制備選用優(yōu)質的玻璃纖維膜浸入O.Olmol/L PBS(pH6. 2)+1% BSA+0. 2% Tween-20+0. 05mol/LNaCl配置的溶液中，37°C浸泡30min，取出置常溫條件下通 風干燥，干燥條件下保存?zhèn)溆?。將處理好的玻璃纖維素膜切割成0. 55cm左右寬的長條，長度依需要而定。稱取蔗 糖少量，將其加到上述制備的膠體金標記SPA探針溶液中，使之充分溶解混勻，然后均勻地 加到玻璃纖維膜上，4°C放置4h，在低溫條件下風干，即為金標墊。(5)為了更好完成上述試驗，應補充以下實驗。SPA與膠體金結合的最佳pH的確定用0. lmol/L K2C03結合精密pH試紙調節(jié)膠體金溶液PH依次為4. 0-9. 0，每隔0. 5個pH值為一個檢測梯度。每管加入lmg/mL的SPA 50 μ L，在振蕩器上混勻，室溫下放置20分鐘。然后每孔分別加入100 μ L 10% Nacl溶液， 混勻，室溫放置4h，觀察膠體金顏色變化，記錄保持和空白對照顏色一致的最低pH，即為最 佳的標記pH。SPA與膠體金結合的最佳標記量確定取1. 5mL離心管若干，分別加入已調整為最佳標記pH(6. 2)的膠體金lmL，各管依次加入0、5、10、15、· · ·、50yL濃度為1. Omg/mL的 SPA,振蕩器上混勻，室溫放置20min。然后每孔加入100 μ L的10% Nacl溶液，室溫下放置 lh，觀察顏色變化，顏色仍保持紅色的最小蛋白量即為最佳蛋白標記量。(6)膠體金標記SPA探針的鑒定用有Formvar膜的鎳網(wǎng)沾取金標蛋白溶液，空氣中干燥后磷鎢酸復染，透射電鏡 下觀察。2、結果膠體金偶聯(lián)SPA后在電鏡下觀察，可見金顆粒外周有明顯的低電子密度暈圈，表 明金顆粒表面吸附有蛋白質。實施例2結核桿菌CFPlO和MPT64蛋白基因的克隆、表達及CFPlO和MPT64蛋白的純化1、材料與方法(1)菌株及質粒結核桿菌S19、大腸桿菌DH5a、大腸桿菌BL21(DE3)和pET28a+載體由軍事醫(yī)學科 學院第11所5室保存，pMD18-T simple vector購自TakaRa公司。(2)相關分子生物學操作細菌總DNA的提取、PCR擴增、質粒重組、大腸桿菌感受態(tài)制備、轉化、質粒提取等 操作按《分子克隆》所述方法進行；T4連接酶、DNA的回收純化按照試劑盒說明書進行(購 自TakaRa公司)；DNA測序委托上海生工生物工程公司完成。(3) CFPlO和MPT64基因的擴增及克隆設計5'端帶有限制性內切酶Nde I位點的上游引物5， -catatggctgatctcgcaaagatcgtt-3，和Sal I酶切位點的下游引物5， -gtcgacttacttgagttcaaccaaggc-3，，以結核桿菌S19基因組DNA中為模板擴增CFPlO和MPT64基因。反應條件95°C預 變性5min，94°C變性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸lmin，30個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。 將PCR產(chǎn)物與pMD18-T simple vector連接構建重組質粒pMDCFPIO和MPT64。(4)重組質粒pETCFPIO和MPT64的構建用限制性內切酶Nde I與Sal I同時消化pMDCFPIO和MPT64與pET28a+，分別凝 膠回收純化CFP10和MPT64與線性化的pET28a+基因片段。用T4連接酶使之連接，而成重 組質粒 pETCFPIO 和 MPT64。