用于食品和環(huán)境樣品中曲酸的熒光檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于食品和環(huán)境樣品中曲酸含量的熒光檢測(cè)方法，屬于熒光檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用蛋白質(zhì)包覆的銅納米團(tuán)簇作為熒光探針，曲酸作為熒光猝滅劑，同時(shí)也是被檢測(cè)物，具體包含以下步驟：制備銅納米團(tuán)簇?zé)晒馓结?；配置一系列濃度的曲酸?biāo)準(zhǔn)溶液；測(cè)定曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和銅納米團(tuán)簇反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；測(cè)定待測(cè)樣品和銅納米團(tuán)簇反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度相對(duì)變化值，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)樣品中曲酸的含量。與現(xiàn)有曲酸檢測(cè)方法相比，本發(fā)明提供的曲酸熒光分析法具有響應(yīng)快速、操作簡便、成本低廉和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，由于該方法的高選擇性，在對(duì)食品和環(huán)境樣品中的曲酸進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，不需要復(fù)雜樣品預(yù)處理過程。
【專利說明】用于食品和環(huán)境樣品中曲酸的熒光檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于食品和環(huán)境樣品中曲酸含量的熒光檢測(cè)方法，屬于熒光分析檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]曲酸，5-羥基-2-羥甲基-吡喃-4-酮，是大多數(shù)曲霉屬和青霉屬真菌所產(chǎn)生的一種常見的弱酸性有機(jī)物。在食品工業(yè)中，由于具有抑制化學(xué)和微生物降解的作用，曲酸一般被用作食品添加劑和保鮮劑而得到普遍使用。然而，研究表明曲酸具有致癌性、致畸性和遺傳毒性等潛在危害。鑒于上述原因，以曲酸為檢測(cè)目標(biāo)，建立準(zhǔn)確、迅速、靈敏的分析檢測(cè)方法具有重要意義。
[0003]目前曲酸的檢測(cè)方法主要有沉淀法、比色法、液相色譜法和電化學(xué)方法。這些檢測(cè)法各有優(yōu)缺點(diǎn)，例如沉淀法和比色法，雖然比較直觀，但選擇性和靈敏度較差。液相色譜法具有高分離效率和高靈敏度，但操作耗時(shí)繁瑣。電化學(xué)分析法操作簡便，靈敏度高，但穩(wěn)定性差。光譜分析法是常用的靈敏、快速、準(zhǔn)確的現(xiàn)代儀器分析方法之一。其中，熒光分析法由于靈敏度高、選擇性好、操作簡便快捷等特點(diǎn)而具有明顯的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，在環(huán)境監(jiān)測(cè)和食品安全等領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注。同時(shí)，新型的熒光納米材料滲透融合到分析科學(xué)中，極大地促進(jìn)了熒光分析檢測(cè)方法的發(fā)展。金屬納米團(tuán)簇作為一種新型熒光納米材料，具有生物相容性好、光穩(wěn)定性強(qiáng)、斯托克位移較大且在所有相關(guān)時(shí)間尺度上無閃爍等特點(diǎn)，大大改善了其作為熒光探針的性能，顯著提升了現(xiàn)有分析方法的靈敏度。然而，目前還沒有任何將熒光分析用于曲酸檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。
[0004]因此，基于金屬納米團(tuán)簇優(yōu)異的熒光特性，將熒光分析和納米技術(shù)相結(jié)合，建立針對(duì)曲酸的高靈敏、快速、低成本的熒光檢測(cè)方法，對(duì)于當(dāng)前食品質(zhì)量檢測(cè)和環(huán)境水樣監(jiān)測(cè)等工作具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種簡單、快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏和高選擇性的檢測(cè)食品和環(huán)境樣品中曲酸的熒光方法。
[0006]本發(fā)明的原理是:本發(fā)明使用蛋白質(zhì)包覆的銅納米團(tuán)簇作為熒光發(fā)光物質(zhì)，曲酸作為被檢測(cè)物，同時(shí)也是熒光猝滅劑。本發(fā)明通過曲酸對(duì)銅納米團(tuán)簇的特異性熒光猝滅作用實(shí)現(xiàn)對(duì)曲酸的檢測(cè)。
[0007]如上所述銅納米團(tuán)簇，其特征在于，所述銅納米團(tuán)簇中銅元素的存在形式為零價(jià)和二價(jià)并存，并能在不同波長的光的激發(fā)下發(fā)射同一波段的突光。
[0008]所述不同波長的光包括紫外光和可見光。
