一種結(jié)核分枝桿菌細胞破碎方法
【專利說明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于分子診斷醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是涉及一種利用化學(xué)試劑和立體超聲波提取RNA的結(jié)核分枝桿菌細胞破碎方法。
[0002]技術(shù)背景:
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病，可侵及許多臟器.以肺部結(jié)核感染最為常見?；仡櫺哉{(diào)查結(jié)果顯示，我國結(jié)核病的誤診率可達24.1%，所以，提高實驗室檢測能力，促進早謗斷、早治療是有效控制結(jié)核病蔓延的必要措施。RNA在細胞中含量大，且易降解，既可作為活菌檢測的標志物，又可提高檢測靈敏度，可作為結(jié)核分枝桿菌檢測的理想標志物。在實驗前，需對用于檢測的痰液樣本進行前處理，破壞細胞釋放RNA分子用于檢測，于此同時，還需保證目標RNA分子的活性，確保此過程中RNA分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
[0003]目前市場上常用的生物醫(yī)療方面的破碎方法可歸納為化學(xué)法和機械法兩大類。
[0004]化學(xué)法包括滲透壓沖擊破碎法、酶溶破碎法等，一般均需要使用大量的化學(xué)試劑?；瘜W(xué)試劑應(yīng)用的優(yōu)勢是破碎效率高，但存在兩個方面的不足:一是不容易控制實驗操作的進程.對于操作環(huán)境的要求較高，實驗結(jié)果不夠穩(wěn)定:二是化學(xué)試劑屬于常規(guī)易消耗的試劑，加大了檢測實驗操作的成本，增加了醫(yī)療患者的檢測負擔(dān)；三是大量的化學(xué)試劑易產(chǎn)生環(huán)境污染。
[0005]機械法包括高壓勻漿破碎法、高速攪拌珠研磨破碎法、超聲波破碎法等，一般均不需要使用化學(xué)試劑。機械破碎法不但降低了使用化學(xué)試劑的高額成本.還減小了環(huán)境污染的風(fēng)險，具有操作簡單、成本低、綠色環(huán)保的優(yōu)點。目前的機械破碎法如高壓勻漿破碎法提取的對象是細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，并不能提取出細胞內(nèi)的RNA。高速攪拌珠研磨破碎法、超聲波破碎法的提取對象是RNA.但僅使用機械破碎法進行細胞破碎時，破碎程度不宜掌握.功率選擇低時，細胞破碎不夠完全，不能很好地提取出細胞內(nèi)的RNA ;但功率選擇過高時，會破壞細胞內(nèi)的RNA分子結(jié)構(gòu)。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)核分枝桿菌細胞破碎方法，其具有操作簡單、成本低廉、可靠性高、安全性好、環(huán)境污染小的優(yōu)點，可應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的快速提取和檢測判斷。
[0007]本發(fā)明在采集的痰液樣本中加入氫氧化鈉溶液，通過震蕩混勻，去除痰液樣本表面的粘蛋白成分，降低樣本的粘性，再經(jīng)過高速離心處理，提取出樣本中的結(jié)核分枝桿菌細胞，便于后期的處理和檢驗。
[0008]將待測樣本放入超聲波破碎裝置，加入超聲介質(zhì)為水(溫度為常溫)，超聲破碎15分鐘，借助介質(zhì)傳播的超聲能量，破壞結(jié)核分技桿菌細胞結(jié)構(gòu)，釋放出RNA ;所述的化學(xué)破碎法使用的氫氧化鈉溶液質(zhì)量百分濃度為1%?10% ;所述的機械破碎法超聲波破碎裝置的超聲額定功率為200?350w，頻率20?60 KHz，功率調(diào)整范圍為額定功率的O?100%，超聲介質(zhì)水的溫度在55°C以下，優(yōu)選為常溫。
[0009]超聲破碎是利用超聲對細胞的熱效應(yīng)、機械效應(yīng)和空化效應(yīng)。熱效應(yīng)是超聲在水介質(zhì)中傳播時，介質(zhì)分子之間的摩擦力阻礙了超聲波引起的分子震動，使部分傳遞的能量轉(zhuǎn)化為熱能，直接效果就是傳遞介質(zhì)的溫度緩慢上升，滿足結(jié)核分枝桿菌細胞破碎適宜的溫度條件。機械效應(yīng)是利用超聲波的原發(fā)效應(yīng)，即在介質(zhì)中傳播時介質(zhì)質(zhì)點交替地收縮和伸張構(gòu)成了壓力變化，引起細胞結(jié)構(gòu)損傷。空化效應(yīng)是細胞在超聲波的傳遞中，生物內(nèi)形成大量的氣泡，氣泡隨著超聲震動和不斷地聚爆而產(chǎn)生出機械剪切壓力和能量，同時氣泡爆破時產(chǎn)生瞬時的5000°C高溫、5MPa高壓，使水蒸氣熱解離導(dǎo)致多聚物降解、酶失活、脂質(zhì)過氧化和細胞殺傷。
[0010]本發(fā)明具體以下優(yōu)點:
1、本發(fā)明同時使用化學(xué)破碎法和機械破碎法，具有操作簡單、成本低廉、可靠性高、安全性好、環(huán)境污染小的優(yōu)點。
[0011]2、化學(xué)破碎法進行痰液采集樣本的前處理，使用普遍的氫氧化鈉溶液加入至樣本中，通過震蕩混勻后高速離心處理，即可從采集樣本中提取出結(jié)核分枝桿菌細胞，操作簡單快捷、成本低廉。
