一種檢測大腸桿菌的生物傳感器的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實(shí)用新型涉及傳感器技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測大腸桿菌的電化學(xué)傳感器。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，致病性大腸桿菌對生產(chǎn)發(fā)展的危害越來越嚴(yán)重。分析原因主要有以下幾 點(diǎn)：單純由致病性大腸桿菌所引起的原發(fā)病較少，并發(fā)、繼發(fā)的形式增多，間接增加了大 腸桿菌病的危害。大腸菌群分布較廣，在溫血?jiǎng)游锛S便和自然界廣泛存在。調(diào)查研究表明， 大腸菌群細(xì)菌多存在于溫血?jiǎng)游锛S便、人類經(jīng)?；顒?dòng)的場所以及有糞便污染的地方，人、畜 糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌為 主，而外界環(huán)境中則以大腸菌群其他型別較多。
[0003] 如果食品的菌落總數(shù)嚴(yán)重超標(biāo)，說明其產(chǎn)品的衛(wèi)生狀況達(dá)不到基本的衛(wèi)生要求， 將會破壞食品的營養(yǎng)成分，加速食品的腐敗變質(zhì)，使食品失去食用價(jià)值。消費(fèi)者食用微生物 超標(biāo)嚴(yán)重的食品，很容易患痢疾等腸道疾病，可能引起嘔吐、腹瀉等癥狀，危害人體健康安 全。而大腸菌群超標(biāo)，也同樣會引起腹瀉、腸胃感染等。
[0004] 檢測大腸桿菌的傳統(tǒng)方法主要有三種，分別是多管發(fā)酵法、濾膜法和平板計(jì)數(shù)法， 這些方法有儀器操作復(fù)雜，需要專業(yè)操作人員等缺點(diǎn)。
[0005] 滾環(huán)復(fù)制放大技術(shù)是借鑒自然界中環(huán)狀DNA分子滾環(huán)式的擴(kuò)增機(jī)制而發(fā)展起來 的一種核酸擴(kuò)增技術(shù)，這種擴(kuò)增形式能在同溫下對單鏈環(huán)狀DNA進(jìn)行相對無限單鏈擴(kuò)增， 不需要特定的熱循環(huán)儀，且每條鏈?zhǔn)褂?-2個(gè)引物就能實(shí)現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增，并具有快速、特異、 靈敏等特點(diǎn)，因而近年來在一些基因檢測技術(shù)的研究中被廣泛采用。由于滾環(huán)復(fù)制的模板 必須是封閉的單鏈環(huán)狀DNA，因而許多研究者將這一特性用于單核苷酸多態(tài)性檢測、基因表 達(dá)圖譜和病毒基因檢測等的研究中，還有一些實(shí)驗(yàn)直接將滾環(huán)的無限復(fù)制作為一種信號放 大系統(tǒng)，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出許多相關(guān)的技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有檢測方法中儀器操作復(fù)雜，需要專業(yè)操作人員的缺陷，本實(shí)用新型提供 了一種檢測大腸桿菌的電化學(xué)傳感器。
[0007] 本實(shí)用新型的技術(shù)方案如下：
[0008] -種檢測大腸桿菌的電化學(xué)傳感器，從內(nèi)到外依次為金電極、戊二醛-大腸桿菌 抗體層、牛血清白蛋白封閉層、大腸桿菌層和RCA產(chǎn)物層。
[0009] 所述的戊二醛-大腸桿菌抗體層厚度為120±10nm，牛血清白蛋白封閉層厚度為 100±10nm，RCA 產(chǎn)物層厚度為 55±10nm。
[0010] 所述的電化學(xué)傳感器，是通過如下步驟制備得到的：
[0011] 1.制備環(huán)狀掛鎖探針：
[0012] (1)取3 yL掛鎖探針9 u L連接探針于已滅菌的I 0 0 u L離心管內(nèi)，加入6 u I T 4 DNA連接酶緩沖溶液，50 μ L滅菌水，震蕩均勻，生料帶封閉；
[0013] (2)將此離心管放入95°C恒溫lOmin，37°C恒溫2h，使之雜交完全；