[0009]該方法包括如下具體步驟:
[0010](I)制備銅納米團(tuán)簇?zé)晒馓结槪?br> [0011](2)配置一系列濃度的曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；[0012](3)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線:測(cè)定步驟(2)中曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和銅納米團(tuán)簇反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度，根據(jù)曲酸濃度和熒光強(qiáng)度相對(duì)變化值之間的關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0013](4)定量檢測(cè):測(cè)定待測(cè)樣品和銅納米團(tuán)簇反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度變化，對(duì)比步驟
(3)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)樣品中曲酸的含量。
[0014]在步驟(I)中，所述銅納米團(tuán)簇?zé)晒馓结樀闹苽溥^程包括如下步驟:按二價(jià)銅離子和蛋白質(zhì)摩爾比為0.25?0.35:1，以及按每升水中10?50毫摩爾蛋白質(zhì)計(jì)，將二價(jià)銅離子和蛋白質(zhì)加入水中，得到混合溶液?；旌先芤涸跍囟葹?0?30°C及轉(zhuǎn)速為80?200轉(zhuǎn)/分鐘下，經(jīng)攪拌2?3分鐘后，加入NaOH溶液將體系pH調(diào)為12?13?；旌先芤涸?0?65°C下攪拌8?10小時(shí)以完成反應(yīng)。將反應(yīng)后溶液置于4°C水溶液中透析36h以上，去除雜質(zhì)。
[0015]所述二價(jià)銅離子溶液優(yōu)先采用硫酸銅、硝酸銅或其它類似水溶性銅鹽；所述蛋白質(zhì)優(yōu)先采用牛血清白蛋白和溶菌酶；所述制備過程中二價(jià)銅離子和蛋白質(zhì)的摩爾比優(yōu)選
0.267:1。
[0016]在步驟(2)中，所述曲酸標(biāo)準(zhǔn)品的配置方法為:用10?100mmol/L(pHS6.0-8.0)的乙酸鹽緩沖液配制曲酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲(chǔ)備液，儲(chǔ)備液濃度為0.lmmol/L至10mmol/L，用乙酸鹽緩沖液將儲(chǔ)備液配置成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取不同濃度的曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與銅納米團(tuán)簇充分混合后進(jìn)行熒光測(cè)試。
[0017]在步驟(3)中，所述反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間最好為5?10分鐘，所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度最好為10?40°C ;
[0018]所述熒光強(qiáng)度的測(cè)量可以通過任意一款熒光光譜儀實(shí)現(xiàn)；
[0019]所述熒光強(qiáng)度相對(duì)變化值根據(jù)公式(Ftl-F) /F0X 100%計(jì)算得到，其中Ftl表示未加入曲酸時(shí)銅納米團(tuán)簇的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)表示加入曲酸后銅納米團(tuán)簇的熒光強(qiáng)度；所述熒光強(qiáng)度的測(cè)試條件如下:熒光發(fā)射波長為銅納米團(tuán)簇?zé)晒獍l(fā)射光譜的波峰，熒光激發(fā)波長為相應(yīng)激發(fā)光譜的波峰。
[0020]與現(xiàn)有檢測(cè)方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0021](I)本發(fā)明所述熒光發(fā)光物質(zhì)即銅納米團(tuán)簇，具有成本低廉、生物相容性好和熒光穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，且對(duì)曲酸有較好的選擇性和較高的靈敏度；
[0022](2)本發(fā)明建立的熒光分析法，能夠快速有效地檢測(cè)曲酸，提高了樣品檢測(cè)效率，縮短了樣品檢測(cè)時(shí)間，且操作簡便快捷；
[0023](3)該方法能夠用于食品和環(huán)境樣品中曲酸的檢測(cè)，能夠免除繁瑣的樣品預(yù)處理過程，使檢測(cè)更加經(jīng)濟(jì)、簡便。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為本發(fā)明所述銅納米團(tuán)簇與不同濃度曲酸反應(yīng)后的熒光發(fā)射光譜圖。
[0025]圖2為本發(fā)明所述熒光檢測(cè)方法測(cè)定曲酸的檢測(cè)限和線性范圍。
【具體實(shí)施方式】
[0026]實(shí)施例1