[0012]3、機械破碎法是對已經(jīng)完成前處理的結(jié)核分枝桿菌細胞進行細胞破碎，采用超聲波破碎法對細胞的熱效應(yīng)、機械效應(yīng)和空化效應(yīng)，給予適宜的破碎溫度和細胞破碎功率，釋放出RNA，安全高效。
[0013]【具體實施方式】:
以下實施例僅用于更加清楚地說明本方面的技術(shù)方案，而不能以此來限制本說明的保護范圍。
[0014]本發(fā)明的破碎法是化學(xué)法和機械法的融合，首先采用化學(xué)破碎法進行采集痰液樣本的前處理，提取出樣本中的結(jié)核分枝桿菌細胞，再使用機械法超聲波破碎細胞的細胞結(jié)構(gòu)，釋放出RNA，具體實施步驟:
(1)取膿樣、干酪樣或膿性粘液樣性質(zhì)的痰液樣本；
(2)根據(jù)采集痰液樣本的粘稠度，向樣本中加入I?2倍體積的4%氫氧化鈉溶液，漩渦震蕩搖勻I分鐘，使樣本和氫氧化鈉溶液充分混合，去除痰液樣本表面的粘蛋白成分，降低樣本的粘性，室溫下放置15?20分鐘:
(3)將痰液樣本進行高速離心，棄上層清液，加入生理鹽水重新洗滌，洗去樣本中的雜質(zhì)，提取出所需結(jié)核分枝桿菌細胞，便于后續(xù)的提取和檢測；
(4)將待測樣本放入超聲波破碎裝置，加入超聲介質(zhì)為水，超聲破碎15分鐘，借助介質(zhì)傳播的超聲能量，破壞結(jié)核分技桿菌細胞結(jié)構(gòu)，釋放出RNA。
[0015]所述的化學(xué)破碎法使用的氫氧化鈉溶液質(zhì)量百分濃度為I %?10 %。
[0016]所述的機械破碎法超聲波破碎裝置的超聲額定功率為200?350w，頻率20?60KHz，功率調(diào)整范圍為額定功率的O?100%，借助介質(zhì)傳播的超聲能量.破壞結(jié)核分枝桿菌細胞結(jié)構(gòu)，釋放出RNA。
[0017]所述的超聲介質(zhì)水的溫度在55°C以下，優(yōu)選為常溫，保證釋放出的RNA的結(jié)構(gòu)完整，活性不受影響。
【主權(quán)項】
1.一種結(jié)核分枝桿菌細胞破碎方法，其特征在于:包括化學(xué)破碎法和機械破碎法，所述化學(xué)破碎法對痰液采集樣本進行前處理，機械破碎法是對已經(jīng)完成前處理的樣本進行細胞破碎。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌細胞破碎方法，其特征在于:所述的化學(xué)破碎法包括如下步驟: (1)取膿樣、干酪樣或膿性粘液樣性質(zhì)的痰液樣本； (2)根據(jù)采集痰液樣本的粘稠度，向樣本中加入I?2倍體積的氫氧化鈉溶液，漩渦震蕩搖勾I分鐘，使樣本和氫氧化鈉溶液充分混合，去除痰液樣本表面的粘蛋白成分，降低樣本的粘性，室溫下放置15?20分鐘: (3)將痰液樣本進行高速離心，棄上層清液，加入生理鹽水重新洗滌，洗去樣本中的雜質(zhì)，提取出所需結(jié)核分枝桿菌細胞，便于后續(xù)的提取和檢測。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌細胞破碎方法，其特征在于:所述的機械破碎法包括如下步驟:將待測樣本放入超聲波破碎裝置，加入超聲介質(zhì)為水，超聲破碎15分鐘，借助介質(zhì)傳播的超聲能量，破壞結(jié)核分技桿菌細胞結(jié)構(gòu)，釋放出RNA。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)核分枝桿菌細胞破碎法及其裝置，其特征在于:所述的化學(xué)破碎法使用的氫氧化鈉溶液質(zhì)量百分濃度為I %?10 %。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)核分枝桿菌細胞破碎法及其裝置，其特征在于:所述的機械破碎法超聲波破碎裝置的超聲額定功率為200?350w，頻率20?60 KHz，功率調(diào)整范圍為額定功率的O?100%。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)核分枝桿菌細胞破碎法及其裝置，其特征在于:超聲介質(zhì)水的溫度在55°C以下，優(yōu)選為常溫。
【專利摘要】一種結(jié)核分枝桿菌細胞破碎方法，包括化學(xué)破碎法和機械破碎法，所述化學(xué)破碎法對痰液采集樣本進行前處理，機械破碎法是對已經(jīng)完成前處理的樣本進行細胞破碎；所述的化學(xué)破碎法包括如下步驟：(1)取膿樣、干酪樣或膿性粘液樣性質(zhì)的痰液樣本；(2)根據(jù)采集痰液樣本的粘稠度，向樣本中加入l～2倍體積的氫氧化鈉溶液，漩渦震蕩搖勻1分鐘，使樣本和氫氧化鈉溶液充分混合，室溫下放置15～20分鐘；(3)將痰液樣本進行高速離心，棄上層清液，加入生理鹽水重新洗滌，洗去樣本中的雜質(zhì)，提取出所需結(jié)核分枝桿菌細胞；本發(fā)明操作簡單、成本低廉、可靠性高、安全性好、環(huán)境污染小的優(yōu)點。
【IPC分類】G01N1/28
【公開號】CN105004585
【申請?zhí)枴緾N201510342940
【發(fā)明人】居建華, 周進, 居金良, 李海濤
【申請人】靖江市華煜陽光醫(yī)療器械有限公司
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年6月19日