[0014] (3)加入2 μ LT4DNA連接酶，封口膜封口，16°C恒溫2h，是掛鎖探針連接完全后， 65°C恒溫20min使T4DNA連接酶變性；
[0015] (4)加入1 μ 1核酸外切酶I在37°C保溫Ih將連接探針?biāo)夂?0°C恒溫20min使 核酸外切酶I變性；
[0016] 2.金電極的預(yù)處理；
[0017] 3.配制2%的戊二醛溶液，以此溶液將大腸桿菌抗體交聯(lián)到電極表面，60min干 燥，用二次水和PBS沖洗電極除去未結(jié)合的抗體，得戊二醛-大腸桿菌抗體層；
[0018] 4.待用二次水沖洗幾次之后，在戊二醛-大腸桿菌抗體層后修飾牛血清白蛋白， 使牛血清白蛋白封閉未特異性結(jié)合的位點(diǎn)，得牛血清白蛋白封閉層；
[0019] 5.電極在PBS緩沖液中充分?jǐn)噭?dòng)清洗后，在大腸桿菌菌液中孵育，并用PBS緩沖液 沖，大腸桿菌由于和捕獲電極之間的特異性結(jié)合而結(jié)合到電極上得大腸桿菌層；
[0020] 6. PBS沖洗，在適配體-引物的PBS溶液中孵育，適配體通過與目標(biāo)物之間的 強(qiáng)識別能力，被修飾在電極表面，再在其上修飾步驟1所得環(huán)狀掛鎖探針，后加入到含 1 μ ldNTP、1 μ lphi29DNA聚合酶、1 μ IBSA的溶液中37°C孵育2h完成RCA反應(yīng)得RCA產(chǎn)物 層。
[0021] 所述的電化學(xué)傳感器，優(yōu)選RCA產(chǎn)物制備中掛鎖探針和適配體-引物物質(zhì)的量比 為 3:1〇
[0022] 所述的牛血清白蛋白的濃度為0. 1%。
[0023] 檢測時(shí)采用三電極系統(tǒng)，以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，修飾電極為 工作電極，以含對苯二酚和雙氧水的PBS為工作底液采用差分脈沖伏安法檢測，電位設(shè)置 為O到-0. 6 V，脈沖寬度0. 05V，脈沖寬度掃描為0. 06 S，進(jìn)行檢測。
[0024] 本實(shí)用新型的工作原理：
[0025] 本實(shí)用新型用到包括以下的DNA探針：
[0026] 1、掛鎖探針 5? -P- TMg^^g^^TTTTCCCAACCCGCCCTACCCTTTTTTTTTT CCCAACCCGCC CTACCCTTTTGTAACTGTTTCCTTC-?, ' ( SEQ ID NO ： 1)；
[0027] 2、連接探針 5' - rfr GTT JC-3'（ SEQ ID NO :2);
[0028] 3、話配體-引物：5'_ GCAATGGTACGGTACTTCCACTTAGGTCGAGGTTAGTTTGC TTGCTGGC GCATCCACTGAGCGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAATTTTTTTTTTTGCTAGAAGGAAACAGTTAC-3 ? ( SEQ ID NO ：3)；
[0029] 4、適配體 _ 血紅素適配體 GCAATGGTACGGTACTTCCACTTAGGTCGAGGTTAGTTTGC TTGCT GGCGCATCCACTGAGCGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAATTTTTTTTTTGG GTA GGG CGG GTT GGG( SEQ ID NO ：4)；
[0030] 實(shí)驗(yàn)中首先設(shè)計(jì)了掛鎖探針和連接探針，掛鎖探針5'磷酸化，以便和3'端結(jié)合成 環(huán)，掛鎖探針上含有可與連接探針互補(bǔ)配對的部分，即斜體部分，這是為了讓連接探針拉近 掛鎖探針的3'端和5'端以便成環(huán)，另外我們又對掛鎖探針進(jìn)行另一設(shè)計(jì)，即含有兩段血紅 素適配體的互補(bǔ)序列的單鏈DNA，即掛鎖探針的加粗部分，為避免其相互影響，我們在兩段 血紅素適配體間插入10個(gè)T，為避免斜體部分即與連接探針互補(bǔ)的部分對血紅素適配體互 補(bǔ)序列的影響，我們也引入無關(guān)序列T。我們還設(shè)計(jì)了適配體-引物探針，適配體即與大腸 桿菌特異性結(jié)合的DNA單鏈，引物是與成環(huán)后的環(huán)狀探針互補(bǔ)配對結(jié)合的部分，RCA反應(yīng)也 是基于此引物進(jìn)行的。為避免適配體和引物的相互影響，我們在他們之間引入無關(guān)序列T。 我們還設(shè)計(jì)了適配體-血紅素適配體探針主要是為了和RCA實(shí)驗(yàn)做對比。