(5)蛋白的SDS-PAGE分析及純化將重組表達質粒pETCFPIO和MPT64轉化大腸桿菌LB21 (DE3)中，挑取陽性克隆菌 在LB培養(yǎng)基中，37°C 180rpm振蕩培養(yǎng)過夜，而后1 100的比例接種至5mL LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 38，加入IPTG至終濃度lmmol/L，誘導表達4h后收菌。將1. 5mL菌液 離心取沉淀加入50 μ L滅菌水和50 μ L 2 X SDS蛋白上樣緩沖液，震蕩混勻后沸水煮15min 后稍離心，取上請20 μ L進行12%的SDS-PAGE分析。經(jīng)組氨酸結合樹脂柱純化回收可溶性 蛋白，得到高純度的蛋白，蛋白電泳可見單一蛋白條帶。2、結果
1. CFPlO 和 ΜΡΤ64 蛋白純化后 SDS-PAGE 檢測將層析純化的CFPlO和ΜΡΤ64蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測可見一清晰條帶，經(jīng)凝膠掃描 純度96%。實施例3結核病高特異性免疫膠體金抗體檢測試紙條組裝及測試1、材料方法(1)材料 2992,903,8964 型樣品墊(sample pad)、Ahlstrom 8964 型玻璃纖維 膜(conjugate release membrane)、Sartorius CN140、AE99 禾口 PRIMA60 型 肖酸纖維素 膜(nitrocellulose membrane)、470 禾口 2727 型吸水塾(absorbent pad)、6cmX30cm、 8emX30cm型PVC底板均為上海金標生物科技有限公司產(chǎn)品。(2)樣品墊的處理取優(yōu)質的樣品墊浸入0. 01mol/L PBS (pH為7. 4)加入0. 05%的Tween-20配成的 溶液中，37°C浸泡30min，取出置常溫條件下通風干燥，干燥條件下保存?zhèn)溆谩?3)硝酸纖維膜的處理將硝酸纖維膜浸入有甲醇溶液內浸泡lOmin，取0. 01mol/2222LPBS (pH7. 4)、BSA, Tween-20, NaCl、蔗糖配置硝酸纖維膜的處理液，調節(jié)溶液的最終pH值為6. 5左右；將膜 37°C浸泡30min，PBS洗滌數(shù)次，置于低溫條件下風干，徹底干燥。(4) T線及C線的點膜方法將純化好的CFP10和MPT64蛋白和羊抗牛IgG用最佳緩沖液分別稀釋至最佳濃 度。將稀釋好的CFP10和MPT64蛋白溶液裝入BI0D0T劃膜機噴頭2，固定在距硝酸纖維膜 下邊緣1. Icm的位置上，稀釋好的用兔抗牛IgG(檢測牛時)或兔抗羊IgG(檢測羊時)裝 入BI0D0T劃膜機噴頭1，固定在距硝酸纖維膜下邊緣1. 6cm的位置上。T線與C線間的距 離為5. 0mm,參數(shù)均為1. 0 μ L/cm噴在硝酸纖維膜上。將已噴好的硝酸纖維膜4°C放置待風 干后備用。(5) T線及C線條件的優(yōu)化設置幾組不同的抗體濃度對硝酸纖維膜的T線(檢測線)和C線(質控線)進行 優(yōu)化，選出最優(yōu)的一組作為金標濃度(T線)和包被濃度(C線)。并對T線與C線噴膜量、 噴膜速度等因素進行優(yōu)化。(6)試紙條的組裝按照底板上劃定的樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜及吸水紙的尺寸，裁定符合要求 的材料和制備相關的金標墊。將包被好的硝酸纖維膜粘到PVC底板上，小心抹平膜面。將 金標墊緊靠硝酸纖維膜下邊緣粘到PVC底板上。