[0027](I)制備銅納米團(tuán)簇?zé)晒馓结?將lmL20mM硫酸銅溶液加入到5mL15mM牛血清白蛋白水溶液中?；旌先芤涸?5°C及轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘下，經(jīng)攪拌2?3分鐘后，加入NaOH溶液使體系pH為12。混合溶液在55°C下攪拌8小時(shí)以完成反應(yīng)。將反應(yīng)后溶液置于4°C水溶液中透析36h,去除雜質(zhì),用20mmol/L(pH=7.0)的乙酸鹽緩沖液將透析所得銅納米團(tuán)簇稀釋10倍；
[0028](2)配置曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:用20mmol/L(pH=7.0)的乙酸鹽緩沖液配制曲酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲(chǔ)備液，儲(chǔ)備液濃度為0.lmmol/L至lOmmol/L，用乙酸鹽緩沖液將儲(chǔ)備液配置成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液；
[0029](3)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線:將步驟(2)所得曲酸標(biāo)準(zhǔn)品和銅納米團(tuán)簇充分混合，在25°C下反應(yīng)5分鐘后測(cè)定體系在反應(yīng)前的熒光強(qiáng)度Ftl和反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度F，由公式(Fq-FVFci X 100%計(jì)算熒光強(qiáng)度相對(duì)變化值，根據(jù)曲酸濃度與熒光強(qiáng)度相對(duì)變化值之間的關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1和圖2。
[0030](4)定量檢測(cè):取醬油lmL，用20mmol/L (ρΗ=7.0)的乙酸鹽緩沖液將其分別稀釋10倍，離心后過濾，取上清液作為待測(cè)樣品。測(cè)定待測(cè)樣品和銅納米團(tuán)簇反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度相對(duì)變化值，對(duì)比步驟(3)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)樣品中曲酸的含量。
[0031]實(shí)施例2
[0032](I)制備銅納米團(tuán)簇?zé)晒馓结?將lmL20mM乙酸銅溶液加入到5mL15mM溶菌酶水溶液中?；旌先芤涸?5°C及轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘下，經(jīng)攪拌2?3分鐘后，加入NaOH溶液使體系pH為13?；旌先芤涸?5°C下攪拌8小時(shí)以完成反應(yīng)。將反應(yīng)后溶液置于4°C水溶液中透析36h,去除雜質(zhì),用50mmol/L(pH=7.0)的乙酸鹽緩沖液將透析所得銅納米團(tuán)簇稀釋10倍；
[0033](2)配置曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:用50mmol/L(pH=7.0)的乙酸鹽緩沖液配制曲酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲(chǔ)備液，儲(chǔ)備液濃度為0.lmmol/L至lOmmol/L，用乙酸鹽緩沖液將儲(chǔ)備液配置成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液；
[0034](3)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線:將步驟(2)所得曲酸標(biāo)準(zhǔn)品和銅納米團(tuán)簇充分混合，在25°C下反應(yīng)5分鐘后測(cè)定體系在反應(yīng)前的熒光強(qiáng)度Ftl和反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度F，由公式(Fq-FVFci X 100%計(jì)算熒光強(qiáng)度相對(duì)變化值，根據(jù)曲酸濃度與熒光強(qiáng)度相對(duì)變化值之間的關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見附圖1和2。
[0035](4)定量檢測(cè):取醋ImLj 50mmol/L (pH=7.0)的乙酸鹽緩沖液將其分別稀釋10倍，離心后過濾，取上清液作為待測(cè)樣品。測(cè)定待測(cè)樣品和銅納米團(tuán)簇反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度相對(duì)變化值，對(duì)比步驟(3)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)樣品中曲酸的含量。