[0031] 具體的實(shí)驗(yàn)是這樣進(jìn)行的，將連接探針與掛鎖探針混合，互補(bǔ)配對完全后加入T4 DNA連接酶，在酶和ATP的存在下將掛鎖探針3'端和5'端間的這個(gè)切口連接起來形成鎖式 拓?fù)洵h(huán)(環(huán)狀探針)。加入核酸外切酶I，核酸外切酶I可以水解單鏈，加入后可將連接探 針?biāo)舛挥绊懎h(huán)狀探針，將環(huán)狀探針放置備用。
[0032] 構(gòu)建傳感器時(shí)將抗體交聯(lián)到電極表面后，由BSA封閉未特異性結(jié)合的探針，此時(shí) 將電極在大腸桿菌菌液中孵育，由于大腸桿菌與抗體的特異性結(jié)合而被捕獲到電極上，修 飾預(yù)先設(shè)計(jì)適配體-引物鏈，適配體由于和大腸桿菌的特異性結(jié)合而被固定到電極上，修 飾環(huán)狀探針，環(huán)狀探針的雙下劃線部分與適配體-引物的雙下劃線部分是可以互補(bǔ)配對 的，可與之結(jié)合二修飾在電極上，在phi29 DNA聚合酶緩沖液、phi29 DNA聚合酶、dNTP的 作用下以適配體-引物探針以環(huán)狀探針環(huán)為模板進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制，形成多個(gè)與該環(huán)序列互補(bǔ) 的高分子量DNA，即RCA產(chǎn)物，該RCA產(chǎn)物的含豐富血紅素適配體，血紅素適配體在血紅素和 鉀離子的存在下形成G-四連體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的DNA具有類似辣根過氧化物酶（HRP)的功 能，即催化溶液中的雙氧水（H2O2)發(fā)生還原反應(yīng)，檢測H2O 2的電化學(xué)還原信號可對大腸桿菌 進(jìn)行定量。若大腸桿菌的濃度不同，那么捕獲的適配體-引物DNA鏈的量也不同，RCA產(chǎn)物 也不同，最后根據(jù)酶催化底液反應(yīng)的量的不同，產(chǎn)生的不同的電化學(xué)信號可以定量出大腸 桿菌的濃度。即被檢測物越多，固定的DNA酶的量也越多，催化產(chǎn)生的電信號也越強(qiáng)。
[0033] 本發(fā)明采用的滾環(huán)復(fù)制放大（RCA)這一反應(yīng)，在短時(shí)間內(nèi)形成了大量的血紅素的 適配體，在血紅素的存在下，該適配體表現(xiàn)出類辣根過氧化氫酶（HRP)的功能，即能催化HQ 與H2O2的氧化反應(yīng)，通過這一氧化反應(yīng)表征電化學(xué)信號。文章中對RCA的應(yīng)用是一大亮點(diǎn)， 使檢測更為靈敏同時(shí)對掛鎖探針完美設(shè)計(jì)，使得制備的傳感器靈敏度高，檢測速度快；檢測 E. coli的方法，操作簡單、快速、靈敏，便于現(xiàn)場檢測。
[0034] 本實(shí)用新型的有益效果：
[0035] 1、制作電極的工藝成本低，適用于產(chǎn)業(yè)化中價(jià)廉的要求。
[0036] 2、設(shè)計(jì)掛鎖探針，使用RCA技術(shù)使反應(yīng)中產(chǎn)生大量的具有類HRP酶功能的DNA序 列，廣生$父尚的酶功能。
[0037] 3、電極性能穩(wěn)定，重復(fù)性好，適用于食品安全中大腸桿菌的檢測和生物傳感器產(chǎn) 業(yè)化的實(shí)際應(yīng)用，實(shí)施例中檢驗(yàn)了其穩(wěn)定性；
[0038] 4、以金電極為固定載體固定抗體和RCA產(chǎn)物的夾心型電化學(xué)傳感系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)對 食品中大腸桿菌的快速在線檢測，發(fā)現(xiàn)該傳感器的檢測范圍為1.8X10-1. SXlO7Cfu mL1檢出限為I. 6X IOcfu mL、
【附圖說明】
[0039] 圖1為生物傳感器的橫截面的結(jié)構(gòu)示意圖，其