將樣品墊一部分重疊在金標墊上一起粘到 PVC底板上，并對齊抹平。將吸水紙緊一部分重疊在硝酸纖維膜下邊緣粘到PVC底板上，并 對齊抹平。用切條機切成3. 5mm寬的試紙，在裝配區(qū)將切好的試紙放入裝有干燥劑的包裝袋內。2、結果取一滴待檢血清樣本滴加在制備好的試紙條的加樣區(qū)，樣品開始在硝酸纖維素膜 上擴散，待金標墊釋放完全后，硝酸纖維素膜上出現(xiàn)了清晰的T線和C線。 實施例4膠體金抗體檢測試紙條性能的測定及實踐1、膠體金抗體檢測試紙條敏感性將長春市某奶牛場提供的確診牛血清，將其稀釋到4000倍，膠體金試紙條檢測呈 陽性結果，血清稀釋度超過4000倍時，試紙條檢測顯色不清晰(如圖1)；其中，1、2為陰性 對照，3、4為稀釋2000陪血清檢測結果，5、6為稀釋4000陪血清檢測結果。膠體金試紙條 的靈敏度符合本發(fā)明的要求。2、膠體金抗體檢測試紙條重復性進行8次重復試驗，檢測結果相一致，說明該方法具有可重復性。3、膠體金抗體檢測試紙條穩(wěn)定性4°C放置的布病膠體金檢測試紙條定期以標準陽性樣本檢測，結果顯示60天以前 的均呈穩(wěn)定的陽性反應達到本發(fā)明的目的。
權利要求
一種結核桿菌抗體免疫膠體金檢測試紙條，特征在于以金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)標記膠體金制作金標墊，以結核桿菌CFP10和MPT64蛋白包被硝酸纖維膜作為檢測抗原線(T)，用兔抗牛IgG或兔抗羊IgG作為質控線(C)。
2.權利要求1所限定的膠體金試紙條制備方法，主要包括以下步驟(1)用SPA標記膠體金，制備成膠體金探針，把它噴在玻璃纖維膜上制成膠體金墊；(2)設計一對引物，以牛結核桿菌基因組為模板，用PCR擴增、并純化出CFPlO和MPT64 基因；(3)把步驟(2)中所得基因連接到質粒pET-28a的NdeI和Sal I位置上，構建成原核 表達重組質粒，轉化到大腸桿菌中，表達出CFPlO和MPT64蛋白；用His-Trp純出CFPlO和 MPT64蛋白；(4)用(3)中的純化的CFPlO和MPT64蛋白為診斷抗原包被硝酸纖維膜作為本發(fā)明膠 體金試紙條的檢測線(T線)，用兔抗牛IgG (檢測牛時)或兔抗羊IgG(檢測羊時)、作為質 控線(C線)；(5)將樣品墊、結合墊、硝酸纖維膜、吸水濾紙按從上到下依次固定于PVC板上，制備成 檢測試紙條。
全文摘要
本發(fā)明公開一種結核桿菌抗體免疫檢測膠體金試紙條及其制備方法。用金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)標記膠體金制成膠體金抗體檢測試紙條的金膠墊。CFP10和MPT64蛋白是致病性結核桿菌高特異性、免疫原性蛋白。從結核桿菌基因組中克隆出CFP10和MPT64基因，把它連接到pET-28a上，構建成兩個原核表達重組質粒，把這兩個質粒轉化到大腸桿菌中，表達出CFP10和MPT64蛋白，蛋白純化后，以混合蛋白為抗原包被硝酸纖維膜作為檢測線，同金膠墊一起裝備成本發(fā)明的免疫膠體金試紙條。本發(fā)明試紙條能區(qū)分人與動物是接種BCG還是野毒感染?？捎糜跈z測動物血清中的結核桿菌抗體，具有特異性強，靈敏度高、穩(wěn)定性好、方便、快捷的特點，對結核桿菌的監(jiān)測、診斷、凈化和控制具有重要意義和實際應用價值。
文檔編號G01N33/558GK101846677SQ20091021815
公開日2010年9月29日 申請日期2009年12月30日 優(yōu)先權日2009年12月30日
發(fā)明者宮鵬濤, 張楠, 張西臣, 李建華, 楊舉, 閆廣謀 申請人:吉林大學