[0036]本發(fā)明同樣適用于其它水溶性食品和環(huán)境水樣中曲酸的定性分析和定量檢測(cè)。上述內(nèi)容均在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于食品和環(huán)境樣品中曲酸的熒光檢測(cè)方法；其特征是使用蛋白質(zhì)包覆的銅納米團(tuán)簇作為熒光發(fā)光物質(zhì)，曲酸作為被檢測(cè)物，通過曲酸對(duì)銅納米團(tuán)簇的特異性熒光猝滅作用實(shí)現(xiàn)對(duì)曲酸的檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是包括如下步驟: (1)制備銅納米團(tuán)簇?zé)晒馓结槪? (2)配置一系列濃度的曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液； (3)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線:測(cè)定步驟(2)中曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和銅納米團(tuán)簇反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度相對(duì)變化值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線； (4)定量檢測(cè):測(cè)定待測(cè)樣品和銅納米團(tuán)簇反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度變化，對(duì)比步驟(3)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)樣品中曲酸的含量。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的步驟(I)中，所述銅納米團(tuán)簇?zé)晒馓结樀闹苽溥^程包括如下步驟:按二價(jià)銅離子和蛋白質(zhì)摩爾比為0.25?0.35:1，以及按每升水中10?50毫摩爾蛋白質(zhì)計(jì)，將二價(jià)銅離子和蛋白質(zhì)加入水中，得到混合溶液；混合溶液在溫度為10?30°C及轉(zhuǎn)速為80?200轉(zhuǎn)/分鐘下，經(jīng)攪拌2?3分鐘后，加入NaOH溶液將體系pH調(diào)為12?13 ;混合溶液在50?65°C下攪拌8?10小時(shí)以完成反應(yīng)；將反應(yīng)后溶液置于4°C水溶液中透析36h以上，去除雜質(zhì)。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是所述二價(jià)銅離子溶液采用硫酸銅、硝酸銅或其它類似水溶性銅鹽。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是所述所述蛋白質(zhì)采用牛血清白蛋白和溶菌酶。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征是所述制備過程中二價(jià)銅離子和蛋白質(zhì)的摩爾比為 0.267:1。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的步驟(2)中，所述曲酸標(biāo)準(zhǔn)品的配置方法為:用10?100mmol/L、pH為6.0-8.0的乙酸鹽緩沖液配制曲酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲(chǔ)備液，儲(chǔ)備液濃度為0.lmmol/L至10mmol/L，用乙酸鹽緩沖液將儲(chǔ)備液配置成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取不同濃度的曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與銅納米團(tuán)簇充分混合后進(jìn)行熒光測(cè)試。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的步驟(3)中，反應(yīng)時(shí)間為5?lOmin，反應(yīng)溫度為10?40°C。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述熒光強(qiáng)度的測(cè)量通過任意一款熒光光譜儀實(shí)現(xiàn)；熒光強(qiáng)度相對(duì)變化值根據(jù)公式(Fq-F)/FqX 100%計(jì)算得到，其中F。表示未加入曲酸時(shí)銅納米團(tuán)簇的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)表示加入曲酸后銅納米團(tuán)簇的熒光強(qiáng)度。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征是所述熒光強(qiáng)度的測(cè)試條件如下:熒光發(fā)射波長為銅納米團(tuán)簇?zé)晒獍l(fā)射光譜的波峰，熒光激發(fā)波長為相應(yīng)激發(fā)光譜的波峰。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103868899SQ201410068969
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月27日
【發(fā)明者】蘇榮欣, 高召, 齊崴, 何志敏 申請(qǐng)人:天津大學